不同剂量比淫羊藿苷与辛伐他汀对家兔桡骨骨折愈合的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.15.007

中国组织工程研究

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不同剂量比淫羊藿苷与辛伐他汀对家兔桡骨骨折愈合的影响

王惠平¹，何爱咏²，常晓飞³

1中南大学湘雅二医院手术室，湖南省长沙市 410011
2中南大学湘雅二医院骨一科，湖南省长沙市 410011
3长治医学院附属和平医院骨科，山西省长治市 046000

收稿日期:2012-11-03 修回日期:2012-12-03 出版日期:2013-04-09 发布日期:2013-04-09
通讯作者: 通讯作者：常晓飞，医师，硕士，长治医学院附属和平医院骨科，山西省长治市 046000 522160987@qq.com
作者简介:王惠平★，女，1977年生，湖南省长沙市人，2010年中南大学毕业，硕士，主管护师，主要从事手术室护理的研究。 cswanghuiping@163.com

Effect of icariin and simvastatin with different dosage ratios on rabbits’ radial fracture healing

Wang Hui-ping¹, He Ai-yong², Chang Xiao-fei³

1 Operative Room, the Second Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410011, Hunan Province, China
2 Department of Orthopedics, the Second Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410011, Hunan Province, China
3 Department of Orthopedics, the Peace Hospital of Changzhi Medical College, Changzhi 046000, Shanxi Province, China

Received:2012-11-03 Revised:2012-12-03 Online:2013-04-09 Published:2013-04-09
Contact: Corresponding author: Chang Xiao-fei, Master, Physician, Department of Orthopedics, the Peace Hospital of Changzhi Medical College, Changzhi 046000, Shanxi Province, China 522160987@qq.com
About author:Wang Hui-ping★, Master, Nurse in charge, Operative Room, the Second Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410011, Hunan Province, China cswanghuiping@163.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：淫羊藿苷与辛伐他汀单独或联合应用均可以促进骨折愈合，联合应用的最佳剂量比缺乏实验依据。
目的：观察不同剂量比淫羊藿苷与辛伐他汀对家兔骨折愈合的影响。
方法：将45只健康家兔建立双侧桡骨骨折模型，随机等分为模型组、骨形态发生蛋白2组和淫羊藿苷∶辛伐他汀3∶1，1∶1，1∶3组。模型组、骨形态发生蛋白2组给予生理盐水灌胃，淫羊藿苷∶辛伐他汀3∶1，1∶1，1∶3组给予淫羊藿苷溶液15 mL/(kg•d)和辛伐他汀溶液5 mL/(kg•d)，淫羊藿苷溶液 10 mL/(kg•d)和辛伐他汀溶液10 mL/(kg•d)，淫羊藿苷溶液5 mL/(kg•d)和辛伐他汀溶液15 mL/(kg•d)灌胃。模型组和淫羊藿苷:辛伐他汀3∶1，1∶1，1∶3组骨折局部注射生理盐水，骨形态发生蛋白2组骨折局部注射骨形态发生蛋白2溶液。灌胃连续6周，骨折局部注射连续2周。
结果与结论：在骨痂生长、改建和髓腔再通、骨密度和骨折部位组织形态方面，骨形态发生蛋白2、淫羊藿苷:辛伐他汀1∶1组最好，淫羊藿苷:辛伐他汀3∶1，1∶3组居中，模型组最差。提示不同剂量比淫羊藿苷和辛伐他汀联合应用均可促进家兔桡骨骨折愈合，当剂量比为1∶1时，促进作用更显著。

关键词: 组织构建, 骨组织构建, 组织构建与中医药, 桡骨骨折, 淫羊藿苷, 辛伐他汀, 骨形态发生蛋白2, 剂量比, 骨折愈合, 骨折二期愈合模型

Abstract:

