骨碎补总黄酮调控H型血管影响大鼠股骨Masquelet诱导膜模型的骨重建

doi:10.12307/2024.502

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (32): 5130-5135.doi: 10.12307/2024.502

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骨碎补总黄酮调控H型血管影响大鼠股骨Masquelet诱导膜模型的骨重建

曾志奎1，2，熊伟3，梁卫东1，钱国文4，梁超轶3，潘斌3，郭灵3，魏文强3，邱勋祥3，邓文芳3，袁灵梅1

1江西中医药大学附属医院，江西省南昌市 330006；2江西中医药大学中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，江西省南昌市 330004；3江西中医药大学，江西省南昌市 330004；4江西理工大学，江西省南昌市 330013

收稿日期:2023-08-22 接受日期:2023-10-14 出版日期:2024-11-18 发布日期:2023-12-28
通讯作者: 袁灵梅，博士，主治中医师，江西中医药大学附属医院，江西省南昌市 330006
作者简介:曾志奎，男，1984年生，江西省抚州市人，博士，副主任中医师，博士生导师，主要从事中药防治骨与关节损伤方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81960880)，项目负责人：曾志奎；江西中医药大学科技创新团队项目(CXTD22009)，项目参与人：曾志奎；江西省临床医学中心项目(20212BCG74004)，项目参与人：曾志奎

Bone remodeling in the Masquelet-induced membrane model of rat femur by modulation of H-type vessels by total flavonoids of rhizome drynariae

Zeng Zhikui1, 2, Xiong Wei3, Liang Weidong1, Qian Guowen4, Liang Chaoyi3, Pan Bin3, Guo Ling3, Wei Wenqiang3, Qiu Xunxiang3, Deng Wenfang3, Yuan Lingmei1

1Affiliated Hospital of Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China; 2National Engineering Research Center for Manufacturing Technology of Traditional Chinese Medicine Solid Preparations, Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, Jiangxi Province, China; 3Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, Jiangxi Province, China; 4Jiangxi University of Science and Technology, Nanchang 330013, Jiangxi Province, China

Received:2023-08-22 Accepted:2023-10-14 Online:2024-11-18 Published:2023-12-28
Contact: Yuan Lingmei, MD, Attending physician, Affiliated Hospital of Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China
About author:Zeng Zhikui, MD, Associate chief physician, Doctoral supervisor, Affiliated Hospital of Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China; National Engineering Research Center for Manufacturing Technology of Traditional Chinese Medicine Solid Preparations, Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, Jiangxi Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81960880 (to ZZK); Scientific Research Innovation Team Project of Jiangxi University of Chinese Medicine, No. CXTD22009 (to ZZK [project participant]); a grant from Jiangxi Provincial Clinical Medical Center, No. 20212BCG74004 (to ZZK [project participant])

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

H型血管偶联成骨：H型血管与骨祖细胞、成骨细胞和破骨细胞存在多个水平上相互调控作用，这种成骨和成血管之间在空间和时间上的密切联系称之为 “H型血管偶联成骨”。
诱导膜技术：又称Masquelet技术，其对骨缺损的修复分为2个阶段：①诱导膜形成期：首先彻底清除病灶区内所有坏死组织，在骨缺损处放置聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥旷置，因局部异物炎症刺激反应，4-6周后在骨水泥周围形成一层类似滑膜的组织，称之为诱导膜。②骨重建修复期：第一阶段手术后4-6 周，切开诱导膜移除骨水泥，然后在诱导膜内植骨。因诱导膜不仅拥有良好的血供还能分泌相关成骨因子，可促进移植骨和宿主骨的融合，最终完成骨修复。

背景：多项研究发现，骨碎补总黄酮可促进诱导膜中血管新生、改善诱导膜生物性能、加速诱导膜技术骨重建，但相关分子机制仍需进一步探究。

目的：观察骨碎补总黄酮通过调控H型血管对大鼠股骨Masquelet诱导膜模型骨重建的影响。
方法：将36只雄性SD大鼠按体质量分层后随机分为空白组、模型组、中药组，每组12只，3组均建立4 mm右后肢股骨骨缺损模型，模型组与中药组骨缺损处充填聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥；造模后6周，空白组骨缺损处填充大鼠自体尾骨，模型组与中药组取出诱导膜内的骨水泥后植入大鼠自体尾骨。植骨第3天开始，中药组灌胃给予骨碎补总黄酮157.5 mg/(kg·d)，其余两组灌胃给予生理盐水，连续给药至植骨后8周。植骨后8周取材进行相关检测。

