负载碱性成纤维细胞生长因子温敏性壳聚糖-胶原复合水凝胶可减缓小鼠心肌梗死后心室的重构

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3150

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (16): 2472-2478.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3150

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负载碱性成纤维细胞生长因子温敏性壳聚糖-胶原复合水凝胶可减缓小鼠心肌梗死后心室的重构

陈思宇1，李燕楠1，颉丽英1，刘司麒1，范玉蓉2，房昌星2，张鑫2，权家宇2，左琳1

1细胞生理学省共建教育部重点实验室，山西医科大学生理学系，山西省太原市 030001；2山西医科大学影像学系，山西省太原市 030001

收稿日期:2020-03-09 修回日期:2020-03-14 接受日期:2020-04-22 出版日期:2021-06-08 发布日期:2021-01-07
通讯作者: 左琳，博士，副教授，细胞生理学省共建教育部重点实验室，山西医科大学生理学系，山西省太原市 030001
作者简介:陈思宇，女，1996年生，山西省晋中市人，汉族，山西医科大学在读硕士，主要从事心肌梗死的干细胞及心肌组织工程治疗研究。
基金资助:
山西省青年基金资助项目(201601D202106)，项目负责人：左琳；山西省回国留学人员科研基金资助项目(2014-036)，项目负责人：左琳；山西“1331工程”重点学科建设(1331KSC，XK201708)，项目参与者：左琳

Thermosensitive chitosan-collagen composite hydrogel loaded with basic fibroblast growth factor retards ventricular remodeling after myocardial infarction in mice

Chen Siyu1, Li Yannan1, Xie Liying1, Liu Siqi1, Fan Yurong2, Fang Changxing2, Zhang Xin2, Quan Jiayu2, Zuo Lin1

1Key Laboratory of Cellular Physiology, Ministry of Education, and the Department of Physiology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China; 2Department of Imaging, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China

Received:2020-03-09 Revised:2020-03-14 Accepted:2020-04-22 Online:2021-06-08 Published:2021-01-07
Contact: Zuo Lin, MD, Associate professor, Key Laboratory of Cellular Physiology, Ministry of Education, and the Department of Physiology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
About author:Chen Siyu, Master candidate, Key Laboratory of Cellular Physiology, Ministry of Education, and the Department of Physiology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
Supported by:
the Shanxi Youth Fund, No. 201601D202106 (to ZL); the Scientific Research Fund for Returned Overseas Students in Shanxi Province, No. 2014-036 (to ZL); the Shanxi “1331 Project” Key Subjects Construction, Nos. 1331KSC, XK201708 (to ZL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
壳聚糖：化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖，为一种重要的抗炎抗菌材料，具有良好的组织相容性，不仅具有抗炎活性，而且作为传递载体可携带移植细胞或细胞因子参与组织的修复，提高移植细胞存活率及移植部位驻留率。
碱性成纤维细胞生长因子：为一种传递发育信号，能促进中胚层和神经外胚层细胞分裂的多肽，在各种损伤中发挥抗炎、拮抗活性氧自由基、促进血管生成、刺激组织细胞分裂等作用；在体外能刺激细胞增殖、迁移，诱导纤溶酶原激活物及胶原酶活性，被广泛运用于血管、神经、肺、子宫等组织器官的再生。

