骨肉瘤外泌体miR-1307与骨肉瘤细胞的增殖和凋亡

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2185

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (13): 2036-2042.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2185

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

骨肉瘤外泌体miR-1307与骨肉瘤细胞的增殖和凋亡

韩飞1，2，蒲沛东1，2，马青源1，2，朱洲均1，2，王梦雨1，2，王超1，2，石冲1，2，史晨辉1，王维山1

1石河子大学医学院第一附属医院骨科，新疆维吾尔自治区石河子市 832008；2石河子大学医学院，新疆维吾尔自治区石河子市 832008

收稿日期:2020-03-26 修回日期:2020-03-31 接受日期:2020-04-21 出版日期:2021-05-08 发布日期:2020-12-28
通讯作者: 王维山，主任医师，教授，硕士生导师，石河子大学医学院第一附属医院骨科，新疆维吾尔自治区石河子市 832008 史晨辉，主任医师，教授，博士生导师，石河子大学医学院第一附属医院骨科，新疆维吾尔自治区石河子市 832008
作者简介:韩飞，男，1989年生，河南省郑州市人，汉族，石河子大学医学院在读硕士，主要从事骨与软组织肿瘤的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81772407，81660374)，项目负责人：史晨辉；兵团中青年科技创新领导人才计划(2016BC001)，项目负责人：王维山

Exosomal miR-1307 of osteosarcoma and the proliferation and apoptosis of osteosarcoma cells

Han Fei1, 2, Pu Peidong1, 2, Ma Qingyuan1, 2, Zhu Zhoujun1, 2, Wang Mengyu1, 2, Wang Chao1, 2, Shi Chong1, 2, Shi Chenhui1, Wang Weishan1

1Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of the Medical College, Shihezi University, Shihezi 832008, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2Medical College, Shihezi University, Shihezi 832008, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2020-03-26 Revised:2020-03-31 Accepted:2020-04-21 Online:2021-05-08 Published:2020-12-28
Contact: Wang Weishan, Chief physician, Professor, Master’s supervisor, Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of the Medical College, Shihezi University, Shihezi 832008, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China Shi Chenhui, Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of the Medical College, Shihezi University, Shihezi 832008, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Han Fei, Master candidate, Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of the Medical College, Shihezi University, Shihezi 832008, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; Medical College, Shihezi University, Shihezi 832008, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81772407 and 81660374 (to SCH); the Youth Science and Technology Innovation Leadership Program of the Corps, No. 2016BC001 (to WWS)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
外泌体：大小为30-150 nm，由细胞膜融合并分泌到细胞外的小颗粒，其在细胞间相互联系中起着极其重要的作用，siRNA和miRNA可以通过它进行传递。
microRNA(miRNA)：是一种非常小的RNA分子，通过直接作用于mRNA的3'-UTR来抑制其表达，miRNA可作为一种致癌因子与肿瘤的发生发展有着密切的关系。

背景：研究表明骨肉瘤的发生与多种miRNAs的异常表达有关，外泌体miRNA在细胞内通讯中受到越来越多的关注。
目的：探讨骨肉瘤细胞来源外泌体miR-1307对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制。
方法：购买人骨肉瘤细胞系(143B、MG63、U2OS、Saos-2和SW1353)和人正常成骨细胞系(hFOB 1.19)。通过qRT-PCR实验检测miR-1307在5种骨肉瘤细胞系和正常成骨细胞系中的表达水平，最终选择SW1353作为此次骨肉瘤细胞功能验证的细胞系。培养SW1353骨肉瘤细胞和正常成骨细胞，通过差速离心法提取骨肉瘤细胞外泌体和正常成骨细胞外泌体，然后将miR-1307 inhibitor、miR-NC mimic转染至SW1353骨肉瘤细胞和正常成骨细胞，再提取SW1353骨肉瘤细胞外泌体和正常成骨细胞外泌体。取25 mg/L上述外泌体加入SW1353骨肉瘤细胞中干预24 h，采用CCK-8实验和流式细胞术观察骨肉瘤细胞的增殖和凋亡情况，使用Targetscan、MiRBase和miRDIP数据库在线预测miR-1307的靶基因，通过荧光素酶报告基因实验测定荧光素酶活性。使用qRT-PCR和Western blot检测骨肉瘤细胞中AGAP1的mRNA和蛋白表达水平。
结果与结论：①与hFOB 1.19成骨细胞外泌体相比，SW1353骨肉瘤细胞外泌体明显促进骨肉瘤细胞增殖并抑制凋亡(P < 0.01)；与SW1353骨肉瘤细胞外泌体相比，SW1353骨肉瘤细胞外泌体中miR-1307下调后，对SW1353骨肉瘤细胞的增殖作用明显降低而凋亡率明显升高
(P < 0.01)；②AGAP1被验证为miR-1307的直接靶基因，过表达miR-1307骨肉瘤细胞的AGAP1 mRNA和蛋白表达水平均明显低于miR-NC组(P < 0.01)。与miR-NC组相比，miR-1307明显抑制野生型PGLO-AGAP1-WT 3'-UTR的荧光素酶活性 (P < 0.05)；③结果表明，SW1353骨肉瘤细胞外泌体 miR-1307通过靶向AGAP1促进SW1353骨肉瘤细胞的增殖并抑制凋亡。

https://orcid.org/0000-0001-5940-0648(韩飞)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 骨, 骨肉瘤, 外泌体, miR-1307, AGAP1, 成骨细胞, 基因, 实验