BACKGROUND: Icariin and simvastatin alone or in combination can promote the radial fracture healing of rabbits. But the best dosage ratio is still lack of basis.
OBJECTIVE: To investigate the effect of icariin and simvastatin with different dosage ratios on rabbits’ radial fracture healing.
METHODS: Forty-five healthy rabbits were enrolled to prepare bilateral radial fracture models, and then randomly divided into five groups: model group; bone morphogenetic protein-2 control group; and three experimental groups (ratio of icariin and simvastatin: 3:1, 1:1, 1:3). Model and bone morphogenetic protein-2 control groups were given normal saline by gastric perfusion. The three experimental groups were given icariin and simvastatin solution with dosage ratios of 3:1, 1:1, 1:3 by gastric perfusion. Model group and three experimental groups were injected normal saline at fracture site, while bone morphogenetic protein-2 control group was injected bone morphogenetic protein-2 solution. Gastric perfusion was performed for 6 consecutive weeks and local injection at fracture site lasted for 2 weeks.
RESULTS AND CONCLUSION: Bone morphogenetic protein-2 control group and 1:1 experimental group were the best followed by the 3:1 and 1:3 experimental groups, and the model group was the worst in the following aspects: growth and alteration of callus, recanalization of bone marrow cavity, bone mineral density and morphology of the fracture site. Icariin and simvastatin with different dosage ratios all can promote the radial fracture healing of rabbits. When the dosage ratio is 1:1, the combination of icariin and simvastatin can further promote fracture healing.

Key words: tissue construction, bone tissue construction, tissue construction and traditional Chinese medicine, radial fractures, icariin, simvastatin, bone morphogenetic protein-2, dosage ratio, , fracture healing, fracture healing model at the second stage

中图分类号:

R318

王惠平，何爱咏，常晓飞. 不同剂量比淫羊藿苷与辛伐他汀对家兔桡骨骨折愈合的影响[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.15.007.

Wang Hui-ping, He Ai-yong, Chang Xiao-fei. Effect of icariin and simvastatin with different dosage ratios on rabbits’ radial fracture healing[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.15.007.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析各组家兔均能良好耐受麻醉和手术，手术进行顺利。术后呈微跛步态，1周左右恢
复正常步态。术后伤口无明显感染、化脓及坏死发生，2周左右完全愈合。术后饲养过程中，骨形态发生蛋白2组和淫羊藿苷∶辛伐他汀3∶1组分别于术后10 d和 12 d各死亡1只，立即予以补充，并顺延饲养时间。其余部分家兔出现腹泻症状，予以土霉素处理后，症状消失。

2.2 各组家兔大体观察结果
骨折后第2周：模型组家兔前肢骨折线清晰，骨折断端无明显骨痂生长，骨折断端可以完全活动；骨形态发生蛋白2组家兔前肢骨折线比较模糊，骨折断端有较多骨痂生长，骨折断端可以轻微活动；淫羊藿苷∶辛伐他汀3∶1组家兔前肢骨折线可见，骨折断端有少量骨痂生长，骨折断端可以活动；淫羊藿苷∶辛伐他汀1∶1组家兔前肢骨折线比较模糊，骨折断端有大量骨痂生长，数量最多，形态最大，基本将骨折断端周围完全包绕，骨折断端基本不能活动；淫羊藿苷:辛伐他汀1∶3组家兔前肢和淫羊藿苷:辛伐他汀3∶1组情况相似，骨折线可见，骨折断端有少量骨痂生长，骨折断端可以活动。

骨折后第4周：模型组家兔前肢骨折线仍可见，骨折断端有少量骨痂生长，骨皮质不连续；骨形态发生蛋白2组家兔前肢骨折线显著模糊，骨折断端有少量骨痂残留，骨皮质基本连续，表面欠光滑；淫羊藿苷∶辛伐他汀3∶1组家兔前肢骨折线比较模糊，骨折断端有较多骨痂生长，骨皮质欠连续，表面欠光滑；淫羊藿苷∶辛伐他汀1∶1组家兔前肢骨折线基本消失，骨折断端基本无骨痂残留，骨皮质基本连续，表面基本光滑；淫羊藿苷∶辛伐他汀1∶3组家兔前肢骨折线比较模糊，骨折断端有较多骨痂生长，骨皮质欠连续，表面欠光滑。

骨折后第8周：模型组家兔前肢骨折线比较模糊，骨折断端有大量骨痂生长，骨皮质欠连续，表面欠光滑；骨形态发生蛋白2组家兔前肢骨折线消失，骨折断端无骨痂残留，骨皮质连续，表面光滑；淫羊藿苷∶辛伐他汀3∶1组家兔前肢骨折线显著模糊，骨折断端残留少量骨痂，骨皮质基本连续，表面欠光滑；淫羊藿苷∶辛伐他汀1∶1组家兔前肢骨折线消失，骨折断端无骨痂残留，骨皮质连续，表面光滑；淫羊藿苷∶辛伐他汀1∶3组家兔前肢骨折线显著模糊，骨折断端残留少量骨痂，骨皮质欠连续，表面欠光滑。