背景：单独应用壳聚糖或胶原蛋白可改善心肌梗死区微血管密度，参与心肌梗死后的短期心肌修复，基于此课题组制备了温敏性壳聚糖-胶原复合水凝胶，证实其具有良好的理化性能，适合作为心肌组织工程支架材料。
目的：制备负载碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)的壳聚糖-胶原蛋白复合水凝胶，分析其理化性能、生物相容性及治疗小鼠心肌梗死的预后疗效。
方法：①将bFGF分别负载于壳聚糖-胶原蛋白复合水凝胶与壳聚糖水凝胶中，检测水凝胶中bFGF的释放效率；②将H9C2心肌细胞分别接种于负载bFGF的两种水凝胶中，采用CCK-8法检测细胞增殖；③构建C57BL/6J小鼠心肌梗死模型，随机分3组干预：空白组心肌梗死区注射PBS，对照组注射负载bFGF的壳聚糖水凝胶溶液，实验组注射负载bFGF的壳聚糖-胶原蛋白复合水凝胶溶液，术后28 d进行超声心动图检测与心肌组织学观察。实验获得山西医科大学伦理委员会批准。
结果与结论：①相较于壳聚糖水凝胶，壳聚糖-胶原蛋白复合水凝胶可促进凝胶中bFGF的释放；②相较于负载bFGF的壳聚糖水凝胶，负载bFGF的壳聚糖-胶原蛋白复合水凝胶可促进心肌细胞的增殖；③超声心动图显示，实验组、对照组的左心室射血分数与左室短轴缩短率均高于空白组(P < 0.05)，实验组的左心室射血分数与左室短轴缩短率均高于对照组(P < 0.05)；④心肌组织学观察显示，实验组、对照组的心肌梗死面积均小于空白组 (P < 0.05)，梗死区室壁厚度大于空白组(P < 0.05)；实验组的心肌梗死面积均小于对照组(P < 0.05)，梗死区室壁厚度大于对照组(P < 0.05)；⑤结果表明，负载bFGF的壳聚糖-胶原蛋白复合水凝胶具有良好的生物相容性，动物体内移植后可显著减缓心肌梗死后的心室重构。
https://orcid.org/0000-0002-9025-9352 (陈思宇)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 材料, 壳聚糖, 胶原蛋白, 水凝胶, 生长因子, 小鼠, 心肌梗死, 生物相容性, 心功能

Abstract: BACKGROUND: Chitosan or collagen alone can improve the microvessel density in myocardial infarction area and participate in the short-term myocardial repair after myocardial infarction. Based on this research group, thermosensitive chitosan-collagen composite hydrogel was prepared, which confirmed that it had good physical and chemical properties and was suitable for myocardial tissue engineering scaffold materials.
OBJECTIVE: To prepare the chitosan-collagen composite hydrogel loaded with basic fibroblast growth factor, and to analyze its physical and chemical properties, biocompatibility and prognosis in vivo after treatment of myocardial infarction in mice.
METHODS: (1) Basic fibroblast growth factor was loaded in chitosan-collagen composite hydrogel and chitosan hydrogel separately, and the release efficiency of basic fibroblast growth factor in hydrogels was detected. (2) H9C2 cardiomyocytes were seeded in two hydrogels loaded with basic fibroblast growth factor, and cell proliferation was detected by CCK8 assay. (3) C57BL/6J mice model of myocardial infarction was established and randomly divided into three groups. The blank group was injected PBS into the myocardial infarction area. The control group was injected with chitosan hydrogel loaded with basic fibroblast growth factor. The experimental group was injected with chitosan-collagen composite hydrogel loaded with basic fibroblast growth factor. Echocardiography and myocardial histology were performed 28 days after operation. The experiment was approved by Ethics Committee of Shanxi Medical University.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with chitosan hydrogel, chitosan-collagen composite hydrogel could promote the release of basic fibroblast growth factor in gel. (2) Compared with the chitosan hydrogel loaded with basic fibroblast growth factor, the chitosan-collagen composite hydrogel loaded with basic fibroblast growth factor could promote the proliferation of cardiomyocytes. (3) Echocardiography showed that the left ventricular ejection fraction and the shortening rate of left ventricular short axis in the experimental group and the control group were higher than those in the blank group (P < 0.05). Left ventricular ejection fraction and the shortening rate of left ventricular short axis in the experimental group were higher than those in the control group (P < 0.05). (4) The myocardial histological observation showed that the infarct area of the experimental group and the control group was smaller than that of the blank group (P < 0.05). The infarct area wall thickness of the experimental group and the control group was larger than that of the blank group (P < 0.05). The infarct area of the experimental group was smaller than that of the control group (P < 0.05), and the infarct area wall thickness of the experimental group was larger than that of the control group (P < 0.05). (5) The results showed that the chitosan-collagen composite hydrogel loaded with basic fibroblast growth factor had good biocompatibility, and animal transplantation could significantly reduce the ventricular remodeling after myocardial infarction.

