2.1  干细胞疗法对于脊柱损伤治疗的差异基因筛选  根据GSE125176数据集合，共获得骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤的差异表达基因共950个。根据GSE139227数据集的结果，共获得以异体间充质干细胞治疗脊柱损伤的差异表达基因共计729个，取两者交集可获得126个相交的差异表达基因，此即为干细胞疗法对脊髓损伤治疗的潜在靶点(见图1)。

将上述靶点由鼠源基因转化为人源基因后，对获得的126个差异表达基因同CTD数据库所建立的脊髓损伤背景网络取交集，最终共获得60个人源性差异表达基因，可将其视作干细胞疗法对脊髓损伤治疗的核心基因(见图2)。

由图3可知，研究共获得了11个上调的差异表达基因和46个下调的差异表达基因，而进一步对样本的上调及下调情况进行分析后可看出，GSE125176内有1个上调的分子标记物(XBP1)，而在GSE139227内发生下调；在GSE139227芯片内有2个上调的分子标记物(P2RX7及KLF5)，而在GSE125176内下调。由于其在不同样本内表达不一致，因此，将上述3个靶点剔除后，以获得的57个靶点进行后续的研究。

2.2  骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤潜在分子靶点的互作关系  将获得的57个人源性差异表达基因整理后，经由string数据库，获得上述基因的相互关系，再由Cytoscape构建上述差异表达基因的PPI网络，该网络的如图4所示。去除掉其中的离散节点后，对该网络的拓扑结构分析后可知，该网络中的节点共计57个，对应的边共计435个，平均节点度为15.56，而全部57个节点中，共有28个节点大于平均节点度，其中节点度最高的前10个靶点分别为：MAPK3，肿瘤坏死因子(TNF)，白细胞介素6(IL6)，CASP3，血管内皮生长因子A(VEGFA)，MAPK1，驱化因子2 (CCL2)，白细胞介素1β(IL1B)，原癌基因蛋白(FOS)，胰岛素样生长因子1(IGF1)。可将上述10个靶点视作骨髓间充质干细胞疗法治疗脊髓损伤过程中的潜在核心分子靶点。

2.3  骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤潜在分子靶点功能分析  应用WebGestalt网站的在线工具对获得的全部57个差异表达基因进行功能分析，其具体结果如图5所示。其中图5A展示了上述骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤的潜在KEGG信号通路，由图可知，IL-17 signaling pathway，AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications，TNF signaling pathway等信号通路，为骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤最重要的潜在信号通路(见表1)。剔除其中Pertussis，Chagas disease (American trypanosomiasis)，Human cytomegalovirus infection等同骨髓间充质干细胞发病相关性不高的信号通路，获得核心潜在信号通路，共计9条(见图5B)，以各靶点在cytoscape中的度值均一化后，设置各分子靶点的图形大小。而通路的图形大小，则是依据其所设计到的分子靶点数量而定。而图5C则展示了骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤的潜在GO功能结果。

脊髓损伤是一种严重的神经意外事件，其往往由剧烈的外伤诱发，直接伤及人体的脊椎组织^[1]。常见诱发脊髓损伤的原因有车祸、坠落及暴力外伤等。根据以往报道，中国现有脊髓损伤患者200余万，而每年新增病例高达10万-14万^[2]。一般情况下，脊髓损伤患者的损伤平面以下会出现神经破损，从而导致感觉、运动及自主神经功能障碍或丧失，严重影响患者的身心健康^[3]。现针对脊髓损伤的治疗多集中于预防脊髓神经的继发性损伤及常规康复训练，对缺损神经的修补手段较少^[4]，而修复神经，恢复或部分恢复患者的神经传导功能，是临床治疗该疾病的难点与热点之一。

近年来，针对脊髓损伤的神经修复的研究被广泛开展，如生物材料^[5]、营养因子^[6]、髓内损伤微环境的构建^[7-8]、神经生长抑制因子的阻断及干细胞疗法等^[9]，其中，以干细胞疗法潜力最大^[10]。已开展的干细胞疗法研究显示，在多种人体干细胞中，以骨髓间充质干细胞作为脊髓损伤治疗的移植细胞效果最佳^[11]。