综上所述，随着时间的推移，各组家兔前肢骨折处均逐渐愈合。在骨痂生长、改建和髓腔再通的时间方面，骨形态发生蛋白2、淫羊藿苷∶辛伐他汀1∶1组最早，淫羊藿苷∶辛伐他汀3∶1、淫羊藿苷∶辛伐他汀1∶3组居中，模型组最晚，且骨形态发生蛋白2与淫羊藿苷∶辛伐他汀组间差异无显著性意义。

2.3 各组家兔前肢骨折处X射线图像差异
骨折后第2周：模型组家兔前肢骨折线清晰，骨折断端无骨痂影；骨形态发生蛋白2组家兔前肢骨折线比较模糊，骨折断端有较大的骨痂影；淫羊藿苷∶辛伐他汀3∶1组家兔前肢骨折线可见，骨折断端有较小的骨痂影；淫羊藿苷∶辛伐他汀1∶1组家兔前肢骨折线比较模糊，骨折断端有较大的骨痂影，而且数量和密度均较骨形态发生蛋白2组稍高；淫羊藿苷∶辛伐他汀1∶3组家兔前肢折处X射线图像和淫羊藿苷∶辛伐他汀3∶1组情况相似，骨折线可见，骨折断端有较小骨痂影，见图1。

骨折后第4周：模型组家兔前肢骨折线仍可见，骨折断端有较小的骨痂影；骨形态发生蛋白2组家兔前肢骨折线显著模糊，骨折断端骨痂吸收，仅残留较小的骨痂影，骨髓腔未通；淫羊藿苷∶辛伐他汀3∶1组家兔前肢骨折线比较模糊，骨折断端有较大的骨痂影；淫羊藿苷∶辛伐他汀1∶1组家兔前肢骨折线显著模糊，骨折断端骨痂基本完全吸收，仅残留很小的骨痂影，但骨髓腔未通；淫羊藿苷∶辛伐他汀1∶3组家兔前肢骨折线比较模糊，骨折断端有较大的骨痂影，见图2。

骨折后第8周：模型组家兔前肢骨折线比较模糊，骨折断端有较大的骨痂影；骨形态发生蛋白2组家兔前肢
骨折线消失，骨折断端骨痂完全吸收，骨折处皮质骨骨密度接近正常皮质骨，骨髓腔通畅；淫羊藿苷∶辛伐他汀3∶1组家兔前肢骨折线显著模糊，骨折断端骨痂吸收，仅残留较小的骨痂影，骨髓腔未通；淫羊藿苷∶辛伐他汀1∶1组家兔前肢骨折线消失，骨折断端骨痂完全吸收，骨折处皮质骨骨密度接近正常皮质骨，骨髓腔通畅；淫羊藿苷∶辛伐他汀1∶3组家兔前肢骨折线显著模糊，骨折断端骨痂吸收，仅残留较小的骨痂影，骨髓腔未通，见图3。

综上所述，随着时间的推移，各组均表现出了骨折逐渐愈合的过程。在骨痂生长、改建和髓腔再通的时间方面，骨形态发生蛋白2、淫羊藿苷∶辛伐他汀1∶1组最早，淫羊藿苷∶辛伐他汀3∶1，1∶3组居中，模型组最晚。骨形态发生蛋白2与淫羊藿苷∶辛伐他汀1∶1，3∶1，1∶3组差异无显著性意义。