Key words: materials, chitosan, collagen, hydrogel, growth factor, mice, myocardial infarction, biocompatibility, cardiac function

中图分类号:

陈思宇, 李燕楠, 颉丽英, 刘司麒, 范玉蓉, 房昌星, 张鑫, 权家宇, 左琳. 负载碱性成纤维细胞生长因子温敏性壳聚糖-胶原复合水凝胶可减缓小鼠心肌梗死后心室的重构[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2472-2478.

Chen Siyu, Li Yannan, Xie Liying, Liu Siqi, Fan Yurong, Fang Changxing, Zhang Xin, Quan Jiayu, Zuo Lin. Thermosensitive chitosan-collagen composite hydrogel loaded with basic fibroblast growth factor retards ventricular remodeling after myocardial infarction in mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(16): 2472-2478.

图/表（结果） 7

2.1 水凝胶成胶时间及孔径大小测定如表1所示，壳聚糖水凝胶和壳聚糖-胶原蛋白复合水凝胶的平均凝胶化时间无差异，说明复合水凝胶中胶原蛋白的加入并未显著影响甚至缩短凝胶化时间；相较于单纯壳聚糖水凝胶，复合水凝胶的孔径显著增大(P < 0.05)。扫描电镜结果显示，复合水凝胶的孔隙较单纯壳聚糖水凝胶更为丰富、致密(图1)，体现了复合水凝胶生物活性支架内部的稳定和均一，同时也利于黏附细胞的物质交换及携带物质的释放、迁移。

2.2 水凝胶的体外降解率根据图2的体外降解率统计分析图，第7天与单纯壳聚糖水凝胶比较，复合水凝胶支架的降解性能更优。前7 d，复合生物活性支架的未交联部分快速降解，利于在体携带细胞因子、基因、中药成分等的快速原位释放，同时由于心肌梗死前期尤其是前7 d内不良炎症反应发展迅速，亟需壳聚糖在抗炎方面的作用发挥；之后7 d降解速度减慢，更有利于体内外细胞在复合生物活性支架内的黏附，复合生物活性支架携带的药物成分也得以在梗死区域长时生效。

2.3 水凝胶中bFGF释放效率测定 bFGF在单纯壳聚糖水凝胶和复合水凝胶中的释放效率如图3所示。显而易见，这两种载药系统的释放曲线存在明显差异。早期(0-7 d)，bFGF在两种体系中的释放速率迅速，第7天时，单纯壳聚糖水凝胶和复合水凝胶释放bFGF已达到(53.72±3.19)%和(59.05±2.76)%。中期(7-21 d)，两种体系中bFGF的释放速率相对早期明显减慢，且各个时间点下两组均具有显著性差异(P < 0.05)。后期(21-42 d)，复合水凝胶释放bFGF的总量基本保持稳定，而单纯壳聚糖水凝胶的释放量缓慢增加。结果表明相较于单纯壳聚糖水凝胶，复合水凝胶体系可以有效促进负载因子bFGF的稳定释放。

.4 H9C2心肌细胞在负载bFGF的复合水凝胶表面的生物相容性检测结果第1，3，5，7天，3组细胞增殖均呈显著上升趋势，壳聚糖水凝胶组和复合水凝胶组的细胞增殖明显快于PBS对照组(P < 0.05)，同时复合水凝胶组也显著快于单纯壳聚糖水凝胶组(P < 0.05)。第9，11天，3组细胞增殖速度均减慢，但复合水凝胶组仍显著高于单纯壳聚糖水凝胶组(P < 0.05)和PBS对照组(P < 0.05，P < 0.01)，见图4。结果表明，壳聚糖-胶原蛋白复合水凝胶对H9C2心肌细胞增殖具有促进作用。

2.5 心肌梗死小鼠心功能测定采用超声心动图比较各组缺血前及心肌梗死后第1，7，14，28天的心率和心脏功能变化，检测结果如图5所示。心肌梗死后的第1，7，14天，实验组小鼠左心室射血分数和左心室短轴缩短率均显著高于对照组和空白组(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001)；心肌梗死后28 d时，实验组小鼠左心室射血分数和左心室短轴缩短率分别为(64.0±6.1)%和(30.0±2.2)%，显著高于对照组的(59.0±4.5)%和(24.0±1.5)%和空白组的(36.0±4.7)%和(19.0±2.5)%(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001)。各个时间点3组小鼠的心率总体维持在430次/min左右，组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。总体上的超声心动图结果显示：实验组心肌梗死模型小鼠的心功能明显改善，心脏功能指标在28 d内倾向于向正常心脏基线偏移。

