2.1   外泌体及miRNA的概述   外泌体作为信号分子的载体，是细胞间通讯和信息传递的重要方式，而且外泌体含有多种蛋白质和核酸，在周围的微环境中发挥重要作用[8]。外泌体内所含的遗传物质包括DNA和RNA，其中在靶细胞内起作用的主要是RNA。外泌体中的RNA主要包括mRNA、microRNA(miRNA)以及长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)，其中miRNA属于功能性RNA，通过在3’非翻译区mRNA和miRNAs之间形成半互补结构来调节基因表达[9]，从而干预疾病的发生发展。从hucMSC-Exos及携带的miRNA研究领域的发展中，可以看出越来越多的研究人员发现了外泌体及miRNA在卵巢相关疾病中发挥的重要功能，见图3。



2.1.1   外泌体及miRNA的形成   近年来，因间充质干细胞具有来源广泛、应用性强的特点，成为许多学者的研究热点。其中，外泌体作为细胞旁分泌的重要成分，是细胞间通讯和信息传递的重要方式。外泌体作为胞外囊泡的主要形式，广泛存在于血液、乳液、胎盘、羊水和胸腔积液等体液中[10]。外泌体的产生是一个连续的过程，包括2次胞膜内陷和胞内多囊泡体的形成，并通过与胞膜的融合和胞吐过程，进而以外泌体的形式进入细胞的外环境中[11]。外泌体通过胞吐作用将miRNA等物质分泌到细胞外环境并作用于细胞，从而调控靶细胞内的蛋白表达、细胞增殖、分化和凋亡等生理和病理。有研究发现血清和唾液的外泌体部分高度富含miRNA，并且这类RNA中的大多数不能在人体生物体液中自由循环，而是主要包裹在外泌体中[12]。由此可知，循环中的miRNA主要来源于外泌体。
2.1.2   外泌体及miRNA的潜在生物学功能   外泌体作为一种新的细胞间通讯的媒介，可以通过与配受体结合或者直接接触，发生吞噬或者融合作用，将mRNA、miRNA等物质释放出去，从而调节细胞的生物活性。有研究显示，外泌体主要通过3种机制参与细胞间通讯：①外泌体与靶细胞之间受体/配体相互作用，将信息传递给靶细胞；②外泌体膜上磷脂酰丝氨酸与活化的T淋巴细胞及巨噬细胞膜上的TIM1、TIM4等受体结合形成复合体，再与靶细胞膜上的整合素αvβ3、αvβ5结合；③靶细胞直接将外泌体内吞吸收[13]。一般来说，外泌体的功能取决于它们的母本细胞[14]。不同间充质干细胞来源外泌体表现出多种功能，如抑制受损颗粒细胞凋亡、降低卵巢活性氧水平、促进细胞增殖和抗炎作用。
在外泌体所含的生物分子中，miRNA是一类长度为22-25个碱基的单链非编码RNA，广泛存在于真核生物体内，有研究表明，miRNA可以参与卵巢颗粒细胞的增殖、分化和凋亡以及激素的代谢，并且在卵母细胞的存活和发育中发挥了重要的作用[15]。
2.2   外泌体及miRNA 在POI作用机制的研究   外泌体及miRNA能够修复组织损伤、促进器官恢复，具有良好的应用前景，深入探究其作用机制，能够为临床应用提供强有力的理论依据。
2.2.1   影响增殖   增殖是生命体最重要的特征，只有卵巢颗粒细胞和各级卵泡数目增加，卵巢功能才能够逐渐恢复。卵巢颗粒细胞的增殖在滋养卵母细胞的生长和发育方面起着至关重要的作用，并具有分泌类固醇激素以保证生殖功能的作用，这是维持卵泡正常发育的关键。因此，促进卵巢内各种细胞，特别是卵巢颗粒细胞和卵母细胞的增殖，是治疗卵巢早衰的重要途经。有研究人员发现人经血间充质干细胞来源外泌体(embryonic stem cell-derived exosomes，MenSC-Exos)通过提高卵巢生殖标记物Ki67的表达来促进体外原始和初级卵泡中卵巢颗粒细胞的增殖，并且恢复了动情周期和血清性激素水平，同时抑制卵泡凋亡，因此MenSC-Exos可以有效促进POI疾病的卵泡发育，并恢复POI大鼠的生育能力[16]。在此研究中，研究人员使用荧光标记MenSC-Exos，在双侧卵巢皮质和子宫下段检测到相应的荧光标记物，从而证实了MenSC-Exos对于卵巢皮质和子宫下段的趋向性，为外泌体的靶向治疗提供了有力的证据。