结果与结论：①X射线片显示，空白组缺损区骨折线清晰，仅有少量骨痂形成；模型组缺损区可见不连续皮质骨，骨缺损区仍存在；中药组缺损区充满新生骨组织，骨髓腔与部分皮质骨形成，骨折线消失。②Micro-CT扫描显示，空白组缺损区新生骨量较少，模型组缺损区骨小梁数量明显增多，中药组大量新生骨组织填充于骨缺损区。③苏木精-伊红染色显示，空白组缺损区仅见少量新骨形成，成骨质量较差；模型组缺损区有较多的新骨形成，但骨组织内夹杂有部分纤维结缔组织；中药组缺损区可见大量新骨形成，成骨质量最佳。④CD31/Emcn免疫荧光双标染色显示，空白组骨缺损区新生骨组织内H型血管数量稀少、分布稀疏；相比空白组，模型组骨缺损区骨组织内含更多H型血管，血管呈相对规则的条状分布；中药组骨缺损区H型血管数量最多，并且血管分布密集。⑤结果表明，骨碎补总黄酮可通过上调H型血管表达增强成血管-成骨作用，提高大鼠股骨Masquelet诱导膜模型成骨效能、促进骨重建。

https://orcid.org/0009-0002-4570-5162(曾志奎)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: Masquelet技术, 骨碎补总黄酮, H型血管, 诱导膜, 骨缺损, 骨重建

Abstract: BACKGROUND: Several studies have found that the total flavonoids of rhizome drynariae can promote neovascularization in the induced membrane, improve the biological properties of the induced membrane, and accelerate bone remodeling in the induced membrane, but the related molecular mechanisms still need to be further explored.
OBJECTIVE: To explore the effect of total flavonoids of rhizome drynariae on bone remodeling in rat femoral Masquelet-induced membrane model by regulating H-type blood vessels.
METHODS: Thirty-six male Sprague-Dawley rats were stratified by body mass and then randomly divided into blank group, model group and traditional Chinese medicine group, with 12 rats in each group. A 4-mm femoral bone defect model was established in all the rats. Bone defects in the model group and traditional Chinese medicine group were filled with polymethylmethacrylate bone cement. At 6 weeks after modeling, the tail bone of the rats was implanted in the blank group, as well as in the other two groups after removal of bone cement. The traditional Chinese medicine group was given 157.5 mg/kg per day of total flavonoids of rhizome drynariae at 3 days after bone implantation, while the model and blank groups were given the same amount of saline by gavage until the 8th week after bone implantation. Bone graft samples were taken for relevant testing at 8 weeks after implantation.
RESULTS AND CONCLUSION: X-ray films showed that in the blank group, the fracture line in the defect area was clear, and only a small amount of bone callus formed; in the model group, the bone defect area still existed, where discontinuous cortical bone was visible; in the traditional Chinese medicine group, the defect area was filled with newborn bone tissues, the bone marrow cavity and part of the cortical bone formed, and the fracture line disappeared. Micro-CT scans showed that the amount of new bone in the defect area was low in the blank group, the number of bone trabeculae in the defect area was significantly increased in the model group, and a large amount of new bone tissue was filled in the bone defect area in the traditional Chinese medicine group. Hematoxylin-eosin staining results showed that in the blank group, only a small amount of new bone formed in the defect area and the quality of osteogenesis was poor; in the model group, there was more new bone tissue in the defect area, but some fibrous connective tissues were interspersed within the bone tissue; and in the traditional Chinese medicine group, a large amount of new bone formed in the defect area and the quality of osteogenesis was the best. CD31/Emcn immunofluorescence double-labeling staining results showed that the number of H-type blood vessels in the newborn bone tissue in the bone defect area of the blank group was sparse and sparsely distributed; compared with the blank group, there were more H-type blood vessels in the bone tissue in the bone defect area of the model group, and the blood vessels were distributed in relatively regular strips; the number of H-type blood vessels in the bone defect area of the traditional Chinese medicine group was the highest and the blood vessels were densely distributed. To conclude, the total flavonoids of rhizoma drynariae can upregulate the expression of H-type blood vessels to enhance the angiogenic-osteogenic effect, improve the osteogenic efficiency of the rat femoral Masquelet induced membrane model, and promote bone remodeling.