2.6 心肌梗死小鼠心脏Masson染色分析小鼠心肌梗死后第28天，3组小鼠左室壁均可见不同程度的胶原沉积(图6A、B)，其中实验组心肌梗死瘢痕面积为(34.0±2.11)%，较对照组(40.8±3.26)%和空白组(57.3±3.98)%明显减小(P < 0.05，图6C)；实验组梗死区域瘢痕厚度为(1.23±0.12) mm，较对照组(1.18±0.06) mm和空白组(0.56±0.13) mm显著增加(P < 0.01，图6D)。以上结果证明，复合水凝胶心肌移植治疗能显著改善成年小鼠心肌梗死后的心腔扩张，并能明显阻止梗死瘢痕的扩展与室壁变薄。

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引言

随着社会经济和人口老龄化的加速发展，心血管疾病的发病率和死亡率均持续上升[1-3]，其中缺血性心脏病的高发病率中首当其冲即为心肌梗死 [4]。临床上的药物及冠状动脉搭桥治疗已极大改善了心肌梗死后的心肌缺血，降低了急性期的死亡率，但对心肌梗死晚期心肌细胞死亡所致的心室重构和心脏破裂尚无有效的治疗方法[5-8]。在过去的10年中，研究表明利用组织工程技术开发用于移植的工程心肌组织可以在晚期缓解瘢痕形成和心功能的进行性下降[7-10]。
在缺血性心脏病的应用中，具有原位凝胶机制的可注射水凝胶更容易保留在注射部位，其中温敏性水凝胶是首选，因为温和的凝胶过程对注射部位的心肌损伤较小[11-12]。壳聚糖是一种天然高分子材料，具有良好的生物降解性、细胞相容性和抗菌消炎性能 [13-14]，然而单一成分壳聚糖水凝胶的机械强度不受人工调节，缺乏良好的可塑性[14]。为了解决上述问题，应选择一种机械可控的结合材料。Ⅰ型胶原蛋白是胞外基质的重要组成部分，在复合支架中具有可调节的硬度和张力，将其与壳聚糖水凝胶复合可以充分发挥二者在复合水凝胶中的生物学作用[15-17]。课题组在前期研究中发现，将壳聚糖与Ⅰ型胶原蛋白按1∶1比例复合制备的水凝胶具有良好的理化性能，但对于该比例下复合水凝胶是否能携带细胞因子进而功能性改善心肌梗死未作进一步研究。
碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)治疗心肌梗死有确切疗效，能促进缺血组织的血管再生，但是bFGF存在原位驻留率低、半衰期短等缺点[18-20]。因此，实验在前期研究的基础上，将bFGF负载于壳聚糖-胶原蛋白复合水凝胶中，通过对水凝胶的凝胶化时间、孔径大小、降解率和生物相容性进行系统测定，进一步研究其移植治疗心肌梗死小鼠的预后疗效，为临床治疗心肌梗死提供基础可行性分析。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计观察性实验，随机动物对照实验。
1.2 时间及地点实验于2018年6月至2019年8月在山西医科大学生理学实验室完成。
1.3 材料 H9C2心肌细胞株(富衡生物，中国)；壳聚糖 (Mw =300 000，脱乙酰度≥75%，Sigma，USA)。
1.3.1 实验动物 3-6月龄雄性C57BL/6J小鼠，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，体质量18-22 g，许可证号：SCXK(京)2016-0002。