此前有研究表明，hucMSC-Exos可用于治疗POI并保护卵巢颗粒细胞免受顺铂的损害，但其中的具体机制不清[17]。另一项动物实验证明了在体内和体外动物实验中，人脐带间充质干细胞通过Hippo通路恢复卵巢颗粒细胞促卵泡激素受体表达并促进体内卵巢颗粒细胞增殖，改善POI卵巢功能和生殖能力；并且当关键的Hippo分子被阻断时，治疗结果被抑制，从而说明Hippo通路在外泌体治疗POI过程中的必要性[18]。众所周知，卵母细胞的成熟与卵泡的生长发育密切相关[19]。YANG 等[20]将新生儿卵巢与不同剂量的人脐带间充质干细胞一起培养24 h后，蛋白质印迹结果显示磷酸化Akt水平显著增加，表明原始卵泡募集的增加与外泌体对卵母细胞磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)和mTOR信号通路的刺激作用有关，并且这些通路通过外泌体的miRNA，如 miR-146a-5p或miR-21-5p发挥作用，这说明了hucMSC-Exos不是从Hippo通路这一个通路来影响卵巢功能，而是通过多种通路协同作用的结果。而后向老年小鼠囊内注射人脐带间充质干细胞，进一步证明了它们对与年龄相关的生育力下降的恢复作用，这不仅体现在卵母细胞产量的增加，而且还改善了卵母细胞的质量。这项实验验证了人脐带间充质干细胞通过卵母细胞中外泌体的特异性富集来调节休眠原始卵泡的激活。另一项动物实验选用了出生3 d的小鼠卵巢进行体外培养，加入hucMSC-Exos进行处理，经过观察发现外泌体处理后大量卵细胞中Foxo3a出核，伴有mTOR信号通路相关蛋白磷酸化程度升高，并且原始卵泡被大量激活[21]；而在进一步实验中加入通路抑制剂及肝素以后，原始卵泡的激活作用可被抑制。这两项研究有力证明了hucMSC-Exos可通过影响卵母细胞的mTOR通路激活休眠的原始卵泡，增加原始卵泡的募集，从而促进卵母细胞发育，恢复小鼠的生育能力。
国内外多项研究证实，有些miRNA 的上调会使得卵巢颗粒细胞的增殖抑制，从而影响卵巢的正常生长发育。DANG等[22]发现人卵巢颗粒细胞中miR-379-5p的强制表达显著降低了多聚ADP-核糖聚合酶 1(poly ADP-ribose polymerase1，PARP1)和X射线修复补充中国仓鼠细胞6 (X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 6，XRCC6)的 mRNA和蛋白质水平，导致卵巢颗粒细胞增殖抑制，并且检测到DNA损伤生物标志物γH2AX升高，这项研究说明miR-379-5p对DNA的修复产生了不利影响，为POI提供了新的病因学解释。张群[23]通过荧光定量PCR与细胞增殖活力检测结果证实，随着外源性miR-181a表达量的增加，小鼠卵巢颗粒细胞的增殖活力明显降低，并进一步通过miR-181a的功能缺失实验表明卵巢颗粒细胞转染50 nmol/L miR-181a inhibitor时，可显著增加卵巢颗粒细胞的增殖活力以及卵巢颗粒细胞中cyclin D2的表达。另外有两项动物实验在芯片结果中发现miR-127-5p在生化卵巢早衰患者卵巢颗粒细胞中显著上调、靶基因高迁移率组框 2 (high mobility group box 2，HMGB2)中显著下调[24-25]。体外实验表明，miR-127-5p降调HMGB2基因导致卵巢颗粒细胞增殖抑制、DNA损伤加重、修复延迟。由此可见，有些miRNA的上调能够延缓DNA的修复，加重DNA损伤，证实了DNA修复在POI 病因学中的贡献，其中涉及的深层分子机制仍需要进一步的研究。
2.2.2   抑制卵巢颗粒细胞凋亡   卵巢颗粒细胞是包裹在卵母细胞表面的壁细胞，在创造一个适合卵母细胞生长的微环境方面起着主要的作用，并且卵巢颗粒细胞具有分泌激素以维持生殖功能的能力。有研究表明卵巢颗粒细胞衰老和凋亡是卵巢储备功能下降的主要原因[26]。相应的，卵巢颗粒细胞的状态对卵泡发育很重要，从本质上减少卵巢颗粒细胞的凋亡和原始卵泡储备池的修复，是修复卵巢功能的主要机制[27]。