Key words: Masquelet technique, total flavonoids of rhizome drynariae, H-type vessel, induced membrane, bone defect, bone remodeling

中图分类号:

曾志奎, 熊伟, 梁卫东, 钱国文, 梁超轶, 潘斌, 郭灵, 魏文强, 邱勋祥, 邓文芳, 袁灵梅. 骨碎补总黄酮调控H型血管影响大鼠股骨Masquelet诱导膜模型的骨重建[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(32): 5130-5135.

Zeng Zhikui, Xiong Wei, Liang Weidong, Qian Guowen, Liang Chaoyi, Pan Bin, Guo Ling, Wei Wenqiang, Qiu Xunxiang, Deng Wenfang, Yuan Lingmei. Bone remodeling in the Masquelet-induced membrane model of rat femur by modulation of H-type vessels by total flavonoids of rhizome drynariae[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(32): 5130-5135.

图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析 36只大鼠全部进入结果分析。
2.2 各组大鼠骨缺损区X射线检查结果二期植骨术后8周，大鼠股骨侧位X射线片显示，空白组大鼠骨缺损区域骨折线清晰，仅有少量骨痂形成；模型组大鼠骨缺损区域可见不连续皮质骨，但仍有骨缺损区存在；中药组大鼠骨缺损区被新生骨组织填满，骨髓腔与部分皮质骨形成，骨折线消失(图2)。Lane-Sandhu X射线评分结果如图3所示，中药组评分优于其余两组(P < 0.05)。

2.3 各组大鼠骨缺损区Micro-CT扫描结果如图4所示。空白组缺损区新生骨量较少，骨小梁数量不足；模型组缺损区成骨质量较空白组有明显改善，骨小梁数量明显增多；中药组缺损区骨组织重建最好，新生骨组织有效填充于缺损区。

骨缺损处的新骨体积与骨矿物质密度是评估成骨质量的重要指标，各组骨缺损区两指标测量结果见图5，中药组新生骨体积与骨矿物质密度较空白组和模型组均有明显提高(P < 0.05)。

2.4 各组大鼠骨缺损区组织学观察结果苏木精-伊红染色显示，空白组缺损区仅见少量新骨形成，局部被大量纤维软骨、肌肉与结缔组织填充，成骨质量较差；模型组缺损区有较多的新生骨形成，但骨组织内夹杂有部分纤维结缔组织，骨小梁排列不规则；中药组缺损区成骨效能最佳，可见大量新骨形成，骨小梁排列规则，且部分髓腔及皮质骨形成，见图6。

鉴于H型血管的CD31与Emcn双强阳性表达的特征，故借助免疫荧光双染。如图7，8所示，空白组缺损区新生骨组织内H型血管数量稀少，分布稀疏；相比空白组，模型组缺损区骨组织内含更多H型血管，且血管呈相对规则的条状分布；中药组缺损区H型血管数量较空白组、模型组明显增多，且二者伴行状态紧密、血管分布密集。