相比于其他干细胞，骨髓间充质干细胞分化潜能较高，稳定性好，其经过体内诱导可发育为神经细胞、神经胶质细胞^[12-13]，直接补充脊髓损伤部位的神经组织。现有的研究显示，骨髓间充质干细胞可显著促进由外伤所致脊髓损伤缺损部位的神经细胞增殖，且免疫性较低，不会诱发剧烈的排斥反应^[14]。然现针对骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤的分子机制研究较少，特别是在其参与神经修复过程中的机制及调控网络研究较少。因此，以骨髓间充质干细胞对脊髓损伤治疗的分子靶点为切入点，考察该过程中各分子靶点的相互关系，是解决上述问题的关键。根据以往的报道可知，通过转录组学的研究可以系统理清疾病的机制及相应的生理过程^[15-16]，相比于传统的基由单一分子靶点或通路的研究更为全面。

基于此，此次研究首先应用GEO数据库调取骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤的芯片组数据，经过CTD数据库内脊髓损伤疾病背景网络的映射后，获得到骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤过程中的差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)，再以string及Cytoscape构建上述差异表达基因的关系网络，分析其网络拓扑学结构，获得其中的核心分子靶点，再由WebGestalt数据库对所获得的靶点进行功能富集，从而获得骨髓间充质干细胞修复脊髓损伤的潜在分子功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1  设计  生物信息学分析。

1.2  时间及地点  实验于2019年9月至12月在大连医科大学附属第一医院完成。

1.3  资料  数据集材料源自GEO数据库筛选出的2个数据集。方法为：在GEO数据库内，以“Spine Cord Injury”和“Bone marrow mesenchymal stem cells”为关键词进行搜索，可获得SS治疗脊髓损伤的相关芯片组数据，经过初步筛选，共获得2个数据集信息用于研究，分别为GSE125176及GSE139227，两者均由卡罗林斯卡学院临床神经科学研究中心开展。GSE125176的具体实验如下：制备严重挫伤性脊髓损伤小鼠模型，24 h内向受损部分的骨髓移植了小鼠骨髓来源的间质干细胞。移植后7 d，从脊髓损伤中分离出间质干细胞，并使用RNA测序进行了转录组学分析，以比较骨髓间充质干细胞治疗前后，脊髓损伤小鼠脊髓内髓液的转录组变化情况。GSE139227的实验类似，为上述研究的后续研究，制备严重挫伤性脊髓损伤小鼠模型，24 h内分别向不同组别的小鼠脊柱内补充自源性间质干细胞 或同种异源性间质干细胞。移植7 d后，RNA测序进行了转录组学分析，以比较不同来源间质干细胞治疗前后脊髓损伤小鼠脊髓内髓液的转录组变化情况。

1.4  方法

1.4.1  骨髓间充质干细胞对脊髓损伤治疗的差异基因筛选 对于纳入研究的2个数据集样本GSE125176及GSE139227，首先应用perl软件，以UCSC(https://genome. ucsc.edu/index.html)网站上鼠源性基因文本为注释文本(mouse.gtf)^[17]，抓取获得的数据集内ENSMUSG名称转化为基因名称。再以R系统的limma包对获得的数据进行差异化分析，以P < 0.05，上调Log FC≥1和下调Log FC≤-1的分子靶点，获得上述研究内相关的差异表达基因。应用TBtools的Veen包对获得数据进行处理，以两者相交的数据，定义为此次研究所用的差异表达基因进行后续研究。

