门脉优先反向吻合快速建立肝移植大鼠模型

doi:10.12307/2022.537

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (17): 2696-2701.doi: 10.12307/2022.537

• 组织构建实验造模 experimental modeling in tissue construction • 上一篇下一篇

门脉优先反向吻合快速建立肝移植大鼠模型

张继翔1，闫宏宪2，轩娟娟1，白鸿太1，王耀权1，魏思东1，陈国勇1

1河南大学人民医院，河南省郑州市 450003；2郑州大学洛阳中心医院，河南省洛阳市 471000

收稿日期:2021-05-19 修回日期:2021-05-20 接受日期:2021-07-28 出版日期:2022-06-18 发布日期:2021-12-24
通讯作者: 魏思东，主任医师，河南大学人民医院，河南省郑州市 450003 陈国勇，主任医师，河南大学人民医院，河南省郑州市 450003
作者简介:张继翔，男，1994年生，河南省洛阳市人，汉族，河南大学在读硕士，主要从事肝移植与排斥反应的研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(U2004124)，项目负责人：陈国勇；河南省医学科技攻关计划项目(SBGJ2018071)，项目负责人：陈国勇；河南省医学科技攻关计划项目(SB201903020)，项目负责人：魏思东

Rapid establishment of rat liver transplantation model by portal vein preferential reverse anastomosis

Zhang Jixiang1, Yan Hongxian2, Xuan Juanjuan1, Bai Hongtai1, Wang Yaoquan1, Wei Sidong1, Chen Guoyong1

1Henan University People’s Hospital, Zhengzhou 450003, Henan Province, China; 2Luoyang Central Hospital, Zhengzhou University, Luoyang 471000, Henan Province, China

Received:2021-05-19 Revised:2021-05-20 Accepted:2021-07-28 Online:2022-06-18 Published:2021-12-24
Contact: Wei Sidong, Chief physician, Henan University People’s Hospital, Zhengzhou 450003, Henan Province, China Chen Guoyong, Chief physician, Henan University People’s Hospital, Zhengzhou 450003, Henan Province, China
About author:Zhang Jixiang, Master candidate, Henan University People’s Hospital, Zhengzhou 450003, Henan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. U2004124 (to CGY); the Henan Provincial Medical Science and Technology Program, No. SBGJ2018071 (to CGY) and SB201903020 (to WSD)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
门脉优先大鼠肝移植：在传统“二袖套法”的大鼠移植模型建立的基础上，先阻断门静脉，离断门静脉后进行门静脉套管吻合，不阻断下腔静脉，门静脉吻合完成后，阻断肝下及肝上下腔静脉，去除受体肝脏。
反向吻合：供体肝脏解剖位置向下移动到下腹部摆放，供体门静脉从肝脏后方折返到肝上下腔静脉上方，显露套管，受体门静脉离断后拉向下方和供体套管吻合。

背景：传统“二袖套法”大鼠肝移植模型的建立时间长，训练难度大，难以适应目前研究生的培养模式。
目的：利用大鼠肝移植建立步骤多的特点，合理组合每一步骤的时间及方法，缩短学习时间，降低操作难度，快速地构建大鼠肝移植模型。
方法：以“二袖套法”为基础，在保留下腔静脉血流通畅的基础上门静脉优先套管吻合，套管采用供肝放在大鼠下腹部的反向吻合法(门脉优先组)，建立大鼠肝移植模型，与传统大鼠肝移植模型(传统移植组)予以对比，统计分析两组学习曲线时间、门静脉阻断时间、无肝期时间、肝下下腔静脉阻断时间、受体手术时间及术后生存情况等。
结果与结论：①对传统移植组32只和门脉优先组30只模型建立的学习曲线进行分析，门脉优先组学习时间短于传统移植组；②将存活时间超过2 d的传统移植组12只大鼠和门脉优先组20只大鼠手术中的各阶段时间进行统计，采用参数检验分析显示，门脉优先组门静脉阻断时间稍长于传统移植组但差异无显著性意义；而门脉优先组肝上下腔阻断时间为(15.0±2.2) min，明显短于传统移植组的(21.3±2.1) min(P < 0.05)；门脉优先组肝下下腔阻断时间为(25.0±2.9) min，明显短于传统移植组的(32.5±3.2) min(P < 0.05)；两组供体灌注时间、供体手术时间、供体肝脏修整时间和受体手术时间相比差异无显著性意义；③提示门脉优先肝移植大鼠模型能缩短学习周期，降低操作难度，为初学者迅速掌握大鼠肝移植模型建立提供了一种较为可靠的方法，适合学习和推广。

https://orcid.org/0000-0002-4278-8057 (张继翔)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 门脉优先, 肝移植, 反向吻合, 学习曲线, 无肝期