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引言

大段骨缺损的修复重建难度大、周期长、失败率及致残率高，是骨科医生面临的医学难题[1-2]。传统治疗大段骨缺损的方法有自体骨移植和骨搬运技术等，但均存在一定不足[3-5]，单纯自体骨移植有不可控制的骨吸收现象，骨搬运技术亦存在反复手术、治疗周期漫长及针眼感染等缺点[6-8]。首次被法国医生MASQUELET描述为诱导膜的技术(Masquelet技术)，已被临床证实为重建大段骨缺损的有效方法，和牵张成骨一起被称为20世纪骨缺损修复重建的两大“里程碑”技术[9]。Masquelet技术诱导膜中存在着丰富的血管网络，不仅可为新生骨组织运输营养、排泄代谢废物，还可分泌相关成骨因子(如血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白2等)，同时富含骨祖细胞，形成了良好的生物微环境，可促进移植骨和宿主骨的融合。然而Masquelet技术二期移植骨矿化时间长、成骨质量欠佳，导致治疗周期延长，制约了其临床推广。
越来越多的研究表明骨内血管新生与骨形成密切相关，通过加速骨缺损部位血管化可起到促进骨再生、改善成骨质量和缩短治疗周期的作用[10]。近年来的研究发现，在骨内存在着一种血小板内皮细胞黏附分子(又称CD31)及内皮黏蛋白(Endomucin/Emcn)双强阳性表达的CD31hi Emcnhi血管，亦称之为“H型血管”[11]。H型血管与骨祖细胞、成骨细胞和破骨细胞存在多个水平上相互调控作用，在骨重建中发挥着重要作用，这种成骨和成血管之间在空间和时间上的密切联系被称为“H型血管偶联成骨”[12-13]。近期研究发现，中药骨碎补对骨重建过程中的成血管-成骨偶联机制有促进作用[14-15]。
中药骨碎补具有补肾壮骨之功效，是补肾法的代表性药物，在促进骨形成与骨修复方面疗效确切。课题组前期研究已证实，骨碎补的有效成分骨碎补总黄酮具有丰富诱导膜中血管网，可改善诱导膜生物性能、促进二期植骨矿化和骨重建作用[16]。但迄今为止，应用Masquelet技术进行大段骨缺损修复时H型血管是否参与调控尚未知；此外，骨碎补总黄酮促进Masquelet技术二期骨重建的相关机制亦不明，是否与H型血管偶联成骨相关仍有待进一步探究。故此次实验尝试从H型血管偶联成骨角度出发，探讨骨碎补总黄酮对大鼠股骨Masquelet技术诱导膜模型骨重建的影响。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机分组对照动物实验，选用方差分析对组间数据进行比较。
1.2 时间及地点实验于2020年3月至2021年12月在江西中医药大学实验动物中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 8-10周龄雄性SD大鼠36只，SPF级，体质量260-280 g，由江西中医药大学动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK(赣)(2017-0004)。大鼠分笼饲养，温度 24-26 ℃，适应性喂养1周后用于实验，自由进水及饮食。实验方案经江西中医药大学实验动物伦理委员会审查通过，审批号为：JZSYDWLL-20201120。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2 器材与试剂自制不锈钢大鼠股骨6 孔钢板及截骨导板，直径 1.5 mm 皮质骨自攻螺钉(江苏百舍医疗器械有限公司)；聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥(国械注进 20143656033)；苏木精染液(ZLI-9610，中衫金桥)；CD31一抗(北京索莱宝科技有限公司)；Emcn一抗(北京博奥森生物技术有限公司)；Cy3 Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)二抗(武汉爱博泰克生物科技有限公司)；山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)；DR7500型DR拍片机(日本柯达)；Micro-CT机(瑞士Scanco Medical公司)。
1.3.3 药物强骨胶囊(由北京岐黄制药有限公司生产，国药准字Z20030007)，规格：每粒装0.25 g，含骨碎补总黄酮有效成分180 mg；青霉素(由华北制药股份有限公司生产，国药准字H13020657)，规格：80×104 U/瓶，有效成分青霉素钠。
1.4 方法
1.4.1 动物分组及术前准备大鼠按体质量分层后随机分为空白组、模型组、中药组，每组12只。手术造模前24 h禁食不禁水。腹腔注射2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉，大鼠右大腿备皮，用体积分数75%乙醇消毒术区，左侧大腿肌注青霉素(8×104 U)预防感染。
1.4.2 手术造模整个造模过程分为2期：一期诱导膜形成和二期植骨修复重建。一期造模术参考作者前期所发表文献[17]，麻醉后3组大鼠取左侧卧位，作右后肢大腿外侧皮肤纵行切口，切开皮肤及筋膜后分离股外侧肌及股二头肌肌间隙显露至骨膜，暴露股骨整个外侧面，将6孔不锈钢钢板放置在股骨外侧面，将2枚合适长度螺钉钻入第1，6孔，于钢板第2，5孔钻入2枚克氏针，穿过截骨导板孔后放置截骨导板于钢板上方，在导板凹槽处穿过线锯分别行远近端截骨，高度至股骨2/3，不完全截断。取出截骨导板，拔出第2孔的克氏针，钻孔，螺钉固定，第5孔同前。钢板固定牢靠后，股骨远近端被完全截断，取出4 mm带骨膜骨块，模型组及中药组骨缺损处填充聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥，空白组不予填充。