国内外多项研究证实外泌体及miRNA可以有效调控卵巢颗粒细胞凋亡达到治疗POI的目的。有一项动物实验发现，外泌体可以直接靶向受损的卵巢颗粒细胞，来达到治疗目的[28]。研究人员用绿色荧光标记hucMSC-Exos，发现hucMSC-Exos可以整合到受损的卵巢颗粒细胞中，从而加速卵巢从顺铂诱导的卵巢颗粒细胞应激和细胞凋亡中恢复。此外，miRNA直接靶向受损细胞时也会显著提高治疗效果。XIAO等[29]发现当miR-10a在体外直接递送至受损的卵巢颗粒细胞或化疗诱导的POI小鼠卵巢时发挥了有效的抗凋亡作用。但这项研究未深入探寻miR-10a发挥作用的潜在机制。为进一步探讨其内在机制，有研究人员在顺铂诱导的卵巢早衰小鼠模型中发现骨髓间充质干细胞来源外泌体(bone marrow mesenchymal stem cells-derived exosomes，BMSC-Exos)上调Bcl-2蛋白水平并下调c-caspase-3蛋白水平以保护卵巢颗粒细胞损伤，并且在miR-664-5p敲除后再从骨髓间充质干细胞中分离出外泌体，观察其对卵巢颗粒细胞凋亡的影响，发现顺铂诱导的早期凋亡卵巢颗粒细胞比例增加，证实BMSC-Exos中的miR-664-5p对卵巢颗粒细胞具有保护作用[30]。此研究有力地说明了调控细胞凋亡相关基因的表达是抑制卵巢颗粒细胞和卵母细胞凋亡的重要机制。另一项研究也证实了这一结论：BMSC-Exos可通过抑制卵巢颗粒细胞的凋亡起到改善卵巢早衰大鼠生殖功能的作用[31]。
统计可知，间充质干细胞来源外泌体及miRNA发挥抑制卵巢颗粒细胞凋亡的作用，主要通过3种不同的信号通路，包括PI3K/AKT信号通路、TGF-β通路和核因子κB通路。ZHANG等[32]发现在移植早期，人羊膜间充质干细胞来源外泌体显著抑制卵巢颗粒细胞凋亡，保护卵巢血管免受损伤，并参与维持受损卵巢中原始卵泡的数量。并且人羊膜间充质干细胞来源外泌体中存在富集的 miRNAs，靶基因富集在磷脂酰肌醇信号通路和凋亡通路中，这就提示人羊膜间充质干细胞来源外泌体发挥作用主要是通过这两个通路完成的。一项动物实验发现在去氧乙烯基环己烯诱导的大鼠卵巢颗粒细胞损伤模型中，脂肪间充质干细胞来源外泌体使卵巢颗粒细胞中促进凋亡基因Bax和凋亡蛋白酶Caspase3的表达水平均明显降低，而抑制凋亡基因Bcl-2的表达水平明显增加，进一步探寻其中机制发现，脂肪间充质干细胞来源外泌体可以影响凋亡与抗凋亡相关途径蛋白的表达，进而激活KIT-KITL-PI3K-AKT信号传导通路得以实现对卵巢颗粒细胞的保护作用[33]。因此，无论是人羊膜间充质干细胞来源还是脂肪间充质干细胞来源外泌体均可通过PI3K-AKT信号传导通路抑制卵巢内细胞凋亡。此外，不仅是间充质干细胞来源外泌体，还有些miRNA(如miR-21)也是通过PI3K/AKT通路调控卵巢颗粒细胞凋亡。一项移植了过表达 miR-21的间充质干细胞治疗化疗诱导的卵巢早衰的动物实验表明，过表达miR-21的间充质干细胞凋亡减少，移植细胞的活力增加[34]。miR-21组磷酸酶和张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog，PTEN)和PDCD4的mRNA和蛋白表达下调，PTEN调控下游PI3K通路对卵巢颗粒细胞的增殖和凋亡有影响，体外结果也表明移植过表达miR-21的间充质干细胞对卵巢颗粒细胞的凋亡有更强的抑制作用。由此推测miR-21可能通过下调PTEN和PDCD4来抑制卵巢颗粒细胞的凋亡。并且另一项研究也证实了miR-21能部分改善化疗药物损伤的卵巢结构，这一作用与其调控靶基因PTEN、PDCD4紧密相关[35]。另一种BMSC-Exos携带的miR-144-5p对环磷酰胺损伤的卵巢颗粒细胞的治疗作用，也是通过PTEN激活PI3K/AKT途径靶向抑制环磷酰胺损伤的卵巢颗粒细胞凋亡[36]。
此外，外泌体及miRNA还能够通过其他通路调控凋亡因子的表达，从而影响卵巢功能。一项动物实验将脂肪间充质干细胞来源外泌体与POI卵巢颗粒细胞共培养，发现脂肪间充质干细胞来源外泌体可以促进卵巢颗粒细胞的增殖率并抑制细胞凋亡率；此外，脂肪间充质干细胞来源外泌体可以在体内和体外增加SMAD2、SMAD3和SMAD5的 mRNA和蛋白质表达，这表明脂肪间充质干细胞来源外泌体通过激活SMAD通路抑制Fas/FasL、caspase-3和caspase-8的表达来改善卵巢功能[37]。