Abstract: BACKGROUND: The traditional “two cuff” model of rat liver transplantation takes a long time to establish, which is difficult to grasp and adapt to the training of graduate students.
OBJECTIVE: As per the characteristics of multi-step establishment of liver transplantation model in rats, to rationally combine the time and method of each step so as to shorten the learning time and reduce the difficulty of operation, thereby rapidly establishing a rat model of liver transplantation.
METHODS: The portal vein was preferentially anastomosed using the two-cuff method when the blood flow of the inferior vena cava was unobstructed. The cuff was anastomosed reversely by placing the donor liver in the lower abdomen of rats (portal vein preferential anastomosis group). The rat liver transplantation model was established and compared with the traditional rat liver transplantation model (traditional transplantation group). The learning time curve, portal vein occlusion time, anhepatic phase time, inferior vena cava occlusion time, recipient operation time, and postoperative survival of the two groups were statistically analyzed.
RESULTS AND CONCLUSION: The learning curves of 32 cases in the traditional transplantation group and 30 cases in the portal vein preferential anastomosis group were analyzed. The learning time of portal vein preferential anastomosis group was shorter than that of traditional transplantation group. The operation time of 12 rats in the traditional transplantation group and 20 rats in the portal vein preferential anastomosis group which survived over 2 days was statistically analyzed. Parameter test analysis showed that the portal vein occlusion time in the portal vein preferential anastomosis group was slightly longer than that in the traditional transplantation group, but there was no significant difference. However, the blocking time of the suprahepatic inferior vena cava in the portal vein preferential anastomosis group was (15.0±2.2) minutes, which was significantly shorter than (21.3±2.1) minutes in the traditional transplantation group (P < 0.05), and the time of infrahepatic inferior vena cava occlusion in the portal vein preferential anastomosis group was (25.0±2.9) minutes, which was significantly shorter than that [(32.5±3.2) minutes] in the traditional transplantation group (P < 0.05). There was no significant difference in donor perfusion time, donor operation time, donor liver repair time and recipient operation time between the two groups. Rat model of liver transplantation with portal vein preferential anastomosis can shorten the learning cycle, reduce the difficulty of operation, and provide a relatively reliable method for beginners to quickly master the establishment of rat liver transplantation model, which is suitable for learning and promotion.

Key words: portal vein preferential anastomosis, liver transplantation, reverse anastomosis, learning curve, anhepatic phase

中图分类号:

张继翔, 闫宏宪, 轩娟娟, 白鸿太, 王耀权, 魏思东, 陈国勇. 门脉优先反向吻合快速建立肝移植大鼠模型[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(17): 2696-2701.

Zhang Jixiang, Yan Hongxian, Xuan Juanjuan, Bai Hongtai, Wang Yaoquan, Wei Sidong, Chen Guoyong. Rapid establishment of rat liver transplantation model by portal vein preferential reverse anastomosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(17): 2696-2701.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析共纳入受体大鼠62只，分为传统移植组与门脉优先组，其中传统移植组大鼠32只，门脉优先组30只，62只全部进入分析。
对于供体大鼠，因术中操作问题造成部分大鼠在手术未完成即结束手术，时间数据缺失，故将其中成活超过 2 d的大鼠(传统移植组12只和门脉优先组20只)纳入供体手术时间、肝脏修整时间、门静脉阻断时间、无肝期时间、下腔静脉阻断时间分析。传统移植组剔除20只，其中4只供体肝脏灌注不全，大鼠术后未醒；4只因肝上下腔静脉吻合后出血；3只因肝下下腔静脉血栓；2只因膈下静脉出血；2只因门静脉套管扭转；2只因门静脉套管脱落；其他原因3只。门脉优先组剔除10只，其中3只肝上下腔静脉吻合后出血，2只供肝灌注不全，2只肝下下腔静脉血栓，其他原因3只。其他指大鼠术后苏醒，意识欠佳，食欲减退，1 d后死亡，可能原因为肝脏急性排斥反应、术中缺氧时间过长、门静脉缺血再灌注损伤等，具体原因不详。
2.2 大鼠移植成活原因分析因为手术目的是研究术后1周大鼠排斥反应的作用和机制，大部分大鼠在术后1周要取标本，统计时间以术后1周为结点，采用卡方检验显示大鼠肝移植后成活率门脉优先组高于传统移植组，见表1。