2.4 各组家兔前肢骨折处骨密度变化结果骨折后第2，4周时各组家兔前肢骨折处骨密度由大到小为骨形态发生蛋白2、淫羊藿苷∶辛伐他汀1∶1组>淫羊藿苷:辛伐他汀3∶1组、淫羊藿苷∶辛伐他汀1∶3组>模型组。骨折后第8周时各组家兔前肢骨折处骨密度由大到小为模型组>淫羊藿苷∶辛伐他汀3∶1、淫羊藿苷∶辛伐他汀1∶3组>骨形态发生蛋白2、淫羊藿苷∶辛伐他汀1∶1组。这与骨折后第8周时，骨形态发生蛋白2组和淫羊藿苷∶辛伐他汀1∶1组已完成骨痂改建，淫羊藿苷∶辛伐他汀3∶1组和淫羊藿苷∶辛伐他汀1∶3组仍处于骨痂改建中，而模型组仍处于骨痂形成中的情况相符，即骨密度在塑形期之前逐渐升高，塑形期之后逐渐降低，见表1。

2.5 各组家兔前肢骨折处生物力学变化骨折后第8周，各组家兔前肢骨折处最大抗载负荷由大到小为骨形态发生蛋白2、淫羊藿苷∶辛伐他汀1∶1组>淫羊藿苷∶辛伐他汀3∶1、淫羊藿苷∶辛伐他汀1∶3组>模型组，见表2。

2.6 各组家兔前肢骨折处组织形态变化
骨折后第2周：模型组家兔前肢骨折断端的髓腔内可见
少量红细胞，较多的纤维组织增生和较多的骨小梁形成；骨形态发生蛋白2组和淫羊藿苷∶辛伐他汀1∶1组家兔前肢骨折断端处可见成片的软骨组织增生和大量骨小梁形成，以及散在红细胞和少量坏死骨组织；淫羊藿苷:辛伐他汀3∶1和1∶3组家兔前肢骨折断端的髓腔内可见较多骨小梁形成和纤维组织增生，亦可见少量红细胞，见图4。

术后第4周：模型组家兔前肢骨折断端处可见较多的骨小梁形成，骨小梁的边缘处散在骨基质形成，其间可见少量小血管增生；骨形态发生蛋白2组和淫羊藿苷∶辛伐他汀1∶1组家兔前肢骨折断端处可见成片的软骨组织增生并逐渐向比较成熟的板层骨过渡；淫羊藿苷∶辛伐他汀3∶1和1∶3组家兔前肢骨折断端处均可见大量的骨小梁融合成片，较多骨基质形成，边缘有较多编织骨样成分形成，见图5。

术后第8周：模型组家兔前肢骨折断端处可见大片小梁的边缘有成片的骨基质形成；骨形态发生蛋白2组和淫羊藿苷∶辛伐他汀1∶1组家兔前肢骨折断端处均可见骨折部分已经被比较成熟的板层骨取代，骨的结构层次比较清楚；淫羊藿苷∶辛伐他汀3∶1和1∶3组家兔前肢骨折断端处均可见骨折部分己经被比较成熟的板层骨取代，但排列方向比较紊乱，见图6。

随着时间的推移，组织形态学检查结果显示各组家兔前肢骨折逐渐愈合；在胶原纤维、软骨组织和骨小梁以及骨基质的形成时间方面，骨形态发生蛋白2组和淫羊藿苷∶辛伐他汀1∶1组最早，淫羊藿苷:辛伐他汀3:1组和淫羊藿苷∶辛伐他汀1∶3组居中，模型组最晚，其中骨形态发生蛋白2组和淫羊藿苷∶辛伐他汀1∶1， 3∶1，1∶3组间差异无显著性意义。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：于2010年4月至2012年1月在中南大学湘雅三医院动物实验室完成。
材料：
实验动物：健康9周龄家兔45只，雌雄不限，体质量2.5-3.0 kg；清洁级，由中南大学湘雅三医院动物实验中心提供，并在其实验动物中心空调房饲养，分笼且标准喂养。实验前家兔精神饮食良好，奔跑自如。实验符合动物伦理学要求。
药物：淫羊藿苷的分子式为C33H40O15，相对分子质量为676.67，属8-异戊烯基黄酮醇苷类化合物,由南京泽朗医药科技有限公司提供，生产批号为ZL201202S，纯度>99%。100 mg淫羊藿苷粉末，加入到100 mL生理盐水中，制备成质量浓度为1 g/L的溶液。
辛伐他汀的分子式为C25H38O5，相对分子质量为418.57，由山西云鹏制药有限公司提供，生产许可证号为H20083593，纯度>99%。取100 mg辛伐他汀片，研磨至粉末状后，加入到100 mL生理盐水中，制备成质量浓度为1 g/L的溶液。
骨形态发生蛋白2由北京中科物源生物技术有限公司提供，纯度>99%。取100 µg重组人骨形态发生蛋白2冻干粉末，加入到40 mL生理盐水中，制备成质量浓度为2.5 mg/L的溶液。
方法：
家兔桡骨骨折模型的建立：健康家兔以3%戊巴比妥钠溶液按1 mL/kg经耳缘静脉麻醉，麻醉生效后，仰卧位将家兔除手术肢体外的其余肢体固定于手术台上，常规脱毛、消毒后，铺无菌手术单，取前肢中段外侧纵行切口，长约15 mm，依次切开皮肤、皮下组织，显露桡骨，于桡骨中下1/3交界处切开骨膜，用自制钢锯横行锯断，造成缺损3 mm的标准横形骨折[11]。予以生理盐水、庆大霉素反复冲洗后，逐层缝合，无菌敷料包扎。相同方法处理另一侧前肢。术后家兔分笼饲养，标准喂养，同时术后连续3 d予以青霉素40×104 U/d肌注，预防感染。
家兔分组：将45只家兔按体质量分层后以随机数字表法分为模型组、骨形态发生蛋白2组和淫羊藿苷∶辛伐他汀3∶1，1∶1，1∶3组，每组9只。
给药干预：各组家兔均在骨折局部注射生理盐水 0.5 mL。灌胃连续6周，骨折局部注射连续2周，于每晚20：00-21：00进行。
各组干预方法：
Interventional therapy:

骨痂生长情况：骨折后第2，4，8周时，通过德国Siemens X射线仪观察骨折线是否存在、骨折断端是否有骨痂影及大小、骨髓腔是否再通。
骨密度测定：X射线摄片后，将标本以侧位放置于美国Lunar公司双能X射线骨密度仪上，选取小物体扫描模式，对整个桡骨进行扫描，扫描方向与桡骨长轴平行。以骨折线为中心，仅对包括骨折线在内的上下各0.5 cm的骨质进行骨密度测定。
生物力学测定：术后第8周时，每组各取3只家兔即6个前肢标本，将其尺面向下置于美国Instron公司MTS3369生物力学测试机上，行三点弯曲实验，以骨折线为中心，跨距20 mm，加载速度为1.0 mm/min，直至标本断裂，测定最大抗载负荷。
组织形态学检查：骨折后第2，4，8周，将多聚甲醛溶液固定好的标本，生理盐水冲洗后，行苏木精-伊红染色，观察胶原纤维、骨小梁生长和软骨组织、骨基质的形成情况。
主要观察指标：骨折处骨痂生长情况、骨密度测定、生物力学测定及组织形态。
统计学分析：实验数据均以x(_)±s的形式表示，采用IBM SPSS 18.0统计软件包进行分析与处理。同一时间点5组间差异采用单因素方差分析，如差异具有显著性意义，进一步采用SNK-q检验比较每两组间差异是否具有显著性意义，规定P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨折愈合往往是一个相对缓慢的过程，临床上骨折的延迟愈合和不愈合并不少见。为了更快更好的促进骨折愈合，需要不断对骨折进行深入的研究。但是直接通过人体实验来进行具有很大的局限性，而动物实验有效的解决了这种局限性。目前常见的骨折动物模型有闭合骨折模型、开放骨折模型和基因骨折模型3种。3种方式各有利弊。实验采用的为家兔桡骨中下1/3交界处缺损 3 mm的横行骨折模型，属于开放骨折模型。相对于闭合骨折模型，具有以下优点：①骨折类型一致。②骨折部位一致。③由一人操作, 对软组织损伤程度及血肿程度可视为一致。同时在实验动物的选择上，家兔上下尺桡关节均融合，建立非承重骨即桡骨的横行骨折模型，不需进行任何内外固定，避免了其对实验结果的影响。
淫羊藿(Epimedii Folium)，又名仙灵脾，为小檗科淫羊藿属植物淫羊藿(Epimedium brevicornum Maxim)、箭叶淫羊藿(Epimedium Sagittatum Maxim)、柔毛淫羊藿(Epimedium pubescens Maxim)、巫山淫羊藿(Epimedium wushanense T.S.Ying)和朝鲜淫羊藿(Epimedium Koreanum Nakai)的干燥地上部分。味辛甘，性温，归肝、肾经。首见于《神农本草经》，历代本草中均有记载，李时珍在《本草纲目》中记载其有“益精气、坚筋骨、补腰膝、强心力”之功效。现代医学研究表明，淫羊藿除具有传统的补肾壮阳作用外，还具有改善心肌缺血、降低血压、抑制血栓形成、抗骨质疏松、促进造血、增强免疫力、抗衰老、抗肿瘤、抑制某些病毒和细菌生长的作用[12]。