一期造模术后6周行二期植骨修复重建造模。术前准备同前，使用体积分数75%乙醇对大鼠尾巴消毒3次，铺无菌单后行纵向切开，剥离大鼠尾部皮肤并截取两节尾骨，剔除尾骨上残余软组织后制备成细小尾骨粒。随后沿一期手术切口切开右大腿皮肤及皮下组织，于股外侧肌和股二头肌肌间隙进入，钝性分离，切开并保护好诱导膜组织，取出骨水泥块，将大鼠自体尾骨粒填充至诱导膜中(空白组直接将尾骨粒填充至骨缺损处)，冲洗后依次缝合诱导膜、肌肉与皮肤，关闭伤口(图1)。

1.4.3 术后处理术后12 h内禁食不禁水。每期造模术后连续5 d给予肌注8×104 U青霉素预防感染。术后分笼饲养5 d后合笼，以防止大鼠相互撕咬。
1.4.4 药物干预二期植骨术后第3天开始，中药组灌胃给予骨碎补总黄酮157.5 mg/(kg·d)[14]，其余两组灌胃给予生理盐水4 mL/(kg·d)。连续给药至二期植骨术后8周。

1.4.5 骨缺损区X射线检查二期植骨术后8周麻醉大鼠，拍摄大鼠造模侧股骨标准正、侧位X射线片(江西中医药大学附属医院影像科，管电压50 kV，电流4 mA)。采用Lane-Sandhu X射线评分评估骨缺损区骨重建水平(表1)[18]。

1.4.6 骨缺损区Micro-CT扫描 X射线检查后，过量麻醉处死大鼠，获取大鼠股骨组织，去除表面软组织制备标本。将获取的标本于深圳北大医院实验医学中心进行Micro-CT扫描(设备：viva CT 80， 80 mm holder放置标本，管电压70 kV、电流0.5 mA，120 μm分辨率)。
1.4.7 骨缺损区组织学观察沿骨缺损造模区域截取新生骨组织，随后清理骨表面软组织，将骨组织放入体积分数10%甲醛溶液中固定24 h，将固定好的骨组织样本经脱钙、冲洗、脱水、透明后石蜡包埋进行组织切片，切取5 μm厚薄片，使用苏木精-伊红染色试剂盒进行组织染色，光学显微镜下观察新生骨组织形态学，评估成骨质量。
CD31/Emcn免疫荧光双染色：将石蜡切片脱蜡至水后用胃蛋白酶进行抗原修复，将切片放置在Emcn一抗缓释液(稀释比例1∶200)孵育过夜后，使用荧光Cy3二抗缓释液(稀释比例1∶200)避光孵育45 min。随后使用胃蛋白酶修复再次进行抗原修复，将切片再次放置在CD31一抗缓释液(稀释比例1∶200)孵育过夜后，使用荧光IgG488二抗缓释液(稀释比例1∶200)避光孵育45 min。最后使用DAPI避光孵育3 min，对切片进行染核，用PBS冲洗多余染色液，切片滴加抗荧光淬灭剂行封固处理，在荧光显微镜下观察结果，对比切片CD31和Emcn的染色深浅程度和染色面积。
1.5 主要观察指标各组大鼠骨缺损处X射线检查、Micro-CT扫描、苏木精-伊红染色及CD31和内Emcn免疫荧光双标染色结果。
1.6 统计学分析采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，各组计量资料以x±s表示，先进行正态性和方差齐性检验，符合正态分布的多个样本均数之间比较采用单因素方差分析；非正态分布的数据则采用秩和检验，P < 0.05代表差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过江西中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