因为大鼠生存时间大于2 d而小于7 d表明手术操作没有问题，但并不能达到实验的目的，把大鼠分成3个阶层，大鼠生存时间<2 d记1分，2-7 d记2分，>7 d记3分，见表2。

通过秩和检验显示大鼠肝移植的效果门脉优先组优于传统移植组，为了显示手术效果与手术例数累积的关系，依照移植的先后排序，每10例成活效果分别比较。两组第1个10例、第2个10例、第3个10例生存分阶层成活情况的秩和检验显示，门脉优先组第2个10例优于传统移植组(Z=78.000，P=0.041)，其他2个10例两组之间差异无显著性意义(P > 0.05)。
2.3 两组成活大鼠手术各阶段时间比较把成活时间超过 2 d的传统移植组12例大鼠和门脉优先组20例大鼠手术中的各阶段时间进行统计分析，采用参数检验分析显示，门脉优先组门静脉阻断时间稍长下于传统移植组，但差异无显著性意义；门脉优先组肝上下腔阻断时间为(15.0±2.2) min，明显短于传统移植组的(21.3±2.1) min(P < 0.05)；门脉优先组肝下下腔阻断时间为(25.0±2.9) min，明显短于传统移植组的(32.5±3.2) min(P < 0.05)；两组供体灌注时间、供体手术时间、供体肝脏修整时间、受体手术时间和门脉阻断时间相比差异无显著性意义，见图4。

2.4 两组成活大鼠肝脏和肠道缺血再灌注损伤的组织学观察两组成活大鼠在移植后第7天获取肝脏和空肠标本制作病理切片，行苏木精-伊红染色，进行缺血再灌注损伤组织学分析，结果显示肝脏的炎症反应及细胞损伤改变两组无明显差异，见图5A，B；空肠在缺血再灌注损伤后，炎症反应程度两组无明显差异，见图5C，D。

