钛微粒诱导破骨细胞活化中信号素7A siRNA的抑制作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.52.004

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (52): 8384-8390.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.52.004

• 组织工程骨及软骨材料 tissue-engineered bone and cartilage materials • 上一篇下一篇

钛微粒诱导破骨细胞活化中信号素7A siRNA的抑制作用

丛宇，茹江英，赵云龙，俞磊，包倪荣，许斌，赵建宁

解放军第二军医大学，解放军南京军区南京总医院(解放军第二军医大学南京临床学院)骨科，解放军南京军区骨科研究所，江苏省南京市 210002

收稿日期:2015-11-04 出版日期:2015-12-17 发布日期:2015-12-17
通讯作者: 赵建宁，教授，博士生导师，解放军第二军医大学南京临床学院(解放军南京军区南京总医院骨科)，江苏省南京市210002
作者简介:丛宇，男，江苏省如东市人，汉族，解放军第二军医大学在读博士，主要从事关节骨科、脊柱骨科的研究。
基金资助:
南京军区医药卫生科研基金面上项目(14MS112)；江苏省临床医学科技专项资助(BL2012002)

Inhibitory effect of Sema7A siRNA on osteoclast activation induced by titanium particles

Cong Yu, Ru Jiang-ying, Zhao Yun-long, Yu Lei, Bao Ni-rong, Xu Bin, Zhao Jian-ning

Department of Orthopedics, Nanjing General Hospital of Nanjing Military Region of Chinese PLA (Nanjing Clinical Medical School Affiliated to the Second Military Medical University of Chinese PLA), Nanjing 210002, Jiangsu Province, China

Received:2015-11-04 Online:2015-12-17 Published:2015-12-17
Contact: Zhao Jian-ning, Professor, Doctoral supervisor, Department of Orthopedics, Nanjing General Hospital of Nanjing Military Region of Chinese PLA (Nanjing Clinical Medical School Affiliated to the Second Military Medical University of Chinese PLA), Nanjing 210002, Jiangsu Province, China
About author:Cong Yu, Studying for doctorate, Department of Orthopedics, Nanjing General Hospital of Nanjing Military Region of Chinese PLA (Nanjing Clinical Medical School Affiliated to the Second Military Medical University of Chinese PLA), Nanjing 210002, Jiangsu Province, China
Supported by:
Nanjing Military Medical Scientific Research Program of China, No. 14MS112; the Clinical Medicine Science and Technology Program of Jiangsu Province, China, No. BL2012002

摘要/Abstract

摘要：

背景：信号素7A是一种细胞表面蛋白，可在促进破骨细胞融合的同时促进成骨细胞的迁移，影响骨的动态平衡。
目的：观察信号素7A siRNA对钛微粒诱导骨溶解过程中的破骨细胞活化是否具有抑制作用。
方法：将细胞浓度为4×109 L-1的前体破骨细胞接种于含玻璃盖玻片的96孔板上，分4组培养：空白对照组加入细胞培养液，阳性对照组加入未转染siRNA的上清液20 μL，实验组加入转染信号素7A siRNA的上清液20 μL，阴性对照组加入转染对照siRNA的上清液20 μL。上清液为钛合金微粒溶液与小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7共培养24 h的上清液，其中siRNA转染于小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7中。
结果与结论：培养7 d时，阳性对照组、阴性对照组、实验组炎症因子白细胞介素1、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶9、核因子κB受体活化因子水平高于空白对照组(P < 0.05)，实验组各因子水平低于阳性对照组、阴性对照组(P < 0.05)。培养8 d时，阳性对照组、阴性对照组、实验组破骨细胞增殖活性、抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性细胞数量高于空白对照组(P < 0.05)，实验组破骨细胞增殖活性、抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性细胞数量低于阳性对照组、阴性对照组(P < 0.05)。结果表明信号素7A siRNA对钛颗粒诱导的破骨细胞活化具有一定的抑制作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 信号素7A siRNA, RANK, MMP-9, 破骨细胞, 人工关节, 无菌性松动, 骨溶解

Abstract:

