脐血干细胞移植治疗糖尿病下肢缺血的可行性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.01.014

摘要/Abstract

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文题释义：

脐血干细胞：具有特殊的生物学特性，其中含有大量的造血干细胞、丰富的间充质干细胞，CD34抗原是造血干细胞分离纯化的主要标记，脐血中CD34⁺细胞占有核细胞的比例与骨髓相似，高于外周血。脐血干细胞具有很强的增殖、分化及形成集落的能力，受到刺激进入细胞周期的速度及对各种造血刺激因子的反应能力均高于骨髓和外周血细胞，并且寿命更长。脐血免疫细胞发育相对不成熟，由于免疫原性较弱，脐血干细胞具有不易被排斥、能在体内长期存活的特征，也被称为免疫逃逸现象。

糖尿病大血管基本病变：糖尿病大血管病变最大的特点是病变分布与非糖尿病者不同，非糖尿病者大血管病变主要分布于近端动脉，如主动脉、髂动脉、浅表的股动脉和少量的远端动脉，而糖尿病者大血管病变则主要累及膝以下胫腓动脉。糖尿病大血管病变的另一重要特点是下肢血管动脉中膜钙化尤为突出，并与糖尿病大血管病变的分布特点(主要累及膝下)有关，动脉钙化以踝部最多，趾部较少，足的背部又较趾部为多。

背景：糖尿病下肢缺血患者病变大多会累及下肢远端小动脉，导致常规治疗方法难度增加。

目的：探讨脐血干细胞移植治疗糖尿病下肢缺血大鼠的效果和安全性。

方法：建立糖尿病下肢缺血大鼠模型，沿股动脉走向，在模型大鼠下肢选取5点，每点注射人脐带间充质干细胞悬液20 μL。移植后1，2，4周，检测经皮氧分压以及缺血部位血管密度和血管内皮生长因子水平，并记录不良反应发生情况。

结果与结论：移植后1，2，4周大鼠经皮氧分压以及缺血部位血管密度和血管内皮生长因子水平整体均呈现出不断上升的情况，与移植前比较差异均有显著性意义(P < 0.05)。移植后所有动物均未出现皮肤出血和皮炎以及局部红、肿、热、痛等炎症反应，相关脏器均未出现瘤样生长。结果表明脐血干细胞移植治疗糖尿病下肢缺血，可显著改善下肢缺血症状，且安全性高，具有一定的应用可行性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0003-3501-6427(邢琳)

关键词: 干细胞, 移植, 糖尿病, 下肢缺血, 脐血干细胞, 干细胞移植, 动物模型

Abstract:

BACKGROUND: Diabetic lower limb ischemia is prone to involve distal lower limb arteries, and a conventional treatment is often unable to obtain the ideal effect.
OBJECTIVE: To investigate the effect and safety of umbilical cord blood stem cell transplantation in the treatment of diabetic lower limb ischemia.
METHODS: A diabetic rat model of lower limb ischemia was established, and along the femoral artery, five points
were selected for injection of human umbilical cord mesenchymal stem cell suspension, 20 μL per point. At 1, 2, 4 weeks after transplantation, transcutaneous oxygen pressure, vascular density and vascular endothelial growth factor level in the ischemic region, and incidence of adverse reactions were recorded.
RESULTS AND CONCLUSION: At 1, 2 and 4 weeks after transplantation, the transcutaneous oxygen pressure, vascular density and vascular endothelial growth factor level in the ischemic region were found increasing, which were significantly different from those before transplantation (P < 0.05). At different time after transplantation, all animals had no inflammatory reactions such as skin bleeding and dermatitis, and local red, swelling, hot, pain, and had no tumor-like growth in organs. These findings indicate that umbilical cord blood stem cell transplantation can safely and significantly improve symptoms of diabetic lower limb ischemia, which has certain application feasibility.

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 5

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引言

材料方法

1.1 设计体外观察性细胞实验与随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2015年5至7月在郑州大学医学院干细胞研究中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 15只雄性SD大鼠，28-32周龄，体质量320-350 g，由广东医学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK(粤)2014-0006。实验相关内容均经新乡医学院附属中心医院伦理部门批准。

1.3.2 主要试剂与仪器 PBS(上海士锋生物科技有限公司)，低糖DMEM培养基(上海弘顺生物科技有限公司)，链脲佐菌素(苏州拜吉氏生物科技有限公司)，血糖仪(北京东方名龙科技有限公司)，水合氯醛(上海鼓臣生物技术有限公司)，经皮氧分压检测仪(南京云驰科技发展有限责任公司)，ELISA检测试剂盒(上海通蔚生物科技有限公司)，血管内皮生长因子免疫组化试剂盒(艾莱萨生物科技(上海)有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 人脐带间充质干细胞分离与培养脐带取自新乡医学院附属中心医院分娩的健康适龄产妇，均事先征得产妇及其家属知情同意。在超净工作台中利用止血钳将脐带标本夹出，置于添加青霉素、链霉素、DPBS的培养皿中，剪成15 cm左右长的片段，经DPBS冲洗，胰酶消化，然后用移液枪将细胞转移至离心管中，添加15倍体积DPBS进行离心，弃上清，再用DPBS平衡液清洗，收集细胞进行原代和传代培养。利用流式细胞仪对第3代细胞进行表型检测。

1.4.2 糖尿病下肢缺血模型建立大鼠禁食12 h之后腹腔注射链脲佐菌素(60 mg/kg)，注射7 d后剪尾采血用血糖仪检测血糖水平，如果血糖浓度在16.7 mmol/L以上，则视为糖尿病模型建立成功。建模成功后，腹腔注射水合氯醛麻醉，将动物置于无菌操作台上，保持仰卧位，妥善固定，常规消毒之后自腹股沟韧带至膝关节作纵行切口，依次分离皮下组织，利用外科手术缝线结扎大隐动脉、静脉中端，结扎完毕后离断，关闭切口并进行缝合，术后常规喂食、喂水。