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引言

材料方法

1.1 设计观察对比动物实验，对于符合正态分布的计量资料以x±s表示，组间差异采用独立样本的t检验；计数资料以率表示，组间差异采用卡方检验；大鼠移植分阶层效果的分析采用秩和检验。
1.2 时间及地点实验于2020年6月至2021年5月在河南省中医药研究院完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物与分组选择健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠、Lewis大鼠、Brown Norway(BN)大鼠，其中SD大鼠来源于济南朋乐实验生物繁育公司，许可证号：SCXK(鲁)2019-0003；Lewis、BN大鼠来源于北京维通利华生物有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0006，体质量260-300 g，实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。
共纳入大鼠124只，其中SD大鼠40只，Lewis大鼠42只、BN大鼠42只(模型未稳定时采用预实验大鼠，即SD大鼠，稳定后采用正式实验大鼠，即Lewis、BN大鼠)。因手术方式、操作人员不同，将大鼠分为2组，其中传统移植组大鼠64只，门脉优先组60只，进行配对肝移植实验。
术前不禁食、不禁水，根据实验要求行供体和受体的不同组合移植，根据受体移植方式的不同分为传统移植组和门脉优先组，移植过程采用单人裸眼操作。
传统移植组采用方式为：阻断肝下下腔静脉，阻断门静脉，阻断肝上下腔静脉，移除受体肝脏，植入供体肝脏，吻合肝上下腔静脉后行门静脉套管，套管完成后开放肝上下腔静脉和门静脉，肝下下腔静脉套管完成后开放肝下下腔静脉[11]。
门脉优先组采用方式为：阻断和离断受体门静脉，行受体门静脉和供体门静脉套管吻合，套管完成后阻断肝下下腔静脉，阻断肝上下腔静脉，移除受体肝脏，吻合肝上下腔静脉后开放肝上下腔静脉和门静脉，肝下下腔静脉套管完成后开放肝下下腔静脉。
1.3.2 套管制备肝下下腔静脉、门静脉套管及胆管支架管为蓝色铁氟龙管，肝下下腔静脉套管内径2.41 mm，外径2.81 mm，管长3 mm，管尾翼长2 mm，见图1A；门静脉套管内径1.68 mm，外径2.08 mm，管长3 mm，管尾翼长2 mm，套管在放大镜下用手术刀片刻5排鱼鳞纹，口向尾翼方向防滑脱，胆管支撑管内径0.46 mm，外径0.76 mm，长约7 mm，两端剪为斜面，斜面朝向一致。
1.3.3 器械和药品上海金钟显微外科手术器械一套(18 cm弯镊1把，16 cm弯镊1把，16 cm直镊1把，16 cm弯持针钳1把，16 cm弯剪1把)、眼科12 cm弯止血钳6把、18 cm弯组织剪1把、朗米尼康14 cm带剪持针钳1把、上海金钟10 cm血管夹镊1把及动静脉血管夹若干；RZ1020润泽微量蠕动泵；8-0灵桥带尼龙线线缝合圆针，3-0涤纶线带圆针，楚达桌夹式放大镜带灯，6-0真丝缝合线，大鼠动物固定手术台，2 cm刀头的1 mm小动物电动剃毛器等。硫酸阿托品(上海全宇生物科技动物药业有限公司)2 mL∶1 mg，配制成0.1 g/L，肝素钠封管液(山东省恵诺5 mL∶50单位)配制成25 U/mL，左氧氟沙星(扬子江药业有限公司100 mL∶0.3 g)。
1.4 方法
1.4.1 肝移植模型供体手术供体按10 mL/kg给予2%的戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉[12]；取前腹部“十”型切口，进腹后，将肠管推向左下腹，显露胆总管，在肝胆管汇合部远端7 mm处剪开胆总管前壁，置入胆管插管，6-0丝线结扎固定，留线5 mm，便于寻找和牵拉，见图1B；结扎右侧肾动脉，游离肝下下腔静脉，8-0线缝扎右肾静脉，见图1C；6-0丝线结扎右肾上腺静脉，显露左膈下静脉，8-0线缝扎，见图1D；经肝下下腔静脉远端汇合处注入25 U/mL肝素 2 mL，见图1E；使供体血液肝素化，显露腹主动脉，穿刺针置入腹主动脉血管夹固定，见图1F；剪开胸壁，钳夹胸主动脉，剪断胸段下腔静脉，见图1G；0-4 ℃生理盐水灌注肝脏，流速6 mL/min，待肝脏变黄后改为流速3 mL/min维持[13-14]，6-0丝线结扎离断肝食管静脉，见图1H；游离门静脉，8-0线结扎并切断幽门静脉和脾静脉，肝动脉结扎离断，见图1I，J；平左肾静脉开口剪断肝下下腔静脉，离断右肾静脉及右侧肾上腺静脉，见图1K；脾静脉远端离断门静脉，见图1L；膈肌环与静脉壁汇合处离断肝上下腔静脉，取出供肝，置入0-4 ℃生理盐水中。

1.4.2 供肝修整血管镊穿过自制套管管腔，注意尾翼置于正前方，眼科血管钳固定套管尾翼与血管，夹住门静脉端后外翻于套管壁，见图1M；6-0丝线套管外双重结扎，注射器于门静脉内注入生理盐水，观察门静脉液体流入，确保置管顺利；同法处理肝下下腔静脉，见图1N；尾翼置入正后方，静脉夹夹闭肝下下腔静脉及套管尾翼，防治血液倒流和血管扭转，见图1O；在肝上下腔静脉侧方用8-0的带针线缝合一针打结固定便于提拉肝脏，然后再由外至内缝合一针便于和受体静脉缝合，见图1P。