Abstract: BACKGROUND: Studies have shown that the occurrence of osteosarcoma is associated with abnormal expression of various microRNAs (miRNAs). Exosomes (Exos) containing miRNAs get much more attentions in intracellular communications.
OBJECTIVE: To investigate the effects of exosomal miR-1307 from osteosarcoma on proliferation and apoptosis of osteosarcoma cells and its mechanism.
METHODS: Human osteosarcoma cell lines (143B, MG63, U2OS, Saos-2 and SW1353) and human normal osteoblastic cell line (hFOB 1.19) were purchased. The expression level of miR-1307 in five kinds of osteosarcoma cell lines and normal osteoblastic cell line was detected by qRT-PCR. Finally, SW1353 cell line was selected for functional verification of osteosarcoma cells. Osteosarcoma cells and normal osteoblasts were cultured. Osteosarcoma exosomes and normal osteoblastic exosomes were extracted by differential centrifugation. Then miR-1307 inhibitor and miR-NC mimic were transfected into SW1353 osteosarcoma cells and normal osteoblasts, and then SW1353 osteosarcoma cell exosomes and normal osteoblast exosomes were extracted. The above exosomes (25 mg/L) were added to SW1353 osteosarcoma cells to intervene for 24 hours. Cell proliferation assay and flow cytometry were used to observe the proliferation and apoptosis of osteosarcoma cells. Targetscan, miRBase and miRDIP databases were used to predict the target genes of miR-1307. The activity of luciferin was assayed by luciferase reporter gene. mRNA and protein expression levels of AGAP1 were assayed by qRT-PCR and western blot assay in osteosarcoma cells.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with hFOB 1.19-exosomes of osteoblasts, SW1353 osteosarcoma cell exosomes significantly promoted the proliferation and inhibited the apoptosis of osteosarcoma cells (P < 0.01). Compared with SW1353 osteosarcoma cell exosomes, the level of miR-1307 in SW1353 osteosarcoma cell exosomes was down-regulated; the proliferation of osteosarcoma cells was significantly decreased but the apoptosis rate was significantly increased (P < 0.01). (2) AGAP1 was verified as a direct target gene of miR-1307. Compared with miR-NC, miR-1307 significantly inhibited the mRNA and protein levels of AGAP1 (P < 0.01). Compared with miR-NC, miR-1307 significantly inhibited the luciferase activity of wild-type PGLO-AGAP1-WT 3'-UTR (P < 0.05). (3) The results show that exosomal miR-1307 of osteosarcoma promoted the proliferation and inhibited the apoptosis of osteosarcoma cells via targeting AGAP1.

Key words: bone, osteosarcoma, exosome, miR-1307, AGAP1, osteoblast, gene, experiment

中图分类号:

韩飞, 蒲沛东, 马青源, 朱洲均, 王梦雨, 王超, 石冲, 史晨辉, 王维山. 骨肉瘤外泌体miR-1307与骨肉瘤细胞的增殖和凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 2036-2042.

Han Fei, Pu Peidong, Ma Qingyuan, Zhu Zhoujun, Wang Mengyu Wang Chao, Shi Chong, Shi Chenhui, Wang Weishan. Exosomal miR-1307 of osteosarcoma and the proliferation and apoptosis of osteosarcoma cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(13): 2036-2042.

图/表（结果） 7

2.1 miR-1307在骨肉瘤细胞系中的表达水平 qRT-PCR结果表明，5种骨肉瘤细胞系中miR-1307的mRNA表达水平均明显高于正常成骨细胞hFOB 1.19细胞系，其中SW1353骨肉瘤细胞系中miR-1307的表达水平最高；与miR-NC mimic相比，SW1353骨肉瘤细胞转染miR-1307 mimic后miR-1307的mRNA表达水平升高约36倍；同样，与miR-NC inhibitor相比，转染miR-1307 inhibitor后miR-1307的mRNA表达水平下降约4倍(P < 0.01)，见图1。所以实验选择SW1353骨肉瘤细胞系进行体外细胞水平功能验证实验。

2.2 骨肉瘤细胞来源外泌体分离与鉴定结果透射电镜观察所提取的细胞外颗粒的形状是圆形囊泡与双层膜结构；纳米颗粒跟踪分析这些细胞外颗粒的直径范围为30-150 nm；以上数据表明，所分离出的SW1353骨肉瘤细胞来源的细胞外颗粒为外泌体，见图2。

2.3 miR-1307在SW1353骨肉瘤细胞来源外泌体中的表达水平 qRT-PCR结果表明，SW1353骨肉瘤细胞来源外泌体中miR-1307的mRNA表达水平明显高于hFOB1.19细胞来源外泌体组(P < 0.01)，见图3A。
2.4 SW1353骨肉瘤细胞来源外泌体对SW1353骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响 CCK-8实验结果表明，与正常对照组hFOB1.19细胞所提取的外泌体(hFOB1.19-Exos)相比，SW1353骨肉瘤细胞来源外泌体(OS-Exos)明显促进了SW1353骨肉瘤细胞的增殖。流式细胞术实验结果表明，SW1353骨肉瘤细胞来源外泌体处理的骨肉瘤细胞凋亡明显减少(P < 0.01)，见图3B-D。

2.5 抑制SW1353骨肉瘤细胞外泌体中miR-1307表达对SW1353骨肉瘤细胞的影响培养SW1353骨肉瘤细胞并转染miR-1307 inhibitor后提取外泌体，qRT-PCR结果表明，抑制SW1353骨肉瘤外泌体中miR-1307水平后，SW1353骨肉瘤细胞的增殖能力降低，而SW1353骨肉瘤细胞的凋亡水平明显升高，见图4。

2.6 miR-1307靶点的预测 Targetscan和miRBase数据库用于预测miR-1307的靶点，两个数据库的交集共有7个靶点，然后通过miRDIP数据库对7个靶点与miR-1307的综合评分进行比对，在这些预测的靶点中，只有AGAP1的评分分类是最高的，最终选择AGAP1进行进一步研究，见图5A。
2.7 miR-1307与AGAP1的结合方式骨肉瘤细胞过表达miR-1307后qRT-PCR和Western blot结果表明，AGAP1的mRNA和蛋白表达水平均明显低于miR-NC组(P < 0.01)。与miR-NC组相比，miR-1307明显抑制野生型PGLO-AGAP1-WT 3'-UTR的荧光素酶活性 (P < 0.05)，见图5B-F。