1.4.2  脊髓损伤背景网络的建立  CTD疾病数据库^[18] (http://ctdbase.org/)是基于现有的基础及临床研究之上，整理的基因-疾病相互关联关系的权威数据库，通过上述数据库，可以快速筛选疾病相关的靶点基因，构建起疾病相关的数据库。在该数据库内，以“Spine Cord Injury”为关键词检索，获得脊髓损伤的靶点数据。由于CTD数据库内所获得的脊髓损伤靶点众多，对获得的背景网络信息进行了初步筛选以保证其结果的准确性，筛选标准如下：经过临床/实验验证，共计靶点20个；相关性指数(Inference Score)>20，共计靶点330个，已有文献报道>10篇，共计靶点204个。删除重复靶点后，共获得349个脊髓损伤靶点基因，并依据此作为脊髓损伤机制筛选用的背景网络。应用TBtools的Veen包对获得数据进行处理，分别以1.4.1内的差异表达基因及脊髓损伤背景网络取交集，在unipro数据库内，对所获得的相交的差异表达基因进行基因映射，使全部的基因由鼠源性映射至人源性后，最终获得骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤的潜在分子靶点。根据上述分子靶点个差异表达基因在两芯片组内的log值判定其上调及下调情况，同时以TBtools的Veen包对获得数据进行映射，以获得其在两组内基因的上调及下调情况。

1.4.3  骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤的蛋白-蛋白互作(protein protein interaction，PPI)网络构建  在Sting数据库内，对所获得的骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤的潜在分子靶点进行网络构建。剔除其中的离域基因，构建了上述蛋白的PPI网络。将获得的PPI网络资料导入Cytoscape后，以NetworkAnalyzer插件分别计算该PPI网络的拓扑特征，依据上述网络的节点度(degree)及边值(edge)，用Mcode插件处理后，对该网络的特征进行可视化处理，最终获得骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤的PPI网络及该网络内的Hub-DEGs。

1.4.4  骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤潜在分子靶点功能分析  在WebGestalt网站(http://www.webgestalt.org/)内^[19]，对获得的差异表达基因进行功能富集，以P 值排序，获得上述基因的KEGG信号通路及GO功能。为进一步获得不同基因在KEGG的通路的关键度，以获得的各差异表达基因的PPI节点度为差异值，对同脊髓损伤相关性较高的通路进行分析，以R系统的clusterProfiler，GOplot，tidyverse，data.table，ggraph，tidygraph包，以各差异表达基因的度值，分别构建起KEGG同相应差异表达基因的可视化网络图，最终获得骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤的潜在机制及调控网络。

1.5  主要观察指标  ①干细胞疗法对于脊柱损伤治疗的差异基因筛选结果；②骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤潜在分子靶点的互作关系；③骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤潜在分子靶点功能分析。

脊髓损伤为骨科临床常见疾病，据2013年数据，全球每年脊髓损伤患者高达25万-50万人^[20]，其常由交通、劳动和运动意外产生，并导致患者的截瘫^[20]。由于脊髓无自我修复功能，因此脊髓损伤的治疗多以修复脊髓神经元、恢复脊髓神经传导为主。目前，靶向细胞治疗^[21]、神经营养因子及神经组织修复等手段均被证实有较好的脊髓损伤修复潜力^[22-24]，而干细胞疗法潜力最大^[25]。虽然从理论上，神经干细胞为脊髓损伤治疗的首选细胞^[26]，然而，由于脊髓损伤部位会释放大量炎症细胞因子，此时植入神经干细胞则不再会分化为神经组织，而直接分化为星形胶质细胞并进一步形成瘢痕组织^[27]，因此，现开展较多的研究细胞为骨髓间充质干细胞。

存在于骨髓中的骨髓间充质干细胞可根据所锚靠局部组织的微环境，定向分化为脊髓损伤受损处的细胞组织^[28]，骨髓间充质干细胞修复脊髓损伤的研究甚至已经过临床验证^[29]。骨髓间充质干细胞的优势如下：①可自我更新，获得较易，骨髓间充质干细胞占成人骨髓有核细胞总数的0.001%-0.01%，通过髂棘穿刺即可直接获得；②生长迅速，体外培养较易，短时期内即可扩增至临床需要的移植浓度，而在扩殖的过程中，骨髓间充质干细胞的分化功能损伤较少；③相比于其他干细胞，骨髓间充质干细胞不但可以促进神经元再生，其亦会降低受损处的瘢痕形成倾向^[30]。其修复的潜在分子机制包括：①直接移植入脊髓损伤部位后，补充脊髓的坏死部位细胞，融合入宿主组织中，不经基因修饰直接促进轴突的生长^[31]；②骨髓间充质干细胞可直接向受损区的脊髓组织聚集，上调上述组织内，表型神经元特异性烯醇化酶及微管相关蛋白2等蛋白的表达，促进神经元的修复并回恢复部分神经元的功能^[32]；③较高的分化特性，如可分化为成纤维细胞、多重树突-轴突之神经样细胞及早期神经前体细胞等^[33-34]。同时，以骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤依然需要面对一些问题，如骨髓间充质干细胞在培养及移植过程中的生存率、移植细胞内CD34⁺的表达量、骨髓间充质干细胞修复的时效性以及移植对患者自身临床特征的要求等^[35]。考察该修复过程中脊髓组织内的分子靶点及对应的信号通路的系统变化，是指导骨髓间充质干细胞疗法相关基础研究的关键，也可为未来的临床研究提供新的思路。