研究人员发现卵巢早衰患者血浆和卵巢颗粒细胞中miR-146a的上调；此外，miR-146a通过同时靶向白细胞介素1受体相关激酶(interleukin 1 receptor associated kinase，IRAK1)和肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6)来调节 toll 样受体(toll-like receptor，TLR) 信号传导，这会影响 NF-κB和IKBα的活性以及半胱天冬酶联级反应[38]。因此，miR-146a通过caspase级联途径靶向IRAK1和TRAF6对卵巢颗粒细胞的凋亡具有重要的促进作用，也表明抑制 miR-146a可能有利于卵巢早衰的治疗。由此可知，外泌体及miRNA能够通过SMAD通路和NF-κB通路改善卵巢功能。
有些miRNA在POI卵巢中高表达，会促进细胞凋亡，造成POI损伤。据一项动物研究报道，对照组和POI组卵巢外泌体中miRNA的表达谱存在显著差异，其中与凋亡相关的miR-122-5p在化疗组卵巢的外泌体中上调超过32倍，实验结果表明外泌体miR-122-5p通过靶向BCL9促进卵巢颗粒细胞的凋亡[39]。通过对比正常卵巢和化疗组卵巢的miRNA差异，可以认识到在化疗组卵巢中显著增多的miR-122-5p也许是造成POI的原因之一。 ZHAO等[40]利用细胞转染及双荧光素酶实验验证了miR-483-5p是FKBP4的上游调节因子，并且在化疗药物诱导的POI小鼠模型及POI患者血清中均高表达。另一项体内和体外实验也证实了顺铂诱导的卵巢损伤过程可能与上调的miR-483-5p靶向作用于FKBP4，进而导致的FKBP4表达下降有关[41]。这两项实验均发现了POI卵巢中另一上调的miRNA——miR-483-5p。一项研究在用pre-mir-23a转染的人卵巢颗粒细胞中观察到X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)表达和caspase-3蛋白水平降低以及切割的 caspase-3蛋白增加，同时细胞凋亡的发生率增加，miR-23a 可能通过降低人卵巢颗粒细胞中XIAP的表达在调节细胞凋亡中发挥重要作用[42]。董小敏等[43]下调miR-204-5p表达可增强人骨髓间充质干细胞对卵巢早衰大鼠卵巢结构和功能的恢复作用，抑制卵巢颗粒细胞凋亡，这可能通过下调MAPK、Bcl-2、Bax、Caspase-3基因和蛋白表达起到作用。张群[44]发现在卵巢早衰患者血清中异常高表达的miR-181a通过靶向抑制SIRT1的表达，介导FoxO1乙酰化修饰及细胞核转运，最终导致卵巢颗粒细胞凋亡。综上所述，抑制凋亡是外泌体及miRNA治疗POI的一项重要内在机制，也是外泌体及miRNA能够恢复卵巢功能的核心机制，其调控的差异，可能因为外泌体的来源不同和携带的miRNA不同，而产生不同的调控作用。
2.2.3   影响激素分泌   在哺乳动物中，卵巢卵泡的生长、排卵和黄体化受到促卵泡激素 (follicle stimulating hormone，FSH)和促黄体激素(luteinizing hormone，LH)的严格调节。促卵泡激素促进卵泡发育到排卵前阶段。促黄体激素激增迅速启动颗粒/卵丘细胞的终末分化，导致卵母细胞减数分裂成熟和卵丘扩大。为了确定miRNA对于激素分泌的影响，早在2009年，已有研究人员通过酶免疫测定法评估用80种不同的人类pre-miRNA 构建体培养的原代卵巢颗粒细胞对黄体酮、睾酮和雌二醇释放的影响，并发现36种miRNA抑制卵巢颗粒细胞中黄体酮释放，10种miRNA 促进黄体酮的释放，51种miRNA抑制雌二醇的释放[45]。越来越多的文献表明外泌体及miRNA在调控卵巢内激素分泌过程中也发挥着重要的作用。