2.8 骨肉瘤细胞中AGAP1的表达 qRT-PCR和Western blot结果提示，与hFOB1.19成骨细胞相比，AGAP1在5种骨肉瘤细胞系中的mRNA表达水平以及在SW1353骨肉瘤细胞中的蛋白表达水平均明显降低(P < 0.01)，见图6。

2.9 miR-1307靶向AGAP1对SW1353骨肉瘤细胞的影响与miR-NC相比，miR-1307明显促进SW1353骨肉瘤细胞的增殖和抑制凋亡；与miR-1307相比，同时转染miR-1307和AGAP1后，其对SW1353骨肉瘤细胞增殖和凋亡水平的影响明显下降(P < 0.01)，见图7。

参考文献

[1] BROWN HK, TELLEZ-GABRIEL M, HEYMANN D. Cancer stem cells in osteosarcoma. Cancer Lett. 2017;386:189-195.
[2] MORENO F, CACCIAVILLANO W, CIPOLLA M, et al. Childhood osteosarcoma: Incidence and survival in Argentina. Report from the National Pediatric Cancer Registry, ROHA Network 2000-2013. Pediatr Blood Cancer. 2017; 64(10):e26533.
[3] BRICCOLI A, ROCCA M, SALONE M, et al. High grade osteosarcoma of the extremities metastatic to the lung: long-term results in 323 patients treated combining surgery and chemotherapy, 1985-2005. Surg Oncol. 2010;19(4): 193-199.
[4] MORTUS JR, ZHANG Y, HUGHES DP. Developmental pathways hijacked by osteosarcoma. Adv Exp Med Biol. 2014;804:93-118.
[5] POWERS M, ZHANG W, LOPEZ-TERRADA D, et al. The molecular pathology of sarcomas. Cancer Biomark. 2010;9(1-6):475-491.
[6] SHAO XJ, MIAO MH, XUE J, et al. The Down-Regulation of MicroRNA-497 Contributes to Cell Growth and Cisplatin Resistance Through PI3K/Akt Pathway in Osteosarcoma. Cell Physiol Biochem. 2015;36(5):2051-2062.
[7] SHEN K, MAO R, MA L, et al. Post-transcriptional regulation of the tumor suppressor miR-139-5p and a network of miR-139-5p-mediated mRNA interactions in colorectal cancer. FEBS J. 2014;281(16):3609-3624.
[8] XUE J, NIU J, WU J, et al. MicroRNAs in cancer therapeutic response: Friend and foe. World J Clin Oncol. 2014;5(4):730-743.
[9] MA C, ZHAN C, YUAN H, et al. MicroRNA-603 functions as an oncogene by suppressing BRCC2 protein translation in osteosarcoma. Oncol Rep. 2016;35(6): 3257-3264.
[10] LI BL, LU C, LU W, et al. miR-130b is an EMT-related microRNA that targets DICER1 for aggression in endometrial cancer. Med Oncol. 2013;30(1):484.
[11] QIU X, DOU Y. miR-1307 promotes the proliferation of prostate cancer by targeting FOXO3A. Biomed Pharmacother. 2017;88:430-435.
[12] HAN S, ZOU H, LEE JW, et al. miR-1307-3p Stimulates Breast Cancer Development and Progression by Targeting SMYD4. J Cancer. 2019;10(2): 441-448.
[13] SHIMOMURA A, SHIINO S, KAWAUCHI J, et al. Novel combination of serum microRNA for detecting breast cancer in the early stage. Cancer Sci. 2016;107(3): 326-334.
[14] CHEN WT, YANG YJ, ZHANG ZD, et al. MiR-1307 promotes ovarian cancer cell chemoresistance by targeting the ING5 expression. J Ovarian Res. 2017;10(1):1.
[15] CHEN S, WANG L, YAO B, et al. miR-1307-3p promotes tumor growth and metastasis of hepatocellular carcinoma by repressing DAB2 interacting protein. Biomed Pharmacother. 2019;117:109055.
[16] MINCIACCHI VR, FREEMAN MR, DI VIZIO D. Extracellular vesicles in cancer: exosomes, microvesicles and the emerging role of large oncosomes. Semin Cell Dev Biol. 2015;40:41-51.
[17] OHNO S, TAKANASHI M, SUDO K, et al. Systemically injected exosomes targeted to EGFR deliver antitumor microRNA to breast cancer cells. Mol Ther. 2013;21(1): 185-191.
[18] ALVAREZ-ERVITI L, SEOW Y, YIN H, et al. Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nat Biotechnol. 2011;29(4): 341-345.
[19] BRAICU C, TOMULEASA C, MONROIG P, et al. Exosomes as divine messengers: are they the Hermes of modern molecular oncology? Cell Death Differ. 2015; 22(1):34-45.