1.4.3 人脐带间充质干细胞移植治疗模型制备后第2天，沿股动脉走向，在模型大鼠下肢选取5点，分别注射人脐带间充质干细胞悬液(细胞浓度5×10⁸ L^-¹)，每点20 μL，一共100 μL。

1.4.4 经皮氧分压检测移植后1，2，4周，分别取5只大鼠，常规麻醉后进行左侧足背备皮，妥善固定经皮氧分压检测仪探头，使探头与大鼠足部皮肤紧密贴合，严格按照操作要求检测经皮氧分压，检测30 min，记录稳定数值。

1.4.5 免疫组化法检测血管密度经皮氧分压检测结束之后将大鼠脱颈处死，获得缺血下肢组织标本，采用免疫组化法检测血管密度。对标本进行石蜡包埋，制备切片，厚度为4 μm。经过抗原修复、H₂O₂孵育、PBS洗涤，添加山羊血清孵育10 min，添加兔抗大鼠因子相关抗原孵育过夜，添加山羊抗兔抗体(生物素标记)和链霉卵白素工作液(辣根过氧化物酶标记)，DAB显色后用自来水冲洗，苏木精复染，置于光镜下观察，计算血管密度。

1.4.6 血管内皮生长因子水平检测获得缺血下肢组织标本，剪碎后加入PBS，研磨成浆，离心后收集上清，严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作，检测血管内皮生长因子水平。

1.5 主要观察指标 ①人脐带间充质干细胞移植后1，2，4周左侧足经皮氧分压、缺血下肢组织血管内皮生长因子水平、毛细血管密度。②不良反应发生情况。

1.6 统计学分析使用SPSS 19.0软件进行处理分析，各项数据两两比较采用t 检验， P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

下肢缺血是糖尿病的常见并发症^[8]，患者下肢血管内皮功能发生不同程度的障碍^[9-11]。临床治疗糖尿病下肢缺血的方法主要有下肢动脉介入治疗和下肢动脉旁路移植治疗等，以达到促进溃疡愈合和缓解疼痛等效果^[12-15]。但部分患者存在下肢远端动脉流出道不良等情况，无法接受常规介入治疗和动脉旁路移植治疗，或者临床疗效不佳，需要面临截肢的危险^[16]。糖尿病下肢缺血患者病变大多会累及下肢远端小动脉，导致临床治疗难度进一步增加。

干细胞具有高度定向分化能力，可促进新生血管形成，达到改善下肢供血，保全患病肢体的目的^[17-23]。干细胞能分化为血管内皮细胞，改善患者下肢的血液循环^[24-26]。干细胞在治疗糖尿病及其并发症方面显示出了传统药物无法比拟的优势^[27-30]。干细胞体外培养可以诱导分化为胰岛素分泌细胞，在胰岛微环境下，促进血管形成。目前仅骨髓干细胞、脐血干细胞为伦理学接受，被国家定为第3类医疗技术，经审批可在临床应用。

脐血干细胞在一定环境条件下可诱导分化成各种组织细胞，代替损伤或者衰退的细胞，对缺血肢体内的新生血管形成产生积极的促进作用，改善肢体血流，获得良好的治疗效果^[31-32]。李翠芳等^[33]将100例2型糖尿病下肢血管病变患者分为两组，分别予以脐血干细胞移植治疗和生理盐水输注治疗。术后通过检测和分析发现，脐血干细胞移植患者的餐后2 h胰岛素和空腹胰岛素水平均得到显著改善，血管内皮舒张功能显著提高，另外还可以有效促进侧支循环，避免出现糖尿病足，是一种有效的治疗方案。

实验利用脐血干细胞治疗糖尿病下肢缺血模型大鼠，移植后不同时间点检测血管内皮生长因子水平、毛细血管密度、经皮氧分压水平，为临床治疗提供更多的参考依据。经皮氧分压是血管疾病评估金标准之一，可以十分客观直观的反映出血管向组织供氧的实际情况，实现对肢体缺血情况的定量评估，且操作简单，安全无创^[34]。毛细血管密度可以反映出血管缺血状态，杨耀国^[35]建立BALB/C裸鼠糖尿病下肢缺血模型，给予脐血干细胞移植治疗，经检测发现缺血局部的血管密度显著增加，表明血管密度可以作为下肢缺血的重要观察指标。血管生长因子是以同源二聚体形式存在的糖蛋白，对血管的生成以及新生血管的发生均具有重要的调节作用。移植后1，2，4周血管内皮生长因子水平、毛细血管密度、经皮氧分压水平整体均呈现出不断上升的情况，与移植前比较差异均有显著性意义(P < 0.05)。分析出现上述结果的原因，可能是因为脐血干细胞可以表达、合成并分泌诸多具有较强生物活性的因子，对缺血部位新生血管的形成产生十分积极的促进作用。

干细胞移植治疗过程中的安全性也是一个需要重视的问题，包括免疫排斥以及肿瘤生长^[36-37]。干细胞移植后，可能会在移植部位发生分化，并出现肿瘤样生长现象，影响治疗效果^[38]。研究结果显示所有动物均未出现皮肤出血和皮炎以及局部红、肿、热、痛等炎症反应，肝脏和心脏等脏器均未出现瘤样生长。

综上所述，脐血干细胞移植治疗糖尿病下肢缺血大鼠模型可以获得理想的效果，且安全性高，应用前景广阔，可以为各种肢体缺血性疾病提供新的治疗策略，扩展了干细胞移植治疗的应用范围。