1.3.2 主要试剂胰蛋白酶(Sigma，USA)；Ⅰ型鼠尾胶原蛋白、青链霉素、β-甘油磷酸钠(北京索莱宝科技有限公司)；bFGF(PERPROTECH，USA)；抗FGF2抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；胎牛血清(ScienCell，USA)；DMEM/F12培养基、PBS(HyClone，USA)。
1.3.2 主要仪器 BJ-1CD超净工作台(上海博讯实业有限公司)；IX51荧光倒置显微镜(OLYMPUS，JAPAN)；HERAcell 150i恒温CO2培养箱(Thermo SCIENTIFIC，USA)；高压灭菌锅(Sanyo，JAPAN)；JSM-7900F扫描电镜(JEOL，JAPAN)；小动物麻醉机(NIDMARK Matrx VMR，USA)；小动物超声检测仪(S-Sharp，中国)；CELENA X高内涵成像系统(Logos Biosystems，KOREA)。
1.4 方法
1.4.1 温敏性壳聚糖-胶原复合水凝胶的制备室温下称取0.2 g壳聚糖粉末，高压蒸汽灭菌(121 ℃，20 min)，溶于10 mL DME/F12培养基中，600 r/min下充分搅拌3 h至完全溶解，得到2%壳聚糖溶液，性状为均一的淡黄色胶冻状液体，记为A液。随后制备45%的β-甘油磷酸钠溶液，0.22 µm滤器过滤除菌，记为B液。冰浴下将2.5 mL B液逐滴加入600 r/min搅拌下的10 mL A液中，滴加完毕后继续保持搅拌状态2 h，使其充分反应，调节pH值为7.35-7.45，得到温敏性壳聚糖-β-甘油磷酸钠溶液，4 ℃备用。
为保证制备的复合水凝胶成分中壳聚糖和Ⅰ型鼠尾胶原蛋白的质量比为1∶1，冰浴下将12.4 mL温敏性壳聚糖-β-甘油磷酸钠溶液均匀加入到2 mLⅠ型鼠尾胶原蛋白溶液 (1 g/L)中，搅拌至充分混合，注入6孔板，置于37 ℃细胞培养箱，待溶液成胶后即得到温敏性壳聚糖-胶原蛋白复合水凝胶。
1.4.2 凝胶化时间测定冰浴下，将上述混合均匀的未成胶壳聚糖(含β-甘油磷酸钠)水溶液和壳聚糖-胶原蛋白水溶液分别注入5 mL烧杯中，置于37 ℃培养箱中进行交联成胶，每隔1 min观察复合水溶液的成胶情况，倒置烧杯至溶液不再流动时即确定为成胶，可得壳聚糖水凝胶和壳聚糖-胶原蛋白复合水凝胶，记录成胶时间。
1.4.3 扫描电镜测定孔径大小将壳聚糖水凝胶和壳聚糖-胶原蛋白复合水凝胶冷冻并真空干燥后，将两组样本切成2 mm×2 mm的小块，作喷金处理，采用场发射扫描电子显微镜观察，扫描电镜对样品的横截面进行扫描，观察其表观形态并拍照记录。
1.4.4 体外降解分析将冷冻干燥后的壳聚糖水凝胶、壳聚糖-胶原蛋白复合水凝胶分别置于37 ℃ PBS中充分溶胀，达到平衡后(溶胀期间每隔1 h取出复合生物活性支架，用滤纸吸干表面水分并称质量记录，水凝胶质量不发生变化即为溶胀平衡)更换新鲜的PBS，置于37 ℃恒温培养箱中。每隔1 d记录复合生物活性支架的质量，并更换新鲜的PBS。复合生物活性支架的体外降解率=(mi/m0) ×100%，其中mi为降解过程中复合生物活性支架的质量，m0为复合生物活性支架的初始质量。