[20] RAIMONDI L, DE LUCA A, GALLO A, et al. Osteosarcoma cell-derived exosomes affect tumor microenvironment by specific packaging of microRNAs. Carcinogenesis. 2019:bgz130.
[21] WANG JW, WU XF, GU XJ, et al. Exosomal miR-1228 From Cancer-Associated Fibroblasts Promotes Cell Migration and Invasion of Osteosarcoma by Directly Targeting SCAI. Oncol Res. 2019;27(9):979-986.
[22] GONG L, BAO Q, HU C, et al. Exosomal miR-675 from metastatic osteosarcoma promotes cell migration and invasion by targeting CALN1. Biochem Biophys Res Commun. 2018;500(2):170-176.
[23] SHIMBO K, MIYAKI S, ISHITOBI H, et al. Exosome-formed synthetic microRNA-143 is transferred to osteosarcoma cells and inhibits their migration. Biochem Biophys Res Commun. 2014;445(2):381-387.
[24] OTTAVIANI G, JAFFE N. The epidemiology of osteosarcoma. Cancer Treat Res. 2009;152:3-13.
[25] TANG N, SONG WX, LUO J, et al. Osteosarcoma development and stem cell differentiation. Clin Orthop Relat Res. 2008;466(9):2114-2130.
[26] WANG B, QU XL, LIU J, et al. HOTAIR promotes osteosarcoma development by sponging miR-217 and targeting ZEB1. J Cell Physiol. 2019;234(5):6173-6181.
[27] ZHANG S, WANG Y, CHEN S, et al. Silencing of cytoskeleton-associated protein 2 represses cell proliferation and induces cell cycle arrest and cell apoptosis in osteosarcoma cells. Biomed Pharmacother. 2018;106:1396-1403.
[28] SANG W, ZHU L, MA J, et al. Lentivirus-Mediated Knockdown of CTHRC1 Inhibits Osteosarcoma Cell Proliferation and Migration. Cancer Biother Radiopharm. 2016;31(3):91-98.
[29] 崔国宁,刘喜平,虎峻瑞,等.不同来源外泌体与肿瘤发病相关性的研究与进展[J].中国组织工程研究,2020,24(13):2095-2101.
[30] LIN F, YIN HB, LI XY, et al. Bladder cancer cell‑secreted exosomal miR‑21 activates the PI3K/AKT pathway in macrophages to promote cancer progression. Int J Oncol. 2020;56(1):151-164.
[31] DUAN B, SHI S, YUE H, et al. Exosomal miR-17-5p promotes angiogenesis in nasopharyngeal carcinoma via targeting BAMBI. J Cancer. 2019;10(26):6681-6692.
[32] HE L, ZHU W, CHEN Q, et al. Ovarian cancer cell-secreted exosomal miR-205 promotes metastasis by inducing angiogenesis. Theranostics. 2019;9(26):8206-8220.
[33] SHANG D, XIE C, HU J, et al. Pancreatic cancer cell-derived exosomal microRNA-27a promotes angiogenesis of human microvascular endothelial cells in pancreatic cancer via BTG2. J Cell Mol Med. 2020;24(1):588-604.
[34] CHE X, JIAN F, CHEN C, et al. PCOS serum-derived exosomal miR-27a-5p stimulates endometrial cancer cells migration and invasion. J Mol Endocrinol. 2020;64(1):1-12.
[35] NIE Z, STANLEY KT, STAUFFER S, et al. AGAP1, an endosome-associated, phosphoinositide-dependent ADP-ribosylation factor GTPase-activating protein that affects actin cytoskeleton. J Biol Chem. 2002;277(50):48965-48975.
[36] MEURER S, PIOCH S, WAGNER K, et al. AGAP1, a novel binding partner of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase. J Biol Chem. 2004;279(47):49346-49354.
[37] BENDOR J, LIZARDI-ORTIZ JE, WESTPHALEN RI, et al. AGAP1/AP-3-dependent endocytic recycling of M5 muscarinic receptors promotes dopamine release. EMBO J. 2010;29(16):2813-2826.
[38] TSUTSUMI K, NAKAMURA Y, KITAGAWA Y, et al. AGAP1 regulates subcellular localization of FilGAP and control cancer cell invasion. Biochem Biophys Res Commun. 2020;522(3):676-683.