基于此，研究利用GEO数据库内关于骨髓间充质干细胞修复脊髓损伤的芯片组数据，考察该过程中各靶点分子的变化，并借助string、cytoscape及webgestalt等数据库或软件，获得了修复过程中的PPI网络，并理清了其潜在的机制。根据所得结果可知，骨髓间充质干细胞对于脊髓损伤小鼠神经功能的修复过程，是一个复杂且多表型/通路协同起效的结果，而该过程最重要的两个方面分别是对神经损伤的抑制及受损神经的营养修复。

根据IMPELLIZZERI等^[36]的报道可知，脊髓损伤诱发的脊柱损伤的分子过程主要包含一下几个方面：①中性粒细胞浸润；②黏附相关因子过表达；③核因子κB通路激活；④促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)活化；⑤硝基酪氨酸和多聚ADP核糖；⑥脊髓细胞凋亡。由此可知，脊髓神经元的坏死，主要是脊髓内的炎症反应所致。在脊髓损伤损伤处会释放大量的细胞因子，介导的炎症反应造成神经缺损^[37]，而其远期的持续性中枢神经系统的自身免疫炎症反应，则会进一步损伤脑组织^[38]。此次研究的结果显示，骨髓间充质干细胞修复脊髓损伤的过程中，可广泛的抑制炎症反应，保护脊髓组织。研究所涉及到的重要调控因子为肿瘤坏死因子、白细胞介素6、白细胞介素1β等分子靶点均被报道参与了脊髓损伤所致的炎症反应^[39]。其中肿瘤坏死因子是重要的细胞凋亡靶点，其受免疫信号调控，并进一步激活下游的Caspase信号通路，诱发炎症杀伤。而MAPK3/MAPK1均深度参与了脊髓损伤的继发性损伤^[40]，随其下游的细胞外信号调节激酶(ERK)1和ERK2磷酸化，介导炎症反应从而使脊髓细胞凋亡。然而，无法确定该过程是骨髓间充质干细胞直接抑制上述蛋白表达，还是由于修复脊髓组织后，限制了各炎症因子的进一步释放，阻断炎症反应，其原因尚需进一步的确认。