BACKGROUND: Sema7A is a kind of cell surface protein, which can promote the fusion of osteoclasts and the migration of osteoblast at the same time, affecting the dynamic balance of bone.
OBJECTIVE: To investigate whether Sema7A siRNA has ainhibitory effect on the osteoclast activation in the process of osteolysis which induced by titanium particles.
METHODS:The precursor osteoclasts with the concentration of 4×109/L were seeded on 96-well plates containing glass cover slips, and divided into four groups: blank control, positive control, experiment and negative control groups. The cell culture medium was added into the control group. 20 μL un-transfected siRNA supernatant was added into the positive control group. 20 μL transfected Sema7A siRNA supernatant was added into the experiment group. 20 μL transfected control siRNA supernatant was added into the negative control group. The supernatant was obtained through the co-culture between titanium particles solution and monocyte-macrophage cell line RAW264.7of mouse for 24 hours. siRNA was transfected into mononuclear macrophage cell lines RAW264.7 of mice.
RESULTS AND CONCLUSION: At 7 days of culture, the expression levels of interleukin-1, interleukin-1β, tumor necrosis factor α, matrix metalloproteinase-9 and the receptor activator of nuclear factor-κB in the positive control,
negative control and experiment groups were higher than those in the control group (P < 0.05). The expression level of each factor in the experiment group was lower than that in the positive control and negative control groups (P < 0.05). At 8 days of culture, the proliferation activity of osteoclasts and the number of positive cells stained by tartrate-resistant acid phosphatase in the positive control, negative control and experiment groups were higher than those in the control group (P < 0.05). The proliferation activity of osteoclasts and the number of positive cells stained by tartrate-resistant acid phosphatase in the experiment group were lower than those in the control and negative groups (P < 0.05). These results demonstrate that Sema7A siRNA has a certain inhibitory effect on the osteoclast activation induced by titanium particles.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

中图分类号:

R318

丛宇，茹江英，赵云龙，俞磊，包倪荣，许斌，赵建宁. 钛微粒诱导破骨细胞活化中信号素7A siRNA的抑制作用[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(52): 8384-8390.

Cong Yu, Ru Jiang-ying, Zhao Yun-long, Yu Lei, Bao Ni-rong, Xu Bin, Zhao Jian-ning. Inhibitory effect of Sema7A siRNA on osteoclast activation induced by titanium particles[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(52): 8384-8390.

图/表（结果） 6

2.1 Q-PCR检测白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α mRNA的表达设定空白对照组中白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α mRNA表达量为1，阳性对照组中白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α mRNA的表达量分别为12.32±0.91，7.53±0.68，9.32± 0.84；实验组中白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α mRNA的表达量为6.42±0.31，3.77±0.24，4.89±0.31；阴性对照组中白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α mRNA的表达量分别为12.15±0.84，7.29±0.73，9.10±0.51，见图1。阳性对照组各因子表达量均较空白对照组增高(P < 0.05)，这表明钛合金微粒显著上调白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α等炎症因子的基因转录水平；阳性对照组和阴性对照组各因子表达量比较差异均无显著性意义(P > 0.05)；实验组各因子表达量较阳性对照组下降(P < 0.05)，表明信号素7A siRNA可以下调各炎症因子的mRNA表达。

2.2 ELISA检测白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α蛋白水平各组白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α蛋白水平见表1，可以看到阳性对照组各炎症因子蛋白水平较空白对照组高(P < 0.05)，表明钛合金微粒诱导白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α等炎症因子水平上升；阳性对照组和阴性对照组各炎症因子蛋白水平比较差异均无显著性意义(P > 0.05)；实验组炎症因子蛋白水平较阳性对照组下降(P < 0.05)，表明信号素7A siRNA可抑制钛合金微粒诱导的各炎症因子释放。

2.3 Western-blot检测基质金属蛋白酶9、核因子κB受体活化因子蛋白水平空白对照组仅观察到少量基质金属蛋白酶9、核因子κB受体活化因子蛋白表达，阳性对照组可观察到大量基质金属蛋白酶9、核因子κB受体活化因子蛋白表达，实验组基质金属蛋白酶9、核因子κB受体活化因子蛋白水平表达较阳性对照组显著减少，阴性对照组和阳性对照组基质金属蛋白酶9、核因子κB受体活化因子蛋白表达相当，见图2。

2.4 免疫组织化学实验结果与空白对照组相比，阳性对照组、阴性对照组基质金属蛋白酶9、核因子κB受体活化因子阳性细胞数量增多(P < 0.05)；与阳性对照组、阴性对照组相比，实验组基质金属蛋白酶9、核因子κB受体活化因子阳性细胞数量降低(P < 0.05)，见表2，图3。

2.5 各组破骨细胞增殖阳性对照组、阴性对照组、实验组不同时间点的A值高于空白对照组(P < 0.05)，阳性对照组与阴性对照组比较差异无显著性意义，但均高于实验组(P < 0.05)，见表3。