淫羊藿属植物的化学成分主要为黄酮、木脂素、生物碱和多糖，此外还有挥发油、棕搁酸、硬脂酸、油酸、亚麻酸等。其主要的活性成分是黄酮类化合物，现在已有60余种黄酮类化合物被鉴定，主要有淫羊藿苷，朝藿定A，B，C和宝藿定Ⅰ等[13-15]。其中淫羊藿苷又为黄酮类化合物中的主要活性成分。淫羊藿总黄酮和淫羊藿苷作为药典规定的淫羊藿的质量控制标准，分别不低于15%和5%[16]。传统中医理论认为，肾主骨生髓。而淫羊藿作为传统的补肾中药，其对骨骼系统的作用越来越受到国内外骨科界的重视。

淫羊藿对于去卵巢、维A酸和激素等多种原因引起的大鼠骨质疏松均具有明显的预防及治疗作用[1-3]。Zhang等[4]对100名绝经后妇女进行了为期24个月的随机淫羊蕾及双盲安慰剂对照临床试验表明：淫羊霍源性雌激素类黄酮可以有效防止绝经后妇女骨质丢失，但未对子宫内膜造成显著影响。张昆[5]在182例糖尿病骨质疏松患者的治疗中，随机给予胰岛素+碳酸钙D3片或胰岛素+碳酸钙D3片+淫羊藿，通过对比观察发现，加用淫羊藿可以有效的治疗糖尿病骨质疏松。

淫羊藿预防和治疗骨质疏松主要是通过其活性成分淫羊藿苷促进成骨和抑制破骨来实现的。钱卫庆等[17]利用酶消化法从新生大鼠颅盖中分离和培养成骨细胞，经碱性磷酸酶和钙化结节染色法鉴定后，分别通过四甲基偶氮唑盐比色和碱性磷酸酶活性来检测不同浓度淫羊藿苷对成骨细胞增殖和分化的影响，结果表面，不同浓度淫羊藿苷均能促进大鼠成骨细胞增殖和分化，而且
以10 μg/L时作用最显著。李盛林等[18]通过类似的实验发现，淫羊藿提取液对小鼠成骨细胞的增殖和凋亡均没有明显作用，但却显著促进成骨细胞的分化。殷晓雪等[19]研究发现，不同浓度淫羊藿苷对于成骨细胞的增殖的作用不同，低剂量时无影响，中等剂量时促进，高剂量时抑制。翟远坤等[20]实验结果表明，淫羊藿苷呈剂量依赖性抑制成骨细胞的增殖，但是可以通过促进与成骨相关的转录因子Runx-2与Osterix mRNA 的表达，来促进成骨细胞的分化。

淫羊藿及其活性成分淫羊藿苷不仅对成骨细胞具有作用，而且对破骨细胞亦具有作用。淫羊藿苷呈剂量依赖性的抑制破骨细胞的分化和成熟破骨细胞的骨吸收功能[21]，同时能够促进破骨细胞的凋亡[22]。

间充质干细胞是来源于中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞。广泛存在于全身结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，为成骨细胞和破骨细胞的来源。陈克明等[23]和翟远坤等[24]分别通过不同浓度的淫羊藿苷和淫羊藿苷含药血清干预体外培养的骨髓间充质干细胞的增殖和成骨性分化后发现，淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞增殖无明显促进作用，甚至高浓度可以抑制其增殖，但是可以明显的促进其成骨性分化，可能是通过上调转化生长因子β1、骨形态发生蛋白2的表达来实现的[25]。但是张爱国等[26]通过类似实验研究发现，淫羊藿煎剂在高浓度时抑制骨髓间充质干细胞的增殖，但是其含药血清却可以促进骨髓间充质干细胞的增殖。