骨髓间充质干细胞本身的细胞分化功能，可以直接替代脊髓缺损处的细胞，进而恢复脊髓神经的功能。此项研究显示，筛选出的生物标记物也涉及到了神经保护功能。由研究的结果可知，血管内皮生长因子A是重要的调控靶点之一。脊髓损伤会诱发导致局部血管破裂和进行性缺血，而通过上调血管内皮生长因子血管内皮生长因子A可有效的促进血管重构，诱导破裂血管处的血管再生^[41]。除此以外，血管内皮生长因子A也有营养及保护神经的作用，并可促进神经的增殖^[42]。此次研究亦可发现，在骨髓间充质干细胞修复的过程中，脊髓液内的驱化因子2(Chemokine (C-C motif) ligand，CCL2)的表达显著上升。而根据以往的文献报道，驱化因子2可协助巨噬细胞的募集，进而介导下游的M2神经保护作用。同时，驱化因子2上调亦可缓解由脊髓损伤所至的运动神经变性，降低脊髓损伤后续所致的运动功能障碍^[43]。然而，在KNERLICH-LUKOSCHUS等^[44]的报道中显示，驱化因子2参与了脊髓损伤远期的周围神经病变所致神经性疼痛，其可在此过程中，磷酸化一系列炎症及疼痛相关因子，如降钙素基因相关肽、P物质、类香草素受体等。上述结果均提示了驱化因子2在脊髓损伤发生过程中，对神经功能的保护作用。FOS为原癌基因蛋白，其为c-fos基因转录产生的核磷蛋白，而原癌基因蛋白是神经元被刺激激活的一种标志^[45]。而在脊髓损伤修复的过程中，原癌基因蛋白主要参与泌尿及勃起等相关的神经恢复^[46]，通过神经修复，原癌基因蛋白的表达会随之上调，从而复原或部分复原相应的神经功能。胰岛素样生长因子1是脊髓损伤过程中重要的修复因子^[47]，特别在是在骨髓间充质干细胞修复脊髓损伤过程中，胰岛素样生长因子1起到了重要的作用^[48-49]：首先，上调胰岛素样生长因子1的表达可提升移植的骨髓间充质干细胞的存活率，并提升内源性祖细胞的活化；其次，胰岛素样生长因子1可通过NOS、ARG1及Chi3L3等蛋白抑制炎症损伤；最后，胰岛素样生长因子1同髓鞘形成关系密切。另外，在这个修复的过程中，其主要涉及细胞代谢、代谢调控、跨膜转运等生物学过程，参与了细胞膜、细胞质等细胞成分的形成及蛋白对接、酶原激活等生物学功能。

综上所述，研究应用生物信息学方法，针对骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤过程中差异表达基因的分析，初步确定了该过程中脊髓损伤修复的主要机制，确定了其治疗靶点及复杂的网状调控。确定了所筛选的核心靶点，可通过对炎症损伤的抑制及脊髓神经的保护及修复，最终改善脊髓损伤症候的机制，为后续的进一步深入探讨其机制提供指导。然而，获得的结果仍然需要进一步的实验验证，方可确定其准确性。

结论：根据此次研究对以往GEO芯片数据集的筛选，可获得骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤的核心分子靶点共有126个，根据以往的研究结果，其中涉及到的脊髓损伤相关靶点共有60个，上述60个分子靶点内，有11个上调的差异表达基因和46个下调的差异表达基因，而进一步对样本的上调及下调情况进行分析后可看出，GSE125176内有1个上调的分子标记物(XBP1)，而在GSE139227内发生下调；在GSE139227芯片内有2个上调的分子标记物(P2RX7及KLF5)，而在GSE125176内下调。以上述57个分子靶点进行网络构建，所涉及到的核心靶点的10个靶点为MAPK3、肿瘤坏死因子、白细胞介素6、CASP3、血管内皮生长因子A、MAPK1、驱化因子2、白细胞介素1β、原癌基因蛋白及胰岛素样生长因子1等。筛选出的靶点，主要涉及到的KEGG信号通路有白细胞介素17、MAPK、肿瘤坏死因子、Toll样受体及NOD样受体等重要的炎症信号通路。根据上述信号通路可推知，骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤过程中，最重要的2个方面分别是对炎症反应所介导神经损伤的抑制及受损神经的营养修复。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：

生物信息学：为信息大数据分析的一种手段，在生命科学研究的过程中，借助计算机辅助对已经获得的海量数据进行挖掘分析，统计分析其中的相关性，理清各种生命现象机制的方法。

差异基因(Differential Gene)：是指一个基因在RNA水平处在不同环境压力、时间、空间等方面下，表达有显著性差异的基因。在不同因素下基因突变或者甲基化等结构发生改变导致差异的基因。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

由于脊髓无自我修复功能，因此脊髓损伤的治理多以修复脊髓神经元，恢复脊髓神经传导为主。然而，靶向细胞治疗、神经营养因子及神经组织修复等手段均被证实有较好的脊髓损伤修复潜力，而干细胞疗法潜力最大。虽然从理论上，神经干细胞为脊髓损伤治疗的首选细胞，然而，由于脊髓损伤部位会释放大量炎症细胞因子，此时植入神经干细胞则不再会分化为神经组织，而直接分化为星形胶质细胞并进一步形成瘢痕组织，因此，现研究开展较多的细胞为骨髓间充质干细胞骨髓间充质干细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程#br#

#br#