引言

骨肉瘤是一种常发生于青少年并且生长在膝关节周围的恶性肿瘤[1]。据相关统计，全世界骨肉瘤的发病率正在逐渐增加[2]。骨肉瘤的常见并发症是肺转移和病理性骨折，转移性骨肉瘤患者其病情会进一步加重[3]，其典型的临床症状包括疼痛、关节活动受限和局部肿胀。虽然患者经相关治疗后生命得到一定的延长，但最终身心健康却受到严重的影响[4]。骨肉瘤的发生发展是多因素多阶段累积作用的结果，包括环境因素、遗传因素等[5]。因此，研究骨肉瘤的发病机制并且优化治疗策略是非常迫切和必要的。
miRNA是一种非常小的RNA分子，通过直接作用于mRNA的3'-UTR来抑制其表达[6]。据报道，miRNA即可作为一种致癌因子也可作为一种抑癌因子[7]，miRNA可以调控癌细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡等生物学活动[8]。研究发现，miR-603通过靶向BRCC2促进骨肉瘤细胞的增殖和侵袭[9]，miR-130b通过靶向NKD2促进骨肉瘤细胞的发生与发展[10]。有关miR-1307在肿瘤中的作用已有多篇报道，例如miR-1307
通过靶向FOXO3A促进前列腺癌细胞的增殖[11]，并且过表达miR-1307可抑制p27和p21的水平。除此之外，miR-1307
也可以通过靶向SMYD4促进乳腺癌的生长，miR-1307在早期乳腺肿瘤组织中显著升高，过表达miR-1307还可显著促进裸鼠非致瘤性乳腺上皮细胞的增殖、转化和肿瘤形成，沉默miR-1307表达不仅可以抑制裸鼠乳腺癌细胞的增殖，还可以延缓乳腺癌细胞的成瘤时间[12]。临床研究发现，miR-1307、
miR-6861-5p、miR-4634、miR-1246和miR-6875-5p
几种miRNA的组合可以用于检测早期乳腺癌，其检测准确率高达89.7%[13]。miR-1307通过靶向ING5促进卵巢癌细胞的增殖并抑制凋亡，研究还表明miR-1307在卵巢癌细胞系A2780/Taxol中过表达，miR-1307的过表达或缺失可以促进或抑制化疗耐药的作用[14]。另外，研究发现miR-1307通过靶向DAB2促进肝细胞癌的转移和生长，与邻近的非肿瘤组织以及正常肝细胞系LO2相比，miR-1307在肝癌细胞中明显高表达，此外值得注意的是，高水平miR-1307提示患者的临床预后较差[15]。由此可见，miR-1307很可能为致癌miRNA，
并且已将miR-1307用于早期乳腺癌的临床诊断和肝癌的临床预后判断，说明其具有潜在研究价值和临床应用前景，但是它在骨肉瘤中的作用及其基本的分子机制目前为止尚不清楚。
外泌体大小为30-150 nm，由细胞膜融合并分泌到细胞外的小颗粒[16]，其在细胞间相互联系中起着极其重要的作用，siRNA和miRNA可以通过它进行传递[17-18]。已有研究表明，肿瘤细胞来源外泌体可通过转移肿瘤细胞中对肿瘤生长有正向作用的小分子，进而促进肿瘤细胞的增殖、侵袭及耐药性[19]。研究表明，骨肉瘤细胞来源外泌体在骨代谢方面的作用与一些特定的miRNAs相关，并证明这些外泌体参与了破骨细胞分化和骨吸收活性，此外U-2OS骨肉瘤细胞来源外泌体中miRNA-155-5p低表达和miRNA-375高表达[20]。骨肉瘤细胞来源外泌体促进了人脐静脉内皮细胞的侵袭性和刺激人脐静脉内皮细胞产生高水平的促血管生成因子，并通过成管实验证明了内皮细胞样结构的形成[20]，并且还发现正常对照组成骨细胞分泌的外泌体并不能刺激血管生成和破骨细胞生成。除此之外，研究发现癌相关成纤维细胞来源外泌体
miR-1228通过直接靶向SCAI促进了骨肉瘤细胞的迁移和侵袭[21]。骨肉瘤来源外泌体miR-675通过靶向CALN1促进hFOB 1.19成骨细胞的迁移和侵袭[22]。通过在间充质干细胞中转染miR-143然后提取外泌体作用于骨肉瘤细胞，发现间充质干细胞外泌体miR-143可以抑制骨肉瘤细胞的迁移[23]。但是，骨肉瘤细胞衍生的外泌体及外泌体内的miRNA对骨肉瘤细胞自身的影响到目前为止尚不清楚，因此仍需进一步研究。
该实验探讨骨肉瘤细胞来源外泌体对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响，进一步验证骨肉瘤细胞外泌体中的miR-1307是否通过靶向AGAP1调控骨肉瘤细胞的增殖和凋亡，从而为骨肉瘤的治疗及预后提供实验依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外水平进行分子生物学和细胞学实验。
1.2 时间及地点实验于2019年5月至2020年1月在石河子大学医学院骨科重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞的选择骨肉瘤细胞系(143B，MG63，U2OS，Saos-2，SW1353)和成骨细胞hFOB 1.19细胞系均购自美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection，ATCC)。
1.3.2 实验主要试剂 miR-1307-3p mimic、miR-NC mimic、miR-1307-3p inhibitor、pcDNA3.1-AGAP1 vector(锐博，中国)；Lipofectamine RNAiMAX、Trizol 裂解液(Invitrogen, 美国)；无外泌体血清(SBI，美国)；青链霉素、PBS、胎牛血清及RPMI-1640培养基(Hyclone, 美国)；荧光素酶试剂盒、CCK-8检测试剂(Promega，美国)；胰蛋白酶消化液(Gibco，美国)；BCA蛋白含量检测试剂盒和细胞凋亡试剂盒(凯基，中国)；GAPDH优质内参(康成，中国)；兔抗AGAP1(Abcam，英国)；蛋白预染Marker(Thermo，美国)；RIPA裂解液(碧云天，中国)；反转录试剂盒和qRT-PCR试剂盒(ABI，美国)；96孔板及6孔板(Corning，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞的复苏及培养解冻所购买的骨肉瘤细胞和正常成骨细胞，将0.25% EDTA胰蛋白酶溶液(1.0-2.0 mL)加入细胞培养皿中，待细胞从培养皿底部脱落下来且形状为圆形时，立刻终止消化，加入含体积分数为10%胎牛血清、1%青链霉素的RPMI-1640培养基，放入37 °C，体积分数为5%CO2培养箱。