虽然淫羊藿及其活性成分淫羊藿苷对于骨质疏松的预防和治疗具有明显的促进作用，但是在细胞水平上，对成骨细胞、破骨细胞以及骨髓间充质干细胞的作用仍存在较大的争议。

作者所在课题组前期实验发现，骨折后第2，4周时，骨形态发生蛋白2组的家兔桡骨骨折愈合情况最好，淫羊藿煎剂实验组其次，模型组最差。但是骨折后第8周时，淫羊藿煎剂组的骨折愈合情况与骨形态发生蛋白2组差异已无显著性意义，而且二者均优于模型组，从而证实了淫羊藿对于骨折愈合具有促进作用[6-7]。

他汀类药物是3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的抑制剂，可以阻断细胞内羟甲戊酸的代谢，从而减少细胞内胆固醇的合成，进而反馈性刺激细胞膜表面(主要为肝细胞)低密度脂蛋白受体数量和活性增加，进而降低血清中胆固醇的含量，减少动脉粥样硬化的形成和心血管疾病的发病率及死亡率。自1976年第1个他汀类药物美伐他汀问世以来，他汀类药物就作为经典和有效的降脂药物而广泛应用于临床。随着研究的不断深入，他汀类药物的非降脂作用如抗炎、抑制肿瘤生长和转移、促进血管生成、减少淀粉样肽、抑制T淋巴细胞等作用越来越受到人们的重视[8]。1999年Mundy等[9]从3万多种化合物中研究发现，辛伐他汀可以增强骨形态发生蛋白2启动子活性，而在体和离体实验都证明骨形态发生蛋白2具有促进成骨细胞分化和诱导体外成骨的能力[27]，因此推测他汀类药物也可以促进成骨细胞分化和诱导成骨，并且从促进骨形态发生蛋白2 mRNA表达、小鼠颅顶骨皮下注射促进新骨形成和去势大鼠口服给药骨合成增加3方面进行了实验论证，均有明显的阳性结果。随后多项临床流行病学研究也发现，辛伐他汀可以明显提高绝经妇女和老年人的骨密度，降低骨折发生的比例[28-30]。

Maeda等[31]用辛伐他汀体外干扰前成骨细胞系(MC3T3-E1)，发现辛伐他汀呈时间-剂量依赖性的促进骨形态发生蛋白2的表达，同时促进Ⅰ型胶原及碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥素等的表达，从而诱导前成骨细胞向成骨细胞分化。杨允通过实验证实，辛伐他汀上述作用的机制之一为促进成骨细胞血管内皮生长因子的表达及骨内血管新生[32]。刘铭等[33]进一步证实，不同浓度的辛伐他汀对前成骨细胞系(MC3T3-E1)增殖无明显促进或抑制作用。但是不少研究发现，辛伐他汀对成骨细胞的增殖呈抑制作用，且这种作用随着辛伐他汀剂量的增加和作用时间的延长而逐渐增强[34-35]。

黄鲁豫等[36]在体外通过甲状旁腺素相关肽诱导小鼠的骨髓基质干细胞分化为破骨细胞，同时给予不同浓度的辛伐他汀干预，结果发现辛伐他汀可以显著的抑制破骨细胞的分化，而且呈剂量依赖性，同时破骨细胞骨吸收功能也被抑制。目前多数研究表明，他汀类在骨的改建过程中具有双向调节作用，即不仅仅对促进成骨，而且抑制破骨。姚淳等[37]在综述中认为，辛伐他汀促进成骨的作用机制为①促进骨形态发生蛋白2的表达。②扩增血管内皮生长因子。③上调碱性磷酸酶活性和骨钙素水平。④增加一氧化氮合成酶的合成。⑤调节丝裂原活化蛋白激酶途径。抑制破骨的作用机制为①影响核因
子κB信号通路。②刺激促分裂素原活化蛋白激酶B通路。③抑制了骨形态发生蛋白受体和smads信号机制中的人类破骨细胞前体细胞的分化。④抑制肿瘤坏死因子α诱导产生的潜在的富含半胱氨酸蛋白的炎症骨破坏因子61的分化。