1.4.3 肝移植模型受体手术
(1)麻醉与肝脏游离：受体大鼠术前以浓度为0.1 g/L阿托品0.3 mL肌肉注射以减少呼吸道腺体分泌，15 min后按10 mL/kg给予2%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。供体肝脏游离步骤：取前腹部正中切口，进腹后，两端拉钩牵拉，充分显露术野，5 mL 37 ℃生理盐水皮下注射补水，将肠管推向左测腹部，显露肝动脉及胆总管，8-0缝线缝扎肝动脉，见图2A，于肝总管左右汇合处6-0丝线结扎后离断，见图2B，翻向下方；8-0带针缝线于门静脉至肝内左右分支汇合处两侧留悬吊牵拉线以减少套管时间，见图2C，分离肝下下腔静脉，6-0缝线结扎右侧肾上腺静脉，见图2D；游离肝周韧带，显露左膈下静脉，8-0缝线缝扎，见图2E，近远端6-0丝线结扎肝食管血管离断，见图2F；于肝后方置入6 cm左右橡皮筋，牵拉至肝上下腔静脉处，8-0带针缝线于肝下下腔静脉两侧留悬吊牵拉线以减少套管时间。
(2)传统移植的受体肝脏去除、肝上下腔静脉吻合、受体门脉套管：血管夹夹闭受体肝下下腔静脉，见图2G，幽门静脉分叉以上阻断门静脉，见图2H；门静脉注入3 mL 37 ℃生理盐水，将肝内血冲入体循环，眼科弯血管钳阻断肝上下腔静脉，紧贴肝脏离断肝上下腔静脉，翻起受体肝脏，肝门处离断门静脉，直视下离断肝下下腔静脉，见图2I，保留右侧肾上腺静脉入肝下下腔静脉段，移除受体肝脏。植入供体肝脏，调转手术台，使大鼠头侧对应术者，供体肝上下腔静脉左右侧预置的8-0尼龙缝线与受体肝上下腔静脉左右侧两侧缝合，自受体左向右连续缝合肝上下腔静脉后壁，见图2J，至右侧与留置线打结后连续缝合肝上下腔静脉前壁，见图2K，生理盐水冲出血管腔内气泡，与左侧线尾打结，完成肝上下腔静脉缝合。调正手术台，大鼠尾侧对应术者，用纱布把肝脏翻向上方，显露肝门，受体门静脉两侧血管钳夹住预置线以作牵引；弯头显微镊于血管夹上方夹住门静脉，并下移门静脉止血夹，同时松开显微镊，排出门脉血管内残余血液，生理盐水冲洗管腔，调整血管位置避免扭曲，18 cm显微镊夹住套管尾翼，弯头显微镊牵开受体门静脉，将供体门静脉袖套插入受体门静脉管腔，见图2L，血管夹固定后6-0丝线结扎固定2道，见图2M，移除肝上下腔静脉阻断钳、门静脉血管夹，可见肝脏血液迅速充盈，见图2N。
(3)门脉优先的受体门脉反向套管、受体肝脏去除、肝上下腔静脉吻合：肝脏游离完成后，调转手术台，使大鼠头端对应术者，取出供体肝脏，放在下腹部稍偏左侧的纱布上，背侧在前，肝上下腔静脉在下，此时门静脉套管尾翼在后，看清门静脉方向无扭转后牵拉门静脉套管至纱布边缘，见图3A，B。尾翼挂在纱布边缘防治回缩及扭转，之后牵拉肝上下腔预置尼龙线，使肝上下腔静脉翻向上方，此时供体肝脏为正常解剖位置，相当于水平下移到下腹部，门静脉相当于折叠到肝上下腔静脉后方，利于套管，见图3C，D。牵拉受体门静脉预置线，移动纱布调整供体门静脉和受体门静脉位置以利于套管，静脉夹夹闭受体门静脉近幽门静脉端，经肝门注入3 mL 37 ℃生理盐水，观察肝脏局部发黄为宜。动脉夹夹闭肝门端门静脉，紧贴肝门离断门静脉，两端向前下牵拉预置线，后壁8-0带针缝线缝扎，三线悬吊，此时受体门静脉反向，开口朝向前下，生理盐水注入受体门静脉内，确保无气泡，见图3E，F；置入供体门静脉套管，移动牵引线尾端确保受体血管壁包绕套管，血管夹夹闭尾翼、血管壁及牵引线固定，6-0丝线结扎套管两道，见图3G，H，操作过程供体肝脏冰盐水纱布覆盖。血管夹夹闭受体肝下下腔静脉，眼科弯血管钳阻断肝上下腔静脉，注意夹闭约3 mm的膈肌防滑脱和压榨，橡皮筋牵拉，紧贴肝脏离断肝上下腔静脉，翻起受体肝脏，直视下离断肝下下腔静脉，保留右侧肾上腺筋脉入肝下下腔静脉段，移除受体肝脏，见图3I；牵拉供体肝脏植入原受体肝脏位置，供体肝上下腔静脉左右侧预置的8-0尼龙缝线与受体肝上下腔静脉左右侧两侧缝合，缝针内进外出，在血管壁外打结，牵拉缝合线不带针的尾端，充分显露吻合血管，自受体左向右连续缝合肝上下腔静脉后壁，见图3J；至右侧与留置线打结后连续缝合肝上下腔静脉前壁，见图3K；生理盐水冲洗血管腔内排出气泡，见图3L，与左侧线尾打结，完成肝上下腔静脉缝合。注意受体血管后壁缝合尽量在近膈肌处，供体血管后壁缝合尽量在近肝脏处，便于确认位置和折叠较多的血管以防漏血。移除肝上下腔静脉阻断钳、门静脉血管夹，见图3M，N，可观察肝脏血液迅速充盈，由黄变红，见图3O，腹腔注入37 ℃生理盐水，复温，见图3P。注意肝上下腔静脉吻合时需要牵拉调整肝脏，门静脉固定的动脉夹及静脉夹待肝上下腔静脉吻合完成后才能去除。