1.4.2 骨肉瘤细胞外泌体的提取、分离及鉴定分别培养SW1353骨肉瘤细胞和hFOB 1.19成骨细胞，待细胞贴壁生长并且培养皿中细胞量达到80%时，去除上清液并加入一定量的无外泌体血清的RPMI-1640培养基培养，72 h后收集上清液，进行差速离心，离心所得上清液即为细胞外颗粒，用PBS混匀，放入-80 ℃冰箱保存。吸取10 μL离心所得样本置于铜网上，加入20 μL 2%醋酸双氧铀染色5 min。将上述染色完成的样本放在灯下10-15 min，透射电镜观察、拍照，纳米颗粒跟踪分析仪器对所提取的细胞外颗粒大小进行分析。miR-NC inhibitor或miR-1307 inhibitor转染至SW1353骨肉瘤细胞中，48 h后按上述方法提取SW1353骨肉瘤细胞所分泌的外泌体。
1.4.3 细胞转染首先从-20 ℃冰箱中取出miR-1307 mimic、miR-NC mimic、miR-1307 inhibitor或miR-NC inhibitor，分别
配制A液和B液，A液：取9 μL mimic或inhibitor，加入300 μL Opti-MEM试剂，混匀后静置5 min；B液：取RNA-iMAX试剂18 μL加入300 μL Opti-MEM试剂，混匀后静置
5 min，然后将A和B两种混合液混到一起并静置5 min以备用；将SW1353骨肉瘤细胞按细胞浓度为2×108 L-1接种于6孔板，其中3孔为正常对照组，另外3孔为实验组，分别向正常对照组和实验组中加入209 μL已配制好的转染试剂，其中正常对照组转染miR-NC mimic或miR-NC inhibitor，实验组转染miR-1307 mimic或miR-1307 inhibitor，轻轻摇匀6孔板后将其放到细胞培养箱内静置培养48 h。
1.4.4 CCK-8实验检测骨肉瘤细胞的增殖能力取25 mg/L SW1353骨肉瘤细胞外泌体、hFOB 1.19成骨细胞外泌体、经miR-NC inhibitor转染完成的SW1353骨肉瘤细胞外泌体或经miR-1307 inhibitor转染完成的SW1353骨肉瘤细胞外泌体。调整SW1353骨肉瘤细胞浓度为1×108 L-1，吸取100 μL细胞混匀液加入96孔板中，待SW1353骨肉瘤细胞密度约80%时加入外泌体，然后于0，24，48，72 h分别向96孔板中加入10 μL CCK-8 cellTiter96AQ检测试剂液，继续培养4 h，酶标仪检测并记录450 nm波长处吸光度值。另外，SW1353骨肉瘤细胞中分别转染miR-NC mimic、miR-1307 mimic或miR-1307
mimic+AGAP1，48 h后观察对SW1353骨肉瘤细胞增殖能力的影响。
1.4.5 流式细胞术检测骨肉瘤细胞凋亡能力取25 mg/L的SW1353骨肉瘤细胞外泌体、hFOB 1.19成骨细胞外泌体、经miR-NC inhibitor转染完成的SW1353骨肉瘤细胞外泌体或经miR-1307 inhibitor转染完成的SW1353骨肉瘤细胞外泌体。调整SW1353骨肉瘤细胞浓度为1×109 L-1，待SW1353骨肉瘤细胞密度约80%时加入外泌体干预24 h，加入3 μL Annexin
V-FITC避光孵育15 min，然后加入500 μL预冷的PBS清洗细胞，加入3 μL 碘化丙啶溶液孵育10 min，上流式细胞仪检测。另外，SW1353骨肉瘤细胞中分别转染miR-NC mimic、miR-1307 mimic或miR-1307 mimic+AGAP1，48 h后观察对SW1353骨肉瘤细胞凋亡能力的影响。
1.4.6 qRT-PCR检测miR-1307及AGAP1的表达水平 ①qRT-PCR检测hFOB 1.19细胞和5种骨肉瘤细胞以及hFOB 1.19细胞外泌体和SW1353骨肉瘤细胞外泌体中miR-1307表达水平；②qRT-PCR检测转染miR-1307 mimic或miR-NC mimic、miR-1307 inhibitor或miR-NC inhibitor的SW1353骨肉瘤细胞中的miR-1307表达水平；③qRT-PCR检测SW1353骨肉瘤细胞转染miR-1307 inhibitor或miR-NC inhibitor后所提取的骨肉瘤细胞外泌体中的miR-1307表达水平；④qRT-PCR检测转染miR-1307 mimic或miR-NC mimic后SW1353骨肉瘤细胞中的AGAP1表达水平；⑤qRT-PCR检测hFOB 1.19细胞和5种不同骨肉瘤细胞中的AGAP1表达水平。上述细胞或外泌体中加入Trizol裂解液获得总RNA。根据试剂盒TaqMan®MicroRNA
Reverse Transcription Kit计算反应体系，qRT-PCR引物设计(序列：5'-3')，GAPDH：F：GCT CAT TTG CAG GGG GGA G，R：GTT GGT GGT GCA GGA GGC A；U6：F：CTC GCT TCG GCA GCA CA，R：AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT；AGAP1：F：TAC GGG CTG AAT GTG GA，R：GAG GAA TGG CTG GGA GA；miR-1307：F：ACT CGG CGT GGC GTC G，R：TCC TCT CCT CCT TCC TCT TC。总的反应体系为25 μL，参照试剂盒说明书设置反应温度及时间。最终所得结果根据公式2-∆∆Ct进行统计计算。
1.4.7 Western blot检测AGAP1蛋白表达水平 Western blot检测SW1353骨肉瘤细胞以及转染miR-1307 mimic或miR-NC
mimic后SW1353骨肉瘤细胞中的AGAP1蛋白表达水平。RIPA法提取总蛋白，通过BCA进行蛋白定量；安装好电泳装置，接通电源，先调制恒压80 V电泳30 min，再恒压120 V电泳60-90 min；将封闭后的膜用1×TBST溶液洗涤，加入一抗anti-AGAP1(1∶200稀释)，anti-GAPDH(1∶1 000稀释)孵育过夜，加入二抗孵育1 h，显影。
1.4.8 双荧光素酶报告基因实验首先将AGAP1 3'-UTR序列进行扩增，构建野生型AGAP1 3'-UTR(WT)和突变型AGAP1 3'-UTR(MUT)。将所制备好的cDNA模板稀释至20倍体积，取0.5 μL进行扩增；目的片段的回收：1%凝胶电泳，90 V 30 min；酶切产物的回收：1%凝胶电泳，90 V 30 min后回收至干净EP管中；质粒共转染48 h，用双荧光素酶报告基因测定荧光素酶活性。
1.5 主要观察指标体外细胞实验检测SW1353骨肉瘤细胞外泌体对骨肉瘤细胞增殖及凋亡的影响，并且验证是否通过靶向AGAP1调控以上作用。
1.6 统计学分析用SPSS 20.0统计软件分析所得数据，数据以x±s表示，采用t检验比较两组数据之间的差异，采用单因素方差分析进行多组间的比较，两两间比较采用SNK-q检验，检验水准α=0.05。