2.6 各组破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶染色空白对照组培养第3，5，8天时均未见抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞；阳性对照组和阴性对照组在培养第3，5，8天时均可见前体破骨细胞变大，有伪足伸出，抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性细胞呈酒红色，在第5天时破骨细胞融合达到峰值；实验组不同时间点的抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性细胞较阳性对照组、阴性对照组显著减少，见表4，图4。

参考文献

[1] Kurtz S,Ong K,Lau E,et al.Projections of primary and revision hip and knee arthroplasty in the United States from 2005 to 2030.J Bone Joint Surg Am.2007; 89(4):780-785.
[2] Deirmengian GK,Zmistowski B,O'Neil JT,et al.Management of acetabular bone loss in revision total hip arthroplasty.J Bone Joint Surg Am.2011;93(19):1842-1852.
[3] Garcia-Cimbrelo E,Garcia-Rey E,Cruz-Pardos A.The extent of the bone defect affects the outcome of femoral reconstruction in revision surgery with impacted bone grafting: a five- to 17-year follow-up study.J Bone Joint Surg Br.2011; 93(11):1457-1464.
[4] Cordova LA,Stresing V,Gobin B,et al.Orthopaedic implant failure: aseptic implant loosening--the contribution and future challenges of mouse models in translational research.Clin Sci (Lond).2014;127(5):277-293.
[5] Sabokbar A,Kudo O,Athanasou NA.Two distinct cellular mechanisms of osteoclast formation and bone resorption in periprosthetic osteolysis.J Orthop Res.2003; 21(1):73-80.
[6] Gallo J,Slouf M,Goodman SB.The relationship of polyethylene wear to particle size, distribution, and number:A possible factor explaining the risk of osteolysis after hip arthroplasty.J Biomed Mater Res B Appl Biomater.2010;94(1): 171-177.
[7] Atkins GJ,Haynes DR,Howie DW,et al.Role of polyethylene particles in peri-prosthetic osteolysis: A review.World J Orthop. 2011;2(10):93-101.
[8] Konttinen YT,Pajarinen J.Adverse reactions to metal-on-metal implants.Nat Rev Rheumatol.2013;9(1):5-6.
[9] Hartmann A,Hannemann F,Lutzner J,et al.Metal ion concentrations in body fluids after implantation of hip replacements with metal-on-metal bearing--systematic review of clinical and epidemiological studies.PLOS ONE.2013; 8(8): e70359.
[10] Langton DJ,Sidaginamale RP,Joyce TJ,et al.The clinical implications of elevated blood metal ion concentrations in asymptomatic patients with MoM hip resurfacings: a cohort study.BMJ Open.2013;3(5):e001541corr1.
[11] Jongbloets BC,Ramakers GM,Pasterkamp RJ.Semaphorin7A and its receptors: pleiotropic regulators of immune cell function, bone homeostasis, and neural development.Semin Cell Dev Biol.2013;24(3):129-138.
[12] Holmes S,Downs AM,Fosberry A,et al.Sema7A is a potent monocyte stimulator. Scand J Immunol.2002;56(3):270-275.
[13] Delorme G,Saltel F,Bonnelye E,et al.Expression and function of semaphorin 7A in bone cells.Biol Cell.2005;97(7):589-597.
[14] Solarino G,Piazzolla A,Notarnicola A,et al.Long-term results of 32-mm alumina-on-alumina THA for avascular necrosis of the femoral head.J Orthop Traumatol. 2012;13(1): 21-27.
[15] Ulrich SD,Seyler TM,Bennett D,et al.Total hip arthroplasties: what are the reasons for revision.Int Orthop.2008;32(5): 597-604.
[16] Nathan C,Ding A.Nonresolving inflammation. Cell.2010; 140(6):871-882.
[17] Cooper HJ, Ranawat AS, Potter HG,et al.Early reactive synovitis and osteolysis after total hip arthroplasty. Clin Orthop Relat Res.2010;468(12):3278-3285.
[18] Maloney W,Rosenberg A.What is the outcome of treatment for osteolysis. J Am Acad Orthop Surg.2008;16 Suppl 1: S26-32.
[19] Harris WH.Conquest of a worldwide human disease: particle-induced periprosthetic osteolysis.Clin Orthop Relat Res.2004;(429):39-42.
[20] Ren PG,Irani A,Huang Z,et al.Continuous infusion of UHMWPE particles induces increased bone macrophages and osteolysis.Clin Orthop Relat Res.2011;469(1):113-122.
[21] Gallo J,Goodman SB,Konttinen YT,et al.Particle disease: biologic mechanisms of periprosthetic osteolysis in total hip arthroplasty.Innate Immun.2013;19(2):213-224.
[22] Zlotnik A,Burkhardt AM,Homey B.Homeostatic chemokine receptors and organ-specific metastasis. Nat Rev Immunol. 2011;11(9):597-606.
[23] Goodman SB,Ma T.Cellular chemotaxis induced by wear particles from joint replacements.Biomaterials. 2010;31(19): 5045-5050.
[24] Catelas I,Jacobs JJ.Biologic activity of wear particles.Instr Course Lect. 2010;59:3-16.
[25] Choi MG,Koh HS,Kluess D,et al.Effects of titanium particle size on osteoblast functions in vitro and in vivo.Proc Natl Acad Sci U S A.2005;102(12):4578-4583.
[26] Takei H,Pioletti DP,Kwon SY,et al.Combined effect of titanium particles and TNF-alpha on the production of IL-6 by osteoblast-like cells.J Biomed Mater Res. 2000; 52 (2):382-387.
[27] Kolodkin AL,Matthes DJ,Goodman CS.The semaphorin genes encode a family of transmembrane and secreted growth cone guidance molecules.Cell.1993;75(7):1389-1399.