(4)肝下下腔静脉套管、胆管重建与关腹：受体肝下下腔静脉血管夹移至右侧肾静脉处取出血凝块，生理盐水充盈血管，置入供体肝下下腔静脉套管，套管尾翼在后，血管夹固定肝下下腔静脉壁和套管尾翼，6-0丝线结扎固定2道，去除阻断静脉的动脉夹和静脉夹，恢复肝下下腔静脉血流，见图2O。胆总管支架管插入受体胆总管管腔内，6-0丝线结扎固定，受体胆管固定线与供体胆管固定线结扎加固，见图2P，网膜覆盖肝门静脉处，腹腔注入左氧氟沙星液1 mL抗菌，3-0丝线连续缝合关腹。手术结束，皮下补充37 ℃生理盐水3 mL，电热毯、暖灯复暖，直至大鼠清醒，一般需要3 h左右，术后自由进水进食。

1.5 主要观察指标统计分析两组学习曲线时间、门静脉阻断时间、无肝期时间、肝下下腔静脉阻断时间、受体手术时间及术后生存情况等。
两组成活大鼠肝脏和肠道缺血再灌注损伤的组织学观察：将两组成活大鼠在移植后第7天获取的肝脏和空肠标本制作病理切片，行苏木精-伊红染色[15]，观察其组织学变化。
1.6 统计学分析采用 SPSS 20.0 软件进行统计学分析。对于符合正态分布的计量资料以x±s表示，组间差异采用独立样本的t检验；计数资料以率表示，组间差异采用卡方检验；大鼠移植分阶层效果的分析采用秩和检验，统计学差异采用双边检验，P < 0.05时表示差异有显著性意义。