但是学术界对于辛伐他汀促进成骨和抑制破骨的作用仍然存在较大的争议。Maritz等[38]通过实验发现，高剂量10 mg/(kg•d)的辛伐他汀促进成骨的，而且对于骨吸收也具有促进作用。Yao等[39]在对去卵巢大鼠行不同剂量辛伐他汀干预后发现，辛伐他汀不能阻止去卵巢大鼠松质骨骨量的丢失，也不能促进松质骨和密质骨的骨形成。Stechow等[40]给予去卵巢小鼠口服辛伐他汀8周后发现，辛伐他汀既不能促进股骨皮质骨和骨小梁的形成，也不能增强血清中骨钙素的水平。

虽然存在上述争议，但是辛伐他汀对于骨折愈合具有确切的促进作用。2007年印度学者Saraf等[41]证实辛伐他汀可明显加快家兔股骨骨折早期愈合速度。王建卫等[42]发现辛伐他汀可以明显促进骨折愈合。

作者所在课题组通过前期实验发现，骨折后第2周时，辛伐他汀组家兔桡骨骨折愈合情况较骨形态发生蛋白2组稍差，但是要优于模型组。术后第4，8周时，辛伐他汀组已经与骨形态发生蛋白2组差异无显著性意义，而且二者均优于模型组，从而证实了证实了口服辛伐他汀可以促进家兔桡骨骨折愈合[7, 10]。

骨形态发生蛋白2是目前已知的惟一能单独诱导骨组织形成的局部生长因子[43-45]。而且体内和体外实验都证明骨形态发生蛋白2具有促进成骨细胞分化和诱导体外成骨的能力[27]。骨形态发生蛋白2诱导成骨包含有3步，每一步都是多分子放大反应[46]：①诱导趋化：在骨形态发生蛋白2趋化下，血浆纤维连接蛋白与产胶原的骨基质连接，促进间充质细胞黏附其上发生增殖。趋化性与骨形态发生蛋白2浓度及细胞上的受体密度有关。②诱导有丝分裂，细胞通过有丝分裂得到增殖。③诱导分化，骨形态发生蛋白2可以诱导成纤维型细胞分化为成骨型细胞。

目前骨形态发生蛋白2已广泛被应用于临床工作中。美国创伤中心对12例开放性胫骨折患者采用重组人骨形态发生蛋白2和可吸收胶原(重组人骨形态发生蛋白2浓度为0.43 g/L)通过创口导入，12例患者中的9例在6个月内骨折修复[47]。张民等[48]将重组人骨形态发生蛋白2复合同种松质骨载体(其中含重组人骨形态发生蛋白2 0.4 mg)植入兔桡骨15 mm人工缺损处，以新鲜自体松质骨植入，单纯同种松质骨植入作为对照，结果发现重组人骨形态发生蛋白2复合同种松质骨载体的骨修复效果与自体骨基本一致。

作者所在课题组通过前期实验发现，骨折后第2周时，骨形态发生蛋白2组家兔桡骨骨折愈合最好，不仅优于模型组，而且优于辛伐他汀组和淫羊藿煎剂组；术后第4周时，与淫羊藿煎剂组相当，但是稍优于辛伐他汀组，明显优于模型组；术后第8周时，骨形态发生蛋白2组、淫羊藿煎剂组、辛伐他汀组的骨折愈合无明显的差异，均优于模型组，从而证实了骨形态发生蛋白2对于骨折愈合的促进作用，特别是早期更加显著[6-7, 10]。

作者所在课题组通过前期实验证实，口服辛伐他汀和淫羊藿提取物均能促进家兔桡骨骨折愈合，而且二者联合应用时具有协同作用[6-7, 10]。可能与二者同时具有促进成骨和抑制破骨的作用有关。实验进一步研究证实，不同剂量比淫羊藿苷和辛伐他汀联合应用均可促进家兔桡骨骨折愈合，当剂量比为1∶1时，促进作用更显著。这可能与高浓度辛伐他汀或淫羊藿苷均能促进成骨细胞分化或抑制骨髓间充质干细胞有关[20, 34-35]。

综上所述，不同剂量淫羊藿苷和辛伐他汀联合应用均可促进家兔桡骨骨折愈合，当剂量比为1∶1时，促进作用更显著。

不同剂量比淫羊藿苷与辛伐他汀对家兔桡骨骨折愈合的影响

Effect of icariin and simvastatin with different dosage ratios on rabbits’ radial fracture healing

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