引言

材料方法

1.1 设计体外细胞学随机对照实验。

1.2 时间及地点实验于2014年1月至2015年10月在解放军第二军医大学南京临床学院(南京军区总医院)骨科研究所完成。

1.3 材料

实验动物：清洁级8周龄雄性BALB/C小鼠，体质量 20 g，许可证号为SCXK(苏)2011-0003，由常州卡文斯实验动物有限公司提供。

实验用主要材料、细胞和试剂：成年雄性BALB/C小鼠RAW264.7细胞株，中科院上海细胞研究院细胞资源中心；Trizol提取液，美国invitrogen公司；抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色试剂盒，上海圆创生物科技有限公司；细胞裂解液(P0013)、α-MEM/FBS，碧云天生物工程有限公司；RT-PCR反转录试剂盒，Taq DNA聚合酶，立陶宛MBI公司(Fermentas)；DNA marker，Fermentas公司；苏木精、多聚甲醛，国药集团；DAB显色试剂盒，Roche公司；钛合金微粒，南京工业大学材料科学与工程学院；重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子，BD公司；内毒素检测试剂盒，厦门市鲎试剂有限公司；SYBR Green Real-time PCR Master Mix试剂盒，Toyobo公司；蛋白酶抑制剂Cocktail(1∶300)，Calbiochem，Germany。

1.4 方法

钛合金微粒溶液的制备：采用Kise-2008激光粒度分析仪复检钛合金微粒，结果显示所选微粒直径范围在 1.5-2.0 μm，将微粒用体积分数70%乙醇浸泡48 h后去除乙醇，再用无水乙醇浸泡，沉淀48 h后去除乙醇，干燥后用电子天平每20 mg分装，将微粒悬浮于250 ℃恒温箱中3 h。处理后根据商业检测试剂盒检测，微粒内毒素小于 0.25 EU/mL。将20 mg钛合金微粒加100 mL含体积分数20%小牛血清的1640培养液中配置好，4 ℃冰箱保存备用。

信号素7A siRNA的制备：靶向信号素7A基因的siRNA由上海吉玛公司合成。信号素7A的siRNA序列：5’-GCU AGA ACU UAU ACG AUG UUU-3’，对照siRNA序列：5’-UUC UCC GAA CGU GUC ACG U-3’。将siRNA按照INTERFERin(Illkirch，France)转染试剂说明书转染到RAW264.7细胞中，转染36-48 h后检测信号素7A的干扰效率。针对小鼠信号素7A设计了3对干扰siRNA(S1、S2、S3)，并设置了10，20，30 nmol/L不同浓度，干扰36 h后，使用定量PCR进行信号素7A mRNA表达水平的检测，发现S3 siRNA在20 nmol/L的条件下干扰效果最好，干扰效率达到78%；同时采用Western-blot检测了蛋白水平Sema7A的表达情况，证实了S3 siRNA的干扰效果，因此以下实验均使用S3 siRNA进行干扰。