YANG等[36]通过给POI大鼠腹腔注射BMSC-Exos进行体内治疗，发现外泌体移植可以显著恢复发情周期，增加卵巢早衰大鼠基底和窦卵泡的数量，提高雌二醇和抗苗勒管激素 (AMH)水平，并降低血清中促卵泡激素和促黄体激素的水平，可缓解环磷酰胺诱导的卵巢组织损伤。DAI等[46]发现miR-133b通过与3’UTR中的叉头盒 L2(forkhead box L2，Foxl2) mRNA种子序列结合并削弱Foxl2介导的促类固醇急性调节蛋白和CYP19A1的负转录调节来抑制人和小鼠卵巢颗粒细胞中的Foxl2表达，从而刺激雌激素的产生。有研究人员证实hucMSC-Exos携带的miR-21可以下调大肿瘤抑制因子1(large tumor suppressor 1，LATS1)，从而减少磷酸化的赖氨酰氧化酶样2(lysyl oxidase like 2，LOXL2)和Yes相关蛋白(Yes-associated protein，YAP)，最终促进卵巢颗粒细胞雌激素分泌[47]。因此，miR-21不仅能够通过下调PTEN和PDCD4来抑制卵巢颗粒细胞的凋亡，还能够调控赖氨酰氧化酶样2和Yes相关蛋白来刺激雌激素的分泌，可以合理地推测外泌体miRNA对于POI的治疗往往不是调控一个方面的结果，而是通过调节多个方面来达到良好的治疗效果。
另外，有学者发现有些miRNA不是单独发挥作用，相反是通过lncRNA协同调控卵巢卵泡发育[48]。该学者通过比较卵巢早衰患者与正常女性的卵巢组织发现，卵巢早衰患者卵巢组织存在多个差异表达RNA，包括20个lncRNAs、56个mRNAs和95个miRNAs；并在雌二醇中验证发现miR-204-5p可以与GCslnc-GULP1-2:1和COL3A1协同作用减少细胞增殖以及雌激素生成。
2.2.4   影响氧化应激反应   氧化应激是细胞衰老的重要原因之一。氧化应激在POI发病机制中的作用虽未得到深入研究，但已有研究显示卵巢氧化应激是原始卵泡加速衰竭的原因[49]。有研究人员通过荧光激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting，
FACS)和免疫荧光实验发现，人羊膜间充质干细胞来源外泌体靶向SIRT4，降低了POI小鼠的卵巢颗粒细胞和卵母细胞中的氧化应激水平，并改善了卵巢重量和产仔数，而且miRNA-320a在这一过程中起关键作用[50]。DING等[7]将hucMSC-Exos添加到环磷酰胺损伤卵巢颗粒细胞的培养基中，并将混合物注射到环磷酰胺诱导的POI模型小鼠的卵巢中，然后通过小RNA测序检测hucMSC-Exos的microRNA表达谱，其研究结果阐明了miR-17-5P通过抑制SIRT7来下调 PARP1、γH2AX和XRCC6的表达和活性氧的积累。LIU等[51]发现环磷酰胺通过上调 microRNA-15b的表达从而使内源性K1 mRNA表达沉默并激活下游的TGFβ1/SMAD通路，诱导卵巢颗粒细胞凋亡和导致活性氧清除的能力降低，进而导致卵巢早衰，并发现miR-15b 通过抑制卵巢颗粒细胞中的α-Klotho表达诱导小鼠卵巢早衰。总之，通过上述研究发现化疗会引起卵巢颗粒细胞中外泌体及miRNA的变化，反之，调控外泌体及miRNA可以减轻化疗所带来的氧化还原损伤。另外，一项以纳米粒子作为miRNA载体的研究发现高脂肪和高糖饮食可以激活Dab2ip/Ask1/p38信号通路，并通过抑制内源性miR-146的表达和促进卵巢颗粒细胞衰老来诱导γH2A.X磷酸化，从而导致卵巢早衰的发展；相反以纳米粒子PLGA为载体过表达miR-146可减轻p38诱导的γH2A.X 磷酸化，延缓卵巢颗粒细胞氧化应激损伤并缓解卵巢早衰症状[52]。
2.2.5   影响炎症反应   有研究表明，POI与炎症反应密切相关[53]。在POI患者中miRNA-146 的表达下调，而白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的表达上调，提示 miRNA-146 可以调节 TLR4和NF-κB信号通路将靶基因与炎症因子(如肿瘤坏死因子α)结合，以负反馈方式进行外来炎症反应。研究人员首次证明了miRNA-146的过表达可以刺激肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β等炎症因子的表达，并通过触发TLR4/NF-κB信号通路从而降低NF-κB的表达。NF-κB作为一种转录因子，是慢性炎症性疾病的主要特征。因此，miRNA-146的上调可以通过TLR4和NF-κB信号通路抑制抗炎作用来改善POI患者的卵巢功能。miRNA-146家族成员被称为炎症诱导型miRNA，可以参与Toll样受体信号的负反馈调节，来调节炎症反应。从上述研究中，miRNA-146作为免疫调节因子已经成为POI疾病的新靶点。