骨的吸收与重建伴随着整个生命周期，此过程中骨细胞与血管内皮细胞主导的成骨-成血管机制在保持骨骼正常结构与功能中发挥着主导作用[19]。骨细胞和内皮细胞之间通过旁分泌功能相互作用，骨细胞可分泌血管新生因子调控内皮细胞，而内皮细胞释放血管分泌因子调节骨细胞行为[20-21]，故血管是除骨细胞外另一可以促进和改善成骨的新靶点，因而对骨内皮细胞的研究就变得非常有前景[22-23]。自2014年以来，《Nature》杂志相继报道了 H型血管介导的成血管-成骨偶联效应，其在骨新生中发挥着重要作用[11，24]。XIE等[25]报道了由破骨前体细胞分泌的血小板源性生长因子BB可诱导CD31hi Emcnhi血管生成，而CD31hi Emcnhi血管分泌出的大量成纤维生长因子、骨形态发生蛋白可在分子水平偶联成骨。新型H型血管在骨形成和修复过程中发挥着重要的调节作用，可成为未来治疗骨疾病的新靶点，同时也有助于人们更好地理解内皮细胞和骨祖细胞间的分子信号互通和血管新生与骨形成的相互关系[26]。
Masquelet 技术诱导膜中存在着大量的破骨前体细胞、成骨细胞、间充质干细胞及内皮祖细胞，含有丰富的血管网，同时可分泌血管内皮生长因子、转化生长因子β1 、CD31等生物因子[27]，因此诱导膜技术的骨修复过程很可能与H型血管偶联成骨密切相关，但迄今未见相关报道。此次实验通过构建SD大鼠股骨Masquelet技术诱导膜模型，证实H型血管参与了Masquelet技术的二期骨重建过程。相比单纯骨缺损模型的空白组，采用Masquelet技术构建的诱导膜模型组有更多的新生骨组织形成，且局部H型血管分布相对密集，这表明Masquelet技术诱导膜模型通过H型血管偶联成骨提高了其成骨效能。但Masquelet技术治疗大段骨缺损时仍存在二期移植骨血管化、矿化缓慢的问题，导致其治疗周期延长。
中医药作为中华文明的瑰宝，在促进骨缺损愈合、提高成骨质量与缩短治疗周期等方面有着巨大的应用潜力[28-30]。《黄帝内经》中最早提出的肾为“藏精之所，主骨生髓”，为祖国传统医学在治疗骨折、骨折延迟愈合和骨病方面奠定了宝贵的理论基础[31-32]。骨碎补具有补肾壮骨之功效，是补肾法的代表性药物。课题组前期研究证实，骨碎补中的主要活性成分骨碎补总黄酮可促进诱导膜中血管新生、改善诱导膜生物性能[16]。黄敏玲等[15]研究表明，骨碎补总黄酮可促进 SD 大鼠骨缺损模型骨重建过程中成血管-成骨偶联，从而加速骨修复。申震等[14]研究发现，骨碎补总黄酮通过上调牵张成骨过程中H型血管的表达促进局部新骨形成。LI等[33]
报道在诱导膜技术二期，骨碎补总黄酮可通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进成骨分化和局部骨质矿化。然而，骨碎补总黄酮促进Masquelet技术二期骨重建是否与调控H型血管偶联成骨有关尚未见报道。此次实验通过苏木精-伊红染色、X射线片和Micro-CT扫描等方法证实骨碎补总黄酮可促进Masquelet技术诱导膜模型骨缺损区修复重建，同时借助免疫荧光双染色首次证实了H型血管偶联成骨机制参与了此过程。研究结果表明相比其余两组，中药组显著上调了新生骨组织中H型血管的表达，起到促进Masquelet技术骨重建的作用。
综上所述，实验报道了骨碎补总黄酮通过调控H型血管偶联成骨提高了SD大鼠Masquelet技术诱导膜模型的成骨效能，促进二期骨重建，证实H型血管参与了Masquelet技术修复骨缺损过程，可作为该技术新的作用靶点，为之后调控Masquelet技术中H型血管以发挥成血管-成骨偶联作用奠定了研究基础，同时中药与Masquelet技术的结合亦为修复大段骨缺损提供了新的思路与方向。研究亦存在一定的不足之处，虽结果表明骨碎补总黄酮可通过调控H型血管偶联成骨促进Masquelet技术二期骨重建，但更深入的分子机制研究仍有待进一步开展。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

骨碎补总黄酮调控H型血管影响大鼠股骨Masquelet诱导膜模型的骨重建

Bone remodeling in the Masquelet-induced membrane model of rat femur by modulation of H-type vessels by total flavonoids of rhizome drynariae

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