上清液的获取：将转染与未转染siRNA的小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7接种于含体积分数10%胎牛血清的RPMl1640培养基中，37 ℃、体积分数5%CO₂饱和湿度培养箱中培养，每3 d换液1次，当细胞长至70%-80%单层融合时，进行0.25%乙二胺四乙酸-胰酶消化传代。取培养第三四代的细胞，洗涤3次，加入DMEM全培养液配制成细胞混悬液，在细胞计数后将细胞浓度调整至8×10⁵ L^-¹，细胞活力经锥虫蓝排除法检测后均大于95%。滴加细胞悬液至6孔培养板中，3 mL/孔，贴壁后加无血清RPMl1640培养基同步化 24 h。将0.2 g/L钛合金微粒溶液按100∶1与5×10⁷ L^-¹的单核巨噬细胞株RAW264.7在12孔板共培养24 h，获得上清液。

前体破骨细胞的培养：取雄性BALB/C小鼠，颈椎脱臼处死，无菌条件下分离胫骨，以PBS清洗，放置于α-MEM培养液中，用1 mL无菌注射器吸取培养液，注入到骨髓腔内反复冲洗，收集冲洗液，1 500 r/min离心5 min后收集细胞，用红细胞裂解液(0.02 mol/L Tris-NH₄Cl)将获得的细胞以4×10⁹ L^-¹的细胞浓度接种于培养瓶中，10 h后吸取未贴壁的细胞，以3×10⁷ L^-¹的细胞浓度稀释，加入20 µg/L的重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子，接种于进行实验所需的96孔培养板内。

实验分组：将细胞浓度为4×10⁹ L^-¹的前体破骨细胞接种于含玻璃盖玻片的96孔板上，分4组培养，每组18孔：空白对照组加入细胞培养液，阳性对照组加入未转染siRNA的上清液20 μL，实验组加入转染信号素7A siRNA的上清液20 μL，阴性对照组加入转染对照siRNA的上清液20 μL。4组最后都补充培养液α-MEM/胎牛血清至100 μL，培养7 d后进行各指标的检测。

1.5 主要观察指标

Q-PCR检测各组细胞中白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α mRNA表达水平：定量PCR使用SYBR Green Real-time PCR Master Mix试剂盒，在Roche Light Cycler 2.0荧光定量PCR仪上进行检测，熔链曲线显示产物均特异。用Light Cycler software 4.1处理数据，将目的基因Ct值用小鼠β-actin的Ct值进行标准化，样品扩增倍数变化的计算采用2^-^??t法。根据Livak等描述的方法将每组基因的mRNA值与相应参照基因比对后标准化。

ELISA检测白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α蛋白水平：用小鼠细胞因子ELISA试剂盒检测上清中细胞因子的释放情况，具体方法参见说明书。

Western-blot检测核因子κB受体活化因子、基质金属蛋白9蛋白表达水平：收集培养的细胞，在预冷的PBS中洗1次后，加入含有蛋白酶抑制剂Cocktail的细胞裂解液进行重悬，4 ℃振荡混匀裂解30 min，4 ℃ 12 000 r/min离心 10 min后收集上清，置于新EP管中，采用BCA法(Pierce)对蛋白样品进行定量：将蛋白样品用5×上样缓冲液(含 100 mmol/L Tris-HCl、200 mmol/L DTT、4%SDS、0.2%溴酚蓝、20%甘油，pH=6.8)混匀，在沸水中煮5 min，接着进行10%SDS-PAGE电泳。电泳程序采用100 V、20 min浓缩，200 V、70 min分离，随后用恒流300 mA、70 min于冰浴状态下，将聚丙烯酰胺中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，丽春红染色并标记大小及方向。随后将膜置于封闭液(含5%脱脂奶粉的TBST溶液或5%BSA)室温孵育1 h，将膜在TBST溶液中漂洗1 min，接着用滤纸吸干膜上残留水分，加上含有适当浓度的一抗溶液(稀释于含有5%脱脂奶粉或5%BSA的TBST中)，置于层析柜内摇床上4 ℃过夜。将膜放入TBST中洗3次，每次10 min，与稀释于TBST中的HRP标记二抗室温置于摇床上孵育1 h，TBST中洗3次，每次10 min，加化学发光底物进行显影检测。结果经吸光度面积积分分析，用与内参照β肌动蛋白产物条带的比值作为相对含量。