总之，通过上述临床前研究，可知外泌体通过转运卵巢疾病相关的miRNA等活性物质，达到治疗POI的目的，这为临床治疗卵巢相关疾病提供了新的方向。表1总结了外泌体及miRNA治疗早发性卵巢功能不全的多种机制及主要治疗结果。
2.3   外泌体及miRNA在POI诊疗方面的研究   外泌体作为细胞通讯的新机制，能够靶向识别病变组织或者细胞。最近有研究发现，能够通过检测卵泡液中外泌体及miRNA的含量来进行疾病的诊断，这也使外泌体及miRNA作为疾病诊断和治疗的新型标志物发挥其重要的靶向作用[54]。当卵巢衰老时，卵巢内细胞所分泌的外泌体或miRNA会发生显著变化，例如：DA SILVEIRA等[55]收集了青年(3-12岁)母马在不同发育阶段的卵泡液，经对比发现了卵泡液中有26个miRNAs的差异表达，又在老年马(20-26岁)的卵泡液中发现了55个miRNAs的差异表达，它们参与调控卵泡中类固醇激素的合成和TGF-β信号通路等过程，与卵巢的发育和衰老密切相关。并且与正常卵巢相比，在POI卵巢的外泌体中miRNA的表达谱存在显著差异，其中与凋亡相关的miR-122-5p在化疗组卵巢的外泌体中上调超过32倍[39]，印证了能够通过外泌体及miRNA的含量来进行疾病诊断的假设。反之，外泌体或miRNA可以恢复受损的卵巢组织，例如：SUN等[30]提出，BMSC-Exos携带的miR-644-5p通过靶向细胞的p53抑制卵巢颗粒细胞的凋亡，提示miR-644-5p具有治疗恢复卵巢功能的潜力。又有研究员发现，BMSC-Exos携带的miR-144-5p通过靶向PTEN改善化疗诱导的卵巢衰竭后的大鼠卵巢功能。通过上文可知，调控外泌体及miRNA的含量能够恢复卵巢功能，达到治疗疾病的目的[36]。
此外，外泌体及miRNA的发现在POI诊疗中有重要的作用，同时研究病变组织外泌体及miRNA为发现POI诊断标记物、探索新的发病机制以及开发新的诊疗措施提供可靠的技术手段和依据。ZHOU等[56]发现电针可降低POI女性的血清促卵泡激素和促黄体激素水平，提高血清雌二醇水平，并提出一个合理的假设：针灸是通过调节下丘脑-垂体-卵巢轴治疗POI疾病的。并有研究结果支持其假设，用电针刺激去卵巢的大鼠，结果显示电针治疗下调了下丘脑视前区雌激素受体的表达[57]。
同时也有类似的研究表明，低频电针改善了大鼠的发情周期并降低了下丘脑促性腺激素释放激素和雄激素受体的表达[58]。针灸作为一种良性刺激，是通过启动内源性自稳调控系统“神经-分泌-免疫”网络对机体进行多水平、多系统、多靶点的调节[59]。而外泌体作为细胞间通讯的重要媒介，为针刺信号传导中发挥着重要作用；而且外泌体的靶向调节也为针刺的“气至病所”、靶向趋病提供重要的生物学基础。此前已有研究结果显示，针刺可以调控血清中外泌体及miRNA的含量[60-61]。因此未来可以通过调控外泌体的含量来靶向控制针灸治病的效应，从而提高针灸应用水平。

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早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)是指女性在40周岁以前因妊娠以外的原因导致卵巢功能减退甚至衰竭，并伴有血清雌激素下降、促性腺激素升高的特征[1]。有流行病学报道，POI在40岁之前女性中的发病率为1%，在30岁之前的女性为0.1%[2]。早期研究表明，患POI的女性总体死亡率增加，并且患心血管疾病、神经认知障碍(如帕金森病)、内分泌和自身免疫性疾病以及生育能力低下的风险增加[3]，严重影响了女性的生活质量和生命安全。目前多用激素补充、体外激活和供卵助孕治疗，这些治疗方法尽管可以缓解更年期症状，但无法有效逆转POI患者的卵巢功能[4]。
目前已有报道，在一项临床治疗中POI患者通过移植骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells ，BMSCs)后改善激素水平、恢复排卵，甚至自然妊娠并分娩健康婴儿[5]。有很多学者认为骨髓间充质干细胞可向受损卵巢间质组织迁移，是通过旁分泌途径分泌相关细胞因子促进卵巢组织修复。有研究进一步报道，间充质干细胞所分泌的外泌体及miRNA参与原始卵泡的激活和发育[6]，例如，miRNA-17-5P是G1/S期细胞周期转变的重要调节因子，并且其过表达可以抑制细胞凋亡和卵巢癌细胞的增殖、迁移。SIRT7 缺乏会导致细胞的衰老加速，并且使胚胎发生缺陷。近期有研究人员发现，人脐带间充质干细胞来源外泌体(human umbilical cord mesenchymal stem cells-derived 