1.4.5 bFGF释放效率测定如之前制备壳聚糖水凝胶、壳聚糖-胶原蛋白水凝胶溶液，在其未温敏成胶的前提下加入1 mg/L的bFGF，吹打混匀之后置于24孔板内。待其37 ℃温敏成复合水凝胶之后每孔加入1 mL PBS，置于37 ℃恒温培养箱中，分别于1，3，5，7，14，28，35，42 d收集24孔板内的PBS(每个测试时间点之前不换液)，使用酶联免疫吸附试剂盒测定载药系统中bFGF的累积释放量。
1.4.6 CCK-8细胞增殖实验准备6个96孔板，将每个96孔板分为3组，分别加入100 μL PBS+100 μL H9C2细胞悬液、100 μL 壳聚糖-胶原蛋白复合水凝胶+100 μL H9C2细胞悬液、100 μL负载bFGF的壳聚糖-胶原蛋白复合水凝胶+ 100 μL H9C2细胞悬液，细胞浓度为2×108 L-1，每组设置6个复孔。首先将2种水凝胶溶液置于对应96孔板内，待其37 ℃温敏成复合水凝胶后即包被成功。置于体积分数5%CO2、37 ℃恒温培养箱中，于第1，3，5，7，9，11天分别从3组中吸取培养液上清100 μL，另在空白孔加入100 μL培养液，设置3复孔。在含培养液的孔内加入10 μL CCK-8试剂， 37 ℃培养箱内孵育3 h，用微孔板检测系统检测450 nm处的吸光度值。
1.4.7 小鼠心肌梗死模型制备及心肌注射实验
心肌梗死模型制备：取雄性C57BL/6J小鼠84只，异氟烷呼吸麻醉，仰卧固定，乙醇消毒小鼠切口部位皮毛。沿腋窝与胸骨下端连线，在其心脏部位第3，4肋间隙位置做 1.5 cm切口，以5-0丝线打一荷包松结后，钝性分离胸前壁肌肉组织，于第4肋间隙轻轻挤压，将心脏置于胸腔外，用6-0号丝线结扎冠状动脉左主降支，见心尖变灰白后，心肌梗死模型建立成功。
实验分组干预：将造模成功小鼠随机分3组，每组28只：空白组于梗死区域、梗死区周围及后壁区域3点注射PBS，对照组于梗死区域、梗死区周围及后壁区域3点注射负载bFGF的壳聚糖水凝胶溶液，实验组于梗死区域、梗死区周围及后壁区域3点注射负载bFGF的壳聚糖-胶原蛋白复合水凝胶溶液，注射总剂量20 μL。然后快速心脏复位，闭合肋间隙及胸壁肌肉及皮肤组织，将5-0丝线打好的松荷包关紧，心肌局部注射手术完成。动物饲养于山西医科大学，动物实验操作过程严格按照山西医科大学动物伦理学标准执行，并且获得山西医科大学伦理委员会批准。
小鼠心功能超声心动图检测：术后第1，7，14，28天，将两组小鼠仰卧位固定并异氟烷吸入麻醉，胸部脱毛，利用小动物超声检测仪，取小鼠胸骨旁左室长轴切面，依次检测M型心脏超声心动图，评估不同治疗组对心肌梗死小鼠心脏的功能调节。超声测量指标：左心室射血分数、左室短轴缩短率、心率。
小鼠心脏组织学观察：术后第1，7，14，28天超声心动图检测完成后，于各个时间点每组处死7只小鼠，中性甲醛冠状动脉冲灌整个心脏，并在甲醛中固定48 h，脱水并包埋心脏制作石蜡组织块，切片后进行Masson染色，用于评估心脏结构改变。
1.5 主要观察指标负载bFGF壳聚糖-胶原蛋白复合水凝胶的理化性质与修复心肌梗死的效果。
1.6 统计学分析实验数据均采用x±s表示，采用Stata 14.0进行统计分析，两组间差异比较用t检验，多组间差异比较采用单因素方差分析，P < 0.05认为差异有显著性意义，统计图采用Graph Pad Prism软件统计绘制。