免疫组织化学SP法检测基质金属蛋白酶9、核因子κB受体活化因子蛋白表达：将细胞用胰酶消化后，用4.0- 5.0 mL完全培养基重悬或细胞浓度为(1-5)×10⁸ L^-¹；在灭菌的12孔板中铺上细胞爬片(圆片)，圆片间不要重叠；取细胞悬液滴到圆片上，30 min后在培养皿中补加完全培养液，放于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养6 h左右，让细胞贴壁更牢。取出培养皿，用PBS漂洗3次，每次2 min；40 g/L多聚甲醛处理(室温)60 min；PBS漂洗3次，每次 2 min；0.5% Txiton X-100室温处理20 min；PBS漂洗3次，每次2 min；体积分数3%H₂O₂室温处理15 min；PBS漂洗3次，每次2 min；5%BSA血清封闭，37 ℃ 30 min；取出，甩干封闭液(不漂洗)；一抗以PBS稀释(1∶200)，阴性对照用PBS代替一抗，37 ℃ 1.0-2.0 h或4 ℃过夜；PBS漂洗3次，每次2 min；二抗37 ℃孵育20 min；PBS漂洗3次，每次2 min；SABC湿盒内孵育37 ℃ 20 min；PBS漂洗3次，每次4 min；DAB试剂盒中的A、B、C三种试剂，在镜下观察显色情况。

MTT比色法检测细胞增殖情况：将前体破骨细胞以3×10⁴ L^-¹的细胞浓度接种于96孔板中，加入于α-MEM培养液，每孔体积100 μL，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中预培养24 h后，按实验分组继续培养3-8 d，每孔加入 110 μL无血清RPMI1640培养基配制的5 g/L MTT试剂，在37 ℃、体积分数5%CO₂条件下继续孵育4 h，弃上清后加入二甲基亚砜(150 μL/孔)振荡10 min，使结晶物充分融解。选择570 nm波长，酶联免疫监测仪上测定吸光度A值，检测各组破骨细胞的增殖活性。

破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶染色：①样品固着处理：取出待测的细胞载玻片，小心加上200 μL GENMED清理液(Reagent A)在载玻片上，铺满整个样品表面；小心移去载玻片上的GENMED清理液(Reagent A)；小心加上200 μL GENMED固着液(Reagent B)，铺满整个样品表面，室温下孵育2 min；小心移去载玻片上GENMED固着液(Reagent B)；小心加上200 μL GENMED清理液(Reagent A)，清洗样品表面；小心移去载玻片上的GENMED清理液(Reagent A)。②样品染色处理：小心加上200 μL GENMED染色工作液，铺满整个载玻片样品表面；在37 ℃恒温培养箱孵育15 min，或直至可见紫红色；小心移去载玻片上的GENMED染色工作液；室温下加200 μL GENMED清理液(Reagent A)，清洗样品表面；小心移去载玻片上的GENMED清理液(Reagent A)。③样品复染步骤：样品复染处理(甲基氯)，放上盖玻片或封固；即刻在一般光学显微镜下观察。光镜下观察含有2个细胞核以上染色阳性的多核巨细胞为破骨细胞。100倍光镜下任选10个视野，记录抗酒石酸酸性磷酸酶阳性破骨细胞平均数。

1.6 统计学分析数据结果以EMBED Equation.3表示，采用SPSS 17.0软件进行统计分析，组间抗酒石酸酸性磷酸酶阳性破骨细胞数量在ANOVA分析后进行配对t 检验(双侧)，多组间比较采用多因素方差分析，两组间比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