exosomes，hucMSC-Exos)通过激活miR-17-5P抑制SIRT7及其下游靶基因的表达，从而抑制卵巢内各种细胞的凋亡[7]。因此，可以得出外泌体及miRNA可以调控下游靶基因的表达，来抑制卵巢中各种细胞的凋亡，从而改善卵巢功能。越来越多的证据表明，无论是颗粒细胞和卵泡的增殖分化过程，还是卵母细胞早期生长、发育和成熟，miRNA都发挥着不可代替的作用。未来可以以外泌体及miRNA为切入点进一步解析POI病因，以便为其有效防治和干预提供新的靶点。该文将总结外泌体及miRNA在POI的作用机制及诊疗中的研究进展，探寻其内在机制，以期为临床应用提供理论依据。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1   资料来源   
1.1.1   检索人及检索时间   第一作者在2022年6月进行检索。
1.1.2   检索文献时限   自各数据库建库至2022年6月。
1.1.3   检索数据库   中国知网和PubMed数据库。
1.1.4   检索词   中文检索词为“外泌体，miRNA，早发性卵巢功能不全，卵巢早衰”；英文检索词为“exosome，miRNA，ovary，premature ovarian failure，premature ovarian insufficiency”。 

1.1.5   检索策略   以中国知网为例，检索策略见图1。

1.1.6   检索文献量   共检索到1 458篇文献，包括中文文献64篇，英文文献1 394 篇。
1.2   入选标准
1.2.1   纳入标准   ①各类外泌体治疗卵巢早衰及卵巢功能不全的相关文献；②探究外泌体治疗卵巢早衰及卵巢功能不全机制的相关文献；③miRNA治疗卵巢早衰及卵巢功能不全的相关文献；④探究miRNA治疗卵巢早衰及卵巢功能不全机制的相关文献；⑤关于外泌体及miRNA治疗卵巢功能不全的综述类文献；⑥实验性或循证性临床研究。
1.2.2   排除标准   ①重复性及相似性研究：机制内容相同或者十分相似的文章，则只选取发布较早的文献加以综述；②研究目的与外泌体及miRNA治疗早发性卵巢功能不全不相关的文献。 
1.3   文献筛选过程及质量评估   共检索到文献1 458篇，排除研究目的与该综述不相关以及重复的文章，然后由2位资料收集者仔细阅读筛选，互相评估纳入文献的适用性，最终纳入63篇文献。文献筛选流程图，见图2。

 近年来外泌体及miRNA在POI疾病的治疗及相关机制研究中表现出巨大潜能。间充质干细胞衍生外泌体的临床应用优于基于间充质干细胞的治疗，是因为它们具有较低的免疫原性、跨越生物屏障的能力以及较少的安全问题。在再生医学这个快速发展的领域中外泌体及miRNA治疗POI相关的研究已经在动物模型中进行，但外泌体及miNRA应用于临床仍然存在诸多困难：①针灸治疗POI多停留在动物实验阶段，缺少大量可靠的临床试验来支持该文的假设；②外泌体进入体内在几分钟之内就被迅速降解，无法持续稳定地发挥作用[62]；③目前对于miRNA的研究主要集中在体外细胞培养方面，基因敲除模型为组织培养和病变组织研究提供了新的技术手段[63]；④在大规模临床应用之前，需要确定外泌体及miRNA的培养条件和大规模培养、有效隔离、最佳剂量和安全储存的标准化技术。虽然外泌体及miRNA治疗POI的临床试验仍处于早期阶段，但越来越多的学者已经关注到这个领域，外泌体及miRNA将成为无细胞治疗POI的新手段。
3.1   研究的特点   该综述一方面总结外泌体及miRNA的形成及潜在的生物学功能；另一方面总结了外泌体及miRNA治疗POI的作用机制和诊疗中的进展，其中着重表述外泌体及miRNA在POI机制的作用，包括促进增值、抑制凋亡、激素分泌、氧化应激和抗炎作用。并提出外泌体及miRNA的治疗作用不只局限于一个方面，而是多种机制协同作用的结果。