讨论

骨肉瘤是一种高度恶性并且极其容易转移的肿瘤，其发病年龄呈现2个高峰，第1个年龄高峰为20岁左右，第2个年龄高峰为65岁以上[24]。目前的相关研究表明，导致骨肉瘤发病的主要机制包括抑癌基因失活、分子变化、细胞信号通路的失控、表观遗传和染色体突变等[25]。虽然通过化疗使非转移性患者的5年存活率达到60%-70%，但因化疗药物不良反应较大并且容易发生耐药，所以找到一种更有前途的治疗策略是非常迫切和必要的。
为了解miR-1307在骨肉瘤细胞中是否异常表达，实验首先通过qRT-PCR检测了miR-1307在5种骨肉瘤细胞系和hFOB 1.19正常成骨细胞系中的表达水平，结果表明miR-1307
在5种骨肉瘤细胞系中的表达水平均明显高于对照组。SW1353作为骨肉瘤实验用细胞系已在多篇研究中报道。在SW1353骨肉瘤细胞中，HOTAIR通过消除miR-217的作用和靶向ZEB1从而促进骨肉瘤的发展[26]。同样，在SW1353骨肉瘤细胞中，沉默细胞骨架相关蛋白2(CKPA2)可以诱导骨肉瘤细胞的凋亡和周期阻滞并抑制骨肉瘤细胞增殖[27]。另外，在SW1353骨肉瘤细胞中，CTHRC1缺失可以抑制骨肉瘤细胞的迁移和增殖[28]。由于miR-1307在SW1353骨肉瘤细胞中的mRNA表达水平最高，所以研究最终选择SW1353作为此次骨肉瘤细胞功能验证的细胞系。
与对照组相比，骨肉瘤细胞转染miR-1307 mimic后miR-1307的mRNA表达水平升高约36倍；同样骨肉瘤细胞转染miR-1307 inhibitor后miR-1307的mRNA表达水平下降约4倍，表明通过这种转染方式可以满足实验的需要。培养骨肉瘤细胞和hFOB 1.19正常成骨细胞，通过差速离心法提取骨肉瘤细胞外泌体和正常成骨细胞外泌体，qRT-PCR结果显示骨肉瘤细胞外泌体中的miR-1307 mRNA表达水平明显高于正常成骨细胞外泌体，说明骨肉瘤细胞外泌体可以作为miR-1307的载体。然后分别将骨肉瘤细胞外泌体或正常成骨细胞外泌体加入到骨肉瘤细胞中观察对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响，结果显示：骨肉瘤细胞外泌体明显促进骨肉瘤细胞增殖并抑制骨肉瘤细胞凋亡，也说明骨肉瘤外泌体以旁分泌的方式参与了骨肉瘤细胞生长的调控。为了进一步了解骨肉瘤外泌体对骨肉瘤细胞的作用是否与骨肉瘤外泌体中的miR-1307有关，实验首先培养骨肉瘤细胞并转染miR-1307
inhibitor后再提取骨肉瘤细胞所分泌的外泌体；与miR-NC inhibitor组相比，当骨肉瘤细胞转染miR-1307 inhibitor后，所分泌的外泌体中miR-1307水平明显降低，也说明通过此种方式可以实现骨肉瘤外泌体中miR-1307水平的抑制。当骨肉瘤细胞外泌体中miR-1307水平受到抑制后，其对骨肉瘤细胞的增殖作用也明显下降，骨肉瘤细胞的凋亡率却明显升高，结果表明骨肉瘤细胞外泌体中的miR-1307参与了骨肉瘤生长的调控。
研究通过Targetscan、MiRBase和miRDIP数据库预测了AGAP1是miR-1307的靶基因；在骨肉瘤细胞中过表达miR-1307后可以明显抑制AGAP1的mRNA和蛋白表达，表明AGAP1可能是miR-1307在骨肉瘤细胞中的调控靶基因。为了进一步确定miR-1307与AGAP1之间的结合关系，研究进行了荧光素酶报告基因实验，结果表明miR-1307通过靶向结合AGAP1的 3’-UTR，继而抑制了AGAP1的mRNA和蛋白表达。AGAP1在5种不同骨肉瘤细胞的mRNA表达水平明显低于hFOB 1.19成骨细胞；另外，AGAP1在SW1353骨肉瘤细胞中的蛋白表达水平也明显低于hFOB 1.19成骨细胞，提示AGAP1可能是骨肉瘤潜在的治疗靶点。最后研究验证了miR-1307是否通过靶向AGAP1继而调控骨肉瘤细胞的增殖与凋亡作用，与miR-NC组相比，过表达miR-1307后可以明显促进骨肉瘤细胞的增殖和抑制骨肉瘤细胞的凋亡，当补充AGAP1后可以明显弱化miR-1307对骨肉瘤细胞的上述调控作用，这些研究结果提示miR-1307至少部分通过靶向AGAP1促进骨肉瘤细胞的增殖并抑制骨肉瘤细胞的凋亡。
已有多项研究表明肿瘤细胞来源外泌体参与了肿瘤发生与发展的正向调控[29]。例如，膀胱癌细胞分泌的外泌体miR-21通过激活巨噬细胞中的PI3K/AKT信号通路促进膀胱癌的发展[30]；鼻咽癌细胞外泌体miR-17-5p通过靶向BAMBI促进鼻咽癌的血管生成[31]；卵巢癌细胞外泌体miR-205可以促进卵巢癌的发展[32]；胰腺癌细胞来源外泌体miR-27a通过靶向BTG2促进胰腺癌人微血管内皮细胞的血管生成[33]；多囊卵巢综合征血清来源外泌体miR-27a-5p可以刺激子宫内膜癌细胞的迁移和侵袭[34]。由此可见，肿瘤来源外泌体可以作为miRNA的载体从而调控着肿瘤细胞的生长与代谢。另外，间充质干细胞外泌体miR-143可以抑制骨肉瘤细胞的迁移；虽然间充质干细胞外泌体转移的miR-143较少，但也足以抑制骨肉瘤细胞的迁移；外泌体中的Ago2等蛋白复合体可能与miR-143结合以作用于受体细胞中的靶基因[23]。在该研究中，作者发现miR-1307在骨肉瘤细胞外泌体中高表达并调控着骨肉瘤细胞的增殖和凋亡；与此同时，研究也发现当骨肉瘤细胞外泌体中的miR-1307水平下降后其对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的调控能力也明显下降，但也不是完全失去了对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的调控作用，所以不能排除骨肉瘤外泌体内的其他miRNAs或小分子也参与并调控骨肉瘤细胞增殖和凋亡的可能性。
miRNA通过抑制靶基因的3'UTR来影响靶基因的表达水平。该研究表明AGAP1是miR-1307介导的骨肉瘤细胞外泌体调控骨肉瘤细胞作用的直接靶点。AGAP1对肌动蛋白和内吞室有一定的影响[35]，是一种新的对一氧化氮敏感的鸟苷环化酶的结合伴侣[36]。BENDOR等[37]发现AGAP1可以调节M5的内吞循环，促进多巴胺的释放。TSUTSUMI等[38]研究表明AGAP1可以调节FilGAP并控制乳腺癌和神经胶质瘤细胞的侵袭。该研究表明，AGAP1介导了miR-1307对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的调控，但也可能存在着miR-1307以外的其他靶基因，这些靶基因也可能影响骨肉瘤细胞的生长。
该研究发现骨肉瘤细胞外泌体以旁分泌的方式促进骨肉瘤细胞的增殖和抑制骨肉瘤细胞的凋亡，并表明骨肉瘤细胞外泌体作为miR-1307的载体调控着骨肉瘤细胞的增殖和凋亡。此外，AGAP1被验证为miR-1307的直接靶基因，并介导骨肉瘤细胞外泌体miR-1307对骨肉瘤细胞产生一定影响。该研究也在一定程度上弥补了骨肉瘤细胞外泌体对骨肉瘤细胞自身影响和作用的空缺，为今后骨肉瘤提供新的治疗策略和分子靶点。虽然实验检测了骨肉瘤细胞中miR-1307和AGAP1的表达水平以及骨肉瘤细胞外泌体中miR-1307的表达水平，但并未在体外动物模型中验证骨肉瘤细胞外泌体miR-1307对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响。在未来的研究中，将在动物模型中检测骨肉瘤细胞外泌体是否可以调控骨肉瘤的生长、发育、血管生成和转移。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