全髋关节置换是一种安全有效的用于治疗严重退化、创伤后及其他髋关节终末期疾病的方法。然而，随着全髋关节置换向更年轻更普遍的人群中扩展，翻修手术也因此增多^[14]。全髋关节置换失败的主要原因是伴有骨溶解的无菌性松动，其次是不稳定性及感染^[15-16]；后两者诊断发生在术后早期，而无菌性松动及骨溶解的发生会更晚些^{[2, 17]}。假体周围骨溶解指的是起初伴随着良好反应的置换后进行性骨吸收。重要的是，假体周围骨溶解在绝大部分病例中是早于无菌性松动的。不幸的是，很长一段时间该类患者并无临床症状^[2，18]，但骨的局部溶解依然会发展，最后发展为假体松动，需要进行风险较大的翻修手术^[2-3]。
骨代谢包括骨形成和骨吸收的动态平衡，涉及对成骨细胞、破骨细胞的精确调控过程。Harris[19]提出“微粒病”的概念，强调假体产生磨损微粒诱导宿主反应的重要性。
“微粒病”的概念是：非常小的假体磨损微粒刺激假体周围的各种细胞表达促炎性/促破骨性细胞因子和其他物质，来增加破骨细胞的活性，并抑制成骨细胞的成骨活性。磨损微粒扰乱了骨的动态平衡，结果在假体周围的骨吸收超过骨生成，导致骨溶解的发生，进而导致假体松动^[20-21]。这其中扰乱骨吸收的病理过程可以具体描述为：一定大小的磨损微粒(比如直径小于10 μm的钛微粒)可以被异物巨噬细胞吞噬，分泌多种炎性溶骨性介质及趋化因子^[22-24]，如肿瘤坏死因子α、前列腺素E2、白细胞介素1β、白细胞介素6、基质金属蛋白酶等。炎症因子趋化外周血中的前体破骨细胞向假体周围聚集，并向破骨细胞分化与活化，发挥溶骨效应，导致骨组织凋亡，引发骨溶解，最终诱发关节假体无菌性松动。其中钛颗粒并不能直接激活前体破骨细胞向破骨细胞转化，而是间接通过巨噬细胞、成纤维细胞发挥作用。还有研究指出1.5-5.0 μm而不是<1.5 μm的钛微粒对核因子κB受体活化因子mRNA和基质金属蛋白酶2，9的表达具有更明显的影响^[25-26]。
信号素家族最早是作为轴突导向分子而被发现^[27]，在病毒、线虫、果蝇、脊椎动物中普遍存在。目前发现信号素家族至少含有20个成员，不同种类的信号素蛋白又被分为8类，前两类是无脊椎动物信号素分子，包括信号素1A、信号素1B和信号素2A，3-7类是脊椎动物信号素分子，包括信号素3A-F、信号素4A-C、信号素5A-B、信号素6A-C和信号素7A；另一类是病毒属信号素8分子。信号素分布广泛，功能复杂，在许多不同组织里面表达，并且调节很多非神经系统的生理过程，信号素7A又称为CDw108，是一个通过GPI连接来关联的细胞表面蛋白[11]，其基因位于人类染色体15(25 kb)和小鼠染色体9b(22 kb)上。老鼠和人类信号素7A蛋白质由664和666个氨基酸组成，显示89.5%的序列一致性。Plexin C1和β1-Integrin是信号素7A的两个受体，研究表明信号素7A及其受体调节破骨细胞和成骨细胞分化，在骨的动态平衡中发挥了重要作用。
信号素7A在单核细胞/巨噬细胞激活中发挥关键作用，是一个强力的单核巨噬细胞活化剂[12]。在破骨细胞发育时，信号素7A、plexinC1和β1-integrin表达在分化过程开始时是很低的，但在不成熟破骨细胞融合期表达挺高。一项研究发现信号素7A基因的多态性与腰椎和股骨颈的骨密度相关。前期研究已发现在前体破骨细胞向破骨细胞分化期间，信号素7A mRNA在破骨细胞融合期(第5天)有一个峰值高表达，然后在成熟的破骨细胞中低表达，这表明信号素7A在破骨细胞融合过程中发挥作用。信号素7A可通过MAPK通路调节破骨细胞分化[12]。本实验中阳性对照组的PCR及ELISA结果表明，在钛颗粒刺激下，含有RAW264.7的上清液中白细胞介素1、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α等炎症因子明显增加，且与小鼠长骨分离出来的前体破骨细胞共培养后，抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性细胞活性及数量均增加，同时破骨细胞标志物的蛋白表达水平也明显增加，这些都验证了在人工关节置换后假体的钛磨损颗粒，刺激吞噬了磨损颗粒的成纤维细胞、滑膜细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、T 淋巴细胞等分泌多种炎性递质，炎症因子进一步趋化外周血中的单核巨噬细胞向假体周围聚集继而向破骨细胞分化这一理论。
而本实验在进行信号素7A siRNA干扰后，可观察到溶骨性炎症因子减少，而抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性的破骨细胞数量也相应减少，运用免疫组化的方法可以观察到破骨细胞标志活性水平降低，进而也间接说明了信号素7A siRNA可以使钛颗粒刺激后的破骨细胞减少。实验组中破骨细胞活性及数量在时间轴上的变化与信号素7A影响破骨细胞融合、成熟的时间变化轴相一致，第5天测出的各炎症因子在该组的整个时间段中有一个高表达峰值，而破骨细胞数量及其标志物也都达到了峰值，这与前期实验结果相符合，即信号素7A在第5天左右对破骨细胞的作用最强。引起假体无菌性松动的生物学机制现在仍不十分清楚，既往的研究都把焦点集中在磨损微粒诱导炎症反应继而导致的骨吸收上，因此相应解决人工假体无菌性松动的方法都是针对破骨细胞的信号通路，比如肿瘤坏死因子拮抗剂、环氧化酶抑制剂、核因子κB受体活化因子抑制剂、双膦酸盐类的药物治疗等。但现在越来越多的研究认为导致假体松动的骨溶解，是破骨细胞介导的骨吸收与成骨细胞介导的骨形成两者维持的平衡被打破，是两方面共同作用的结果，所以治疗方案也应从骨代谢平衡的两方面着手，而信号素7A及其受体促进破骨细胞融合和成骨细胞的迁移，在骨的动态平衡中发挥着重要作用。在本实验中通过体外细胞培养实验，利用基因干扰技术可以很明显地观察到抑制信号素7A的活性对磨损微粒诱导的炎症反应抑制明显，并且可抑制磨损微粒诱导的破骨细胞分化、增殖和成熟，这些结果提示信号素7A siRNA可以通过下调炎症因子的表达来抑制无菌性炎症反应，抑制破骨细胞的活性，达到抑制骨溶解的作用，这为临床上用生物技术靶向治疗磨损微粒诱导的骨溶解问题提供了一条可行的思路，下一步将从信号素7A影响成骨细胞迁移的一面着手，希望从另一个侧面来研究调控信号素7A的活性是否可以帮助解决磨损微粒引起的骨溶解问题。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