3.2   研究的局限性   关于外泌体及miRNA的作用机制复杂，其作用于早发性卵巢功能不全的相关文献有限，因此该综述总结了促进增殖、抑制凋亡、激素分泌、氧化应激和抗炎作用。且临床研究尚处于起步阶段，该综述着重总结临床前的研究，对临床研究相对描述较少。外泌体及miRNA来源多种多样，该综述主要描述间充质干细胞来源外泌体和外泌体携带的miRNA，未来随着研究的深入，作者将会对与POI连接更紧密的外泌体及miRNA进行分析。
3.3   研究的意义   POI是育龄期女性生育困难的主要原因，严重影响着女性的健康和生活质量。随着再生医学的高速发展，外泌体和miRNA作为无细胞疗法，为POI的治疗提供了一种新的方向。该综述梳理了在卵巢疾病领域中前景可观的外泌体及miRNA的形成和潜在的生物学功能，同时总结了其在POI领域的作用机制和诊疗的研究进展，这将在一定程度上协助进一步对于POI机制的研究探索，同时对POI的方法及机制的研究起一定引导作用。
3.4   展望   外泌体及miRNA作为细胞间重要的信息传递介质，由于其高度的稳定性以及在疾病发生与发展中展现出的敏感性和特异性，成为关注的热点之一。通过上述研究结果，能够知道外泌体及miRNA承载着细胞间信号转导的重要作用，主要包括促进增殖、抑制凋亡、激素分泌和氧化应激4个方面。值得一提的是，作者发现hucMSC-Exos不仅可以提高老年雌性卵母细胞质量，促进卵巢颗粒细胞增殖和雌激素分泌，进一步抑制细胞凋亡，还可以减少活性氧积累[11，18，20-21，28，47]，见图4。并且在间充质干细胞中，人脐带间充质干细胞因其分离方法简单、增殖能力强和自我更新能力强而受到广泛研究，相比之下hucMSC-Exos免疫原性更低，具有重要的研究价值，值得更多的关注。与此同时，BMSC-Exos及其miRNA亚型可以靶向不同的靶点来抑制细胞凋亡，还提高雌二醇和抗苗勒管激素水平，并降低血清中的促卵泡激素和促黄体激素水平，缓解环磷酰胺诱导的卵巢组织损伤[24，30-31]，见图5。miR-146a通过抑制凋亡因子的表达来减少卵巢颗粒细胞凋亡，同时Dab2ip/Ask1/p38-MAPK通路和γH2A.X磷酸化来降低活性氧水平，并具有抗炎作用，能够缓解卵巢早衰症状[37-38，53]，见图6。因此，作者下一步很可能从hucMSC-Exos、BMSC-Exos和miR-146a着手，进一步深入探讨外泌体及miRNA对于POI的作用机制与针灸起效机制，这不失为一种理想的途径。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：#br# 外泌体：作为胞外囊泡一个亚类，其本质是细胞向外释放的双层囊泡小体，平均直径在100 nm左右，可携带如脂类、蛋白质、核酸等众多活性成分及细胞代谢产物，能够通过细胞间的传递发挥重要作用，在组织修复、疾病的诊断与治疗领域有重要的前景。#br# MicroRNA(miRNA)：是一类高度保守的组织特异性非小蛋白非编码RNA，具有通过识别同源序列以及抑制mRNA翻译或促进mRNA降解在转录后水平调节基因表达的能力。#br# 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

早发性卵巢功能不全(POI)是育龄期女性生育困难的主要原因，严重影响着女性的健康和生活质量。随着再生医学的高速发展，外泌体和miRNA作为无细胞疗法，为早发性卵巢功能不全的治疗提供了一种新的方向。本综述梳理了在卵巢疾病领域中前景可观的外泌体及miRNA的形成和潜在的生物学功能，着重表述外泌体及miRNA在早发性卵巢功能不全机制的作用，包括促进增值、抑制凋亡、激素分泌、氧化应激和抗炎作用，并提出外泌体及miRNA的治疗作用不只局限于一个方面，而是多种机制协同作用的结果。这将在一定程度上协助进一步对于早发性卵巢功能不全机制的研究探索，同时对早发性卵巢功能不全的治疗方法及机制的研究起一定引导作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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