讨论

传统的“二袖套法”建立大鼠肝移植模型中，需要大量的实验动物反复练习，无肝期时间、排斥反应程度、失血等都是影响肝移植模型大鼠成活的关键因素[16-18]，KAMADA等[9]提出无肝期的最长时间不能超过26 min的理论时间，否则大鼠就很难存活，该方法是去除受体肝脏，行肝上下腔静脉缝合吻合，再行门静脉套管吻合，吻合结束后开放门静脉和肝上下腔静脉，其无肝期时间为门静脉阻断时间或肝上下腔静脉阻断时间，需要在26 min内完成肝上下腔静脉吻合和门静脉套管。对于门静脉阻断时间，如去除肝脏，即使下腔静脉通畅，门静脉阻断30 min情况下仍有30%的死亡率[19]，如不去除肝脏，阻断肝门，肠道耐受瘀血的时间为35 min，如肠道瘀血超过40 min，肠道出现不可逆损伤导致大鼠死亡[20-21]，说明大鼠成活血流阻断时间的关键是肝上下腔静脉阻断时间不超过26 min。由于传统的门静脉套管时间为5-7 min，如果这个时间不去除肝脏，不阻断肝上下腔静脉，原理上在26 min内完成肝上下腔静脉吻合就可以了，加上门脉套管的时间仍能保证肠道不会出现不可逆损伤。据此作者在Kamada“二袖套法”的基础上采用门脉优先的方法，即在不去除肝脏、保持下腔静脉的血流通畅情况下，行门静脉的套管吻合，缩短了肝上下腔静脉的阻断时间约6 min，同时也缩短了肝下下腔静脉的阻断时间，对大鼠血流动力学影响小[22]，保持了循环的稳定性，减轻了大鼠肾脏的缺血再灌注损伤。传统手术方法先去除受体肝脏，在肝上下腔静脉阻断时间内必须完成肝上下腔吻合和门静脉套管吻合，而门脉优先法在肝上下腔静脉阻断时间内只需完成肝上下腔吻合，降低了手术的难度，提高了缝合的质量。传统门静脉套管需要肝脏上翻显露肝门，供体门静脉和受体门静脉移动均受限，套管需要反复训练；门脉优先法供体门静脉游离，移动纱布调整位置更易于套管吻合，因为肠道耐受缺血时间较长，套管时下腔静脉通畅，理论上套管吻合10 min内完成均可以，操作比较轻松，即使在操作失误的前提下，也有了充分的补救时间。从两组成活超过2 d的大鼠门脉阻断时间分析，虽然门静脉阻断时间两组没有显著性差异，数据显示门脉优先组门静脉阻断时间稍长于传统移植组，可能是相同时间内传统移植组大鼠没有成活所致；通过分阶层对比分析显示在第2个10例的手术效果门脉优先法优于传统移植法，随着移植例数的增加，可以看到第3个10例两组效果差异不明显；但如按照成活率80%为模型稳定来看，门脉优先组只需20例可达到模型稳定的效果，而传统手术组30例尚不能达到模型稳定，通过肝脏及空肠的苏木精-伊红染色图片可以看出，门脉优先反向吻合建立的大鼠肝移植模型在增加成活率、提高移植效果的同时，并没有增加肝脏和空肠的缺血再灌注损伤[23-25]。综合分析来看门脉优先的手术方式具有操作轻松、迅速建立稳定模型的优点。
文献报道三套管法时把受体肝脏稍翻向右下侧，供体肝脏原位套管，受体肝脏门静脉不剪断，以受体门脉为支撑进行门静脉套管[26-27]，作者也尝试了这种方法，由于供体肝脏游离，上翻显露供体肝门困难，供体肝脏门静脉套管后较短，如受体门静脉不离断，位置较深，供体门静脉和受体门静脉套管角度不好、张力大、操作困难。作者调转手术台，大鼠头端对应术者，把供体肝脏解剖位下移放在大鼠左下腹位置，把门静脉从肝脏后方折叠到肝脏上方，采用纱布边缘固定，受体门静脉离断后翻向下前方，称之为反向吻合法，视野清楚，套管角度好，受体门静脉冲洗后液体不易流出，避免套管后门静脉内气泡残留。
如门静脉供体套管脱落，再翻袖套结扎固定费时较长，大鼠很难成活[28]，作者在套管上刻5排鱼鳞样纹路解决结扎时需要寻找套管上刻痕的弊端(图1B)，受体套管时移动或意外牵拉牵引线容易导致受体门静脉滑脱，采用动脉夹固定，同时延长套管的长度为3 mm以便于双侧结扎，有效避免了供体套管脱落；肝上下腔静脉吻合完成后再开放血管夹，可有效避免肝脏摆放牵拉引起的静脉滑脱，增加了套管的可操作性。肝上下腔静脉吻合的质量和速度是肝移植大鼠成活的关键，作者在门脉优先法的基础上，通过乳胶手套缝合训练、采用肝上下腔静脉预置固定缝合线，缝线两端牵引显露、大鼠头端对应术者的良好术野显露有效地缩短了缝合时间，采用紧贴膈肌环的受体静脉后壁和紧贴肝脏的供体静脉后壁缝合、肝上下腔静脉左右两侧的前后壁重叠缝合提高了缝合质量，有效防止了血管漏血。由于研究生实验时间的不确定性，此次研究的大鼠均无禁食要求。门脉优先法的缺点是门静脉阻断期间无法观察血管内情况，无法冲出血管内可能的血栓，作者在移植成活大鼠术后7 d取标本时没有发现门静脉血栓[29-30]，但较长时间存活的大鼠是否有血栓形成尚需进一步观察。
总之，从结果看，门脉优先反向吻合的大鼠肝移植模型解决了移植过程中肝上下腔静脉阻断时间过长导致的术后大鼠存活率较低、反复套管失败以及术野显露困难的问题，为初学者迅速掌握大鼠肝移植模型的建立提供了一种较为快速可靠的方法，适合学习和推广。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

门脉优先反向吻合快速建立肝移植大鼠模型

Rapid establishment of rat liver transplantation model by portal vein preferential reverse anastomosis

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