骨肉瘤外泌体miR-1307与骨肉瘤细胞的增殖和凋亡

Exosomal miR-1307 of osteosarcoma and the proliferation and apoptosis of osteosarcoma cells

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[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	胡凯, 乔晓红, 张永红, 王栋, 秦泗河. 空心螺钉和钢板内固定修复移位型跟骨关节内骨折：基于15篇随机对照试验的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1465-1470.
[3]	黄登承, 王志科, 曹学伟. 体外冲击波疗法治疗中老年膝骨关节炎短期疗效对比的荟萃分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1471-1476.
[4]	徐峰, 康辉, 魏坦军, 席金涛. 椎弓根螺钉不同固定方法治疗胸腰椎骨折的生物力学分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1313-1317.
[5]	姜勇, 罗翼, 丁永利, 周勇, 闵理, 唐凡, 张闻力, 段宏, 屠重棋. 骶骨精准切除影响骨盆稳定性的冯米斯应力特征及临床验证[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1318-1323.
[6]	张同同, 王中华, 文杰, 宋玉鑫, 刘林. 3D打印模型在颈椎肿瘤手术切除与重建中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1335-1339.
[7]	张宇, 田少奇, 曾国波, 胡川. 初次下肢全关节置换后发生心肌梗死的危险因素[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1340-1345.
[8]	韦玮, 李剑, 黄林海, 兰敏东, 卢显威, 黄绍东. 全膝或全髋关节置换后老年人首次活动时跌倒恐惧的影响因素[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1351-1355.
[9]	王金军, 邓增发, 刘康, 何智勇, 余新平, 梁建基, 李晨, 郭洲洋. 全膝关节置换静脉滴注氨甲环酸联合含氨甲环酸鸡尾酒局部应用的止血效果及安全性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1356-1361.
[10]	肖国庆, 刘选泽, 严钰皓, 钟喜红. 后交叉韧带替代型假体全膝关节置换术后屈曲受限的影响因素[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1362-1367.
[11]	彭智浩, 冯宗权, 邹勇根, 牛国庆, 吴峰. 活动平台单髁置换后下肢力线与外侧间室骨关节炎进展的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1368-1374.
[12]	黄泽晓, 杨妹, 林诗炜, 何和与. 血清n-3多不饱和脂肪酸水平与全膝关节置换早期股四头肌肌力变化的相关性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1375-1380.
[13]	张冲, 刘志昂, 姚帅辉, 高军胜, 姜岩, 张陆. 局部应用氨甲环酸减少老年股骨颈骨折全髋关节置换后引流的安全和有效性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1381-1386.
[14]	姚汝斌, 王仕永, 杨开舜. 微创经椎间孔椎间融合治疗单节段腰椎管狭窄症对腰椎-骨盆平衡的改善作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1387-1392.
[15]	王海莹, 吕冰, 李辉, 王顺义. 减压植骨融合内固定治疗退变性腰椎滑脱：基于脊柱骨盆参数预测患者的功能预后[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1393-1397.