钛微粒诱导破骨细胞活化中信号素7A siRNA的抑制作用

Inhibitory effect of Sema7A siRNA on osteoclast activation induced by titanium particles

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 6

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	张宇, 田少奇, 曾国波, 胡川. 初次下肢全关节置换后发生心肌梗死的危险因素[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1340-1345.
[2]	李黎, 马力. 磁性壳聚糖微球固定化乳糖酶及其酶学性质[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 576-581.
[3]	王卫刚, 杨植栋, 冯宗权, 王鼎. 膝关节固定平台单髁假体置换的中期随访评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 368-373.
[4]	王秋霏, 顾叶, 彭育沁, 薛峰, 巨荣, 朱锋, 王熠军, 耿德春, 徐耀增. 人工假体磨损颗粒作用下Wnt/β-catenin信号通路对成骨细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(24): 3894-3901.
[5]	杨彩会, 刘启成, 董明, 王丽娜, 左美娜, 陆颖, 牛卫东. 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶促进慢性根尖周炎模型小鼠的骨破坏[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3654-3659.
[6]	刘鋆, 杨龙, 王伟宇, 周玉虎, 吴颖, 卢涛, 舒莉萍, 马敏先, 叶川. 聚3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯/聚乙二醇/氧化石墨烯组织工程支架的制备和性能评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3466-3472.
[7]	周安琪, 唐渝菲, 吴秉峰, 向琳. 骨膜组织工程设计：共性与个性的结合[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3551-3557.
[8]	霍花, 程余婷, 周倩, 齐昱晗, 伍超, 石前会, 杨童景, 廖健, 洪伟. 种植体表面药物涂层对骨结合的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3558-3564.
[9]	郎丽敏, 何生, 姜增誉, 胡奕奕, 张智星, 梁敏茜. 导电复合材料在心肌梗死组织工程治疗领域的应用进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3584-3590.
[10]	蒋昇源, 李丹, 姜建浩, 杨上游, 杨淑野. 假体无菌性松动过程中Co2+对成骨前体细胞的生物学反应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(21): 3292-3299.
[11]	李啸群, 徐凯航, 纪方. 补骨脂异黄酮抑制破骨细胞分化缓解小鼠去卵巢骨质疏松[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 186-190.
[12]	辛鹏飞, 柯梦楠 , 张海涛, 乌日莎娜, 李子祺, 庄至坤, 魏秋实, 何伟. 活血化瘀中药治疗股骨头坏死共同作用机制的网络药理学数据[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(17): 2727-2733.
[13]	张为, 崔帅帅, 周志超, 胡小华, 杨晓红. 微小RNA调控组蛋白去乙酰化酶治疗骨相关疾病的发展现状[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(17): 2767-2774.
[14]	解健, 苏俭生. 静电纺丝取向纳米纤维作为组织工程生物支架的优势与特征[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2575-2581.
[15]	纪琦, 喻正文, 张剑. 3D打印金属基生物材料工艺和临床应用的问题与趋势[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2597-2604.