讨论

心肌梗死作为威胁人类健康的重大疾病已成为亟待解决的社会医疗问题[21-22]。心肌梗死发生后，一方面心肌细胞容易滑落坏死，炎性细胞浸润增强，梗死区域扩展；另一方面左心室负性重构发生、室壁变薄，梗死区域室壁产生高紧张度和恶性力学循环[23]。温敏性水凝胶材料是可注射性心肌组织工程研究中一种优良的支架材料，可以随着温度的变化发生物理状态变化，其成胶条件与体内环境极为相似。由于这种特性，该水凝胶材料近年来被广泛应用于疫苗和药物控释及组织支架工程等领域，它既可单独应用也可作为细胞/药物运载工具对心肌梗死进行移植治疗[7，9]。
壳聚糖和胶原蛋白均为组织工程中常用的天然高分子材料，研究证实二者单独治疗心肌梗死可以改善梗死区微血管密度，参与心肌梗死后的短期心肌修复[24-27]。课题组前期研究制备了不同比例的壳聚糖-胶原蛋白复合水凝胶，傅里叶红外光谱分析已证实复合水凝胶支架内氢键、酰胺键和配位键生成，表明成分之间已经成功交联，且经材料理化分析表明壳聚糖和胶原蛋白质量比为1∶1时水凝胶性能优良，适合作为心肌组织工程复合材料应用。但对于复合水凝胶是否能负载细胞因子进一步功能性改善心肌梗死还未进一步研究。大量研究表明，bFGF注射治疗心肌梗死有确切疗效，能促进缺血组织的血管再生，但是bFGF存在原位驻留率低、半衰期短等缺点[28-30]。因此在前期研究的基础上，以壳聚糖和胶原蛋白为研究靶点制备温敏性复合水凝胶，首先进行理化性能和生物相容性分析，随后负载bFGF这一细胞因子进行在体移植治疗，进一步对壳聚糖-胶原蛋白复合水凝胶做整体评估。
由复合水凝胶的扫描电镜内部形貌研究可知，壳聚糖系列水凝胶的多孔样结构和胶原蛋白凝胶的层状结构合二为一，呈现复合水凝胶独特的蜂窝状内部结构。适当孔径大小的支架材料对于其的血管化和细胞摄取营养物质非常重要[31]。有研究表明，200-300 μm的孔径大小适合于细胞血管化和生长，而更小或更大的孔径却不适合细胞的伸展[32]。上述结果显示复合水凝胶孔径大小符合所述对孔径的要求，明显优于单纯壳聚糖水凝胶支架。这一实验结果也进一步证实了复合水凝胶在未来负载干细胞移植治疗心肌梗死的潜能。
结合bFGF的体外释放和复合水凝胶的体外降解结果分析可知，复合水凝胶的降解曲线与bFGF的释放速率、体内心肌梗死的发生进程一致。在组织工程领域，组织材料在体内外的降解过程直接关系到受损组织的修复效果[33]，一旦所选择的材料降解速度慢、降解程度难，将不利于坏死组织的更替及新生组织的恢复，长期无法降解对实验动物会产生安全隐患。细胞相容性实验结果表明，负载bFGF的单纯和复合水凝胶对H9C2心肌细胞均没有毒性作用[34]。同时，壳聚糖-胶原蛋白复合水凝胶对细胞具有显著的促增殖作用，课题组认为这可能和胶原蛋白是细胞外基质的重要组成部分有关[18]。
体内移植实验的超声心动图和Masson染色结果显示，负载bFGF的复合水凝胶心肌移植治疗成年心肌梗死小鼠能显著改善心功能，降低心肌梗死后心肌纤维化程度和梗死面积，并且可在一定程度上减缓心肌梗死后心室重塑的发生。这一修复结果的产生可能与bFGF、壳聚糖和胶原蛋白对心肌梗死后血管生成和侧支循环的促进作用有关[35]。有研究表明，心肌梗死发生后7 d内是发生心脏破裂的高发期[36]。此次实验Masson结果表明，相较于空白组和对照组，实验组心肌梗死小鼠第7，14，28天的梗死室壁变薄的情况明显减弱，心脏破裂导致的小鼠死亡率极低。
课题组前期研究发现质量比为1∶1的壳聚糖-胶原蛋白复合水凝胶材料理化性能优良，更适合心肌组织工程对生物材料的基本要求。经过此次实验进一步证实，壳聚糖-胶原蛋白水凝胶具有良好的生物相容性，当负载细胞因子bFGF进行小鼠心肌梗死移植时，壳聚糖-胶原蛋白复合水凝胶表现出较好的延缓不良心室重塑功能。未来实验将从复合水凝胶调控心肌梗死发生过程中的炎症反应，以减少心肌梗死早期过度炎症反应带来的不良心肌损伤，以及血管功能化方面等的作用，为壳聚糖-胶原蛋白复合水凝胶的功能解释提供新的方向。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

负载碱性成纤维细胞生长因子温敏性壳聚糖-胶原复合水凝胶可减缓小鼠心肌梗死后心室的重构

Thermosensitive chitosan-collagen composite hydrogel loaded with basic fibroblast growth factor retards ventricular remodeling after myocardial infarction in mice

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