实验性根尖周炎模型大鼠髓样分化因子88的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1049

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (7): 1068-1072.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1049

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实验性根尖周炎模型大鼠髓样分化因子88的表达

左美娜1，王丽娜1，韩淑娟2，董明3，牛卫东1

(1大连医科大学口腔医学院，辽宁省大连市 116044；2朝阳市中心医院，辽宁省朝阳 122099；3大连医科大学中山学院，辽宁省大连市 116085)

收稿日期:2018-10-07 出版日期:2019-03-08 发布日期:2019-03-08
通讯作者: 牛卫东，博士，教授，大连医科大学，辽宁省大连市 116044
作者简介:左美娜，女，1992年生，辽宁省阜新市人，汉族，大连医科大学在读硕士，主要从事根尖周炎与骨破坏的研究。共同第一作者：王丽娜，女，1981年生，辽宁省大连市人，汉族，2016年大连医科大学毕业，博士，讲师，主要从事根尖周炎与骨破坏的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81171538)，项目负责人：牛卫东

Expression of myeloid differentiation factor 88 in a rat model of experimental periapical periodontitis

Zuo Meina1, Wang Lina1, Han Shujuan2, Dong Ming3, Niu Weidong1

(1Stomatology College of Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China; 2Chaoyang Central Hospital, Chaoyang 122099, Liaoning Province, China; 3Zhongshan College of Dalian Medical University, Dalian 116085, Liaoning Province, China)

Received:2018-10-07 Online:2019-03-08 Published:2019-03-08
Contact: Niu Weidong, MD, Professor, Stomatology College of Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China
About author:Zuo Meina, Master candidate, Stomatology College of Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China Wang Lina, MD, Lecturer, Stomatology College of Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China Zuo Meina and Wang Lina contributed equally to this work.
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81171538 (to NWD)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
根尖周炎：指细菌及其分解产物进入到根管系统内从而引起根尖部炎症反应并伴有根尖部牙槽骨破坏的一类疾病。此类炎症是继发于牙髓感染并以持续的抗原刺激引起根尖部牙槽骨组织破坏和宿主反应为主要特征的牙体牙髓疾病。
MyD88：又叫髓样分化因子88，它是Toll/IL-1家族和死亡结构域家族成员。MyD88是参与炎症反应密切相关的TLR2/MyD88信号通路上的重要的衔接蛋白，在信号传递和炎症发生中发挥作用。
摘要
背景：研究发现大鼠牙卵泡中髓样分化因子88有表达，并影响牙齿的萌出和破骨细胞数量。
目的：进一步验证髓样分化因子88在大鼠根尖周炎动物模型中的表达。
方法：选取6周龄雄性SD大鼠25只，由大连医科大学SPF动物实验中心提供。将大鼠下颌第1磨牙开髓，建立大鼠实验性根尖周炎模型，并将开髓0周作为对照组；开髓1，2，3，4周作为实验组。开髓后于各时间点随机选取5只大鼠，麻醉后取材，用多聚甲醛固定下颌骨，组织脱钙，制作冷冻切片。分别用苏木精-伊红染色、免疫组织化学染色观察根尖组织炎症区域的病理变化，并用RT-PCR检测髓样分化因子88在实验性根尖周炎模型中的表达。
结果与结论：①苏木精-伊红染色：结果显示实验组的根尖区有炎症浸润，并向周围蔓延扩展，表明成功建立了大鼠实验性根尖周炎动物模型；②免疫组织化学染色：结果显示髓样分化因子88在1，2，3，4周4个时间点根尖周炎症区域中均呈阳性表达，髓样分化因子88阳性细胞的表达量在1-3周明显增加，并在第3周时出现高峰；而在4周时，其表达量降低；仅少量髓样分化因子88阳性细胞出现在正常对照组；③RT-PCR结果显示髓样分化因子88 mRNA表达量从1-3周逐渐增高，到第4周下降；④结果说明，在实验性根尖周炎的动物模型中髓样分化因子88有表达，并随时间呈一定的表达趋势，髓样分化因子88可能参与了根尖周炎的发生及根尖牙槽骨的吸收。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-7925-131X(左美娜)

关键词: 根尖周炎, MyD88, 根尖周炎动物模型, 骨吸收, 组织构建

Abstract:

BACKGROUND: Studies have found that myeloid differentiation factor 88 is expressed in rat dental follicles and affects the eruption of teeth and the number of osteoclasts.
OBJECTIVE: To further verify the expression of myeloid differentiation factor 88 in an experimental rat model of periapical periodontitis.
METHODS: Twenty-five male Sprague-Dawley rats, 6 weeks of age, were provided by the SPF Animal Experimental Center of Dalian Medical University in China. The pulp of the first mandibular molar was exposed to establish the rat model of experimental periapical periodontitis in each rat. Endodontic pulp exposure 0 week was set as control group, while endodontic pulp exposure 1, 2, 3, 4 weeks as experimental group. Five rats were randomly selected at each time point after exposure of the endodontic pulp. Then, paraformaldehyde fixation of the mandible, decalcification, and pathological frozen sections were mode. Hematoxylin-eosin staining and immunohistochemical staining were used to observe the pathological changes of the periapical tissues. RT-PCR was used to detect the expression of myeloid differentiation factor 88 in the rat model of experimental periapical periodontitis.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Hematoxylin-eosin staining results showed inflammatory infiltration in the apical area of the experimental group, and spread around, indicating that we successfully established the rat model of experimental periapical periodontitis. (2) Immunohistochemical staining results showed the positive expression of myeloid differentiation factor 88 in the periapical inflammation area at 1, 2, 3, 4 weeks after modeling. The positive expression of myeloid differentiation factor 88 significantly increased within 1-3 weeks, peaked at 3 weeks, but decreased at 4 weeks. There were only a small number of myeloid differentiation factor 88 positive cells in the control group. (3) RT-PCR results showed that the mRNA expression of myeloid differentiation factor 88 increased gradually from 1 week to 3 weeks, and then decreased at 4 weeks. To conclude, myeloid differentiation factor 88 is expressed in the animal model of experimental periapical periodontitis and shows a tendency of expression over time. Myeloid differentiation factor 88 may be involved in the occurrence of periapical periodontitis and the resorption of alveolar bone in periapical periodontitis.

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Key words: Myeloid Differentiation Factor 88, Periapical Periodontitis, Models, Animal, Tissue Engineering

中图分类号:

R446，R318

左美娜，王丽娜，韩淑娟，董明，牛卫东. 实验性根尖周炎模型大鼠髓样分化因子88的表达[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(7): 1068-1072.

Zuo Meina1, Wang Lina1, Han Shujuan2, Dong Ming3, Niu Weidong1. Expression of myeloid differentiation factor 88 in a rat model of experimental periapical periodontitis [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(7): 1068-1072.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析实验选用大鼠25只，实验过程无脱失，全部进入结果分析。

2.2 大鼠根尖组织苏木精-伊红染色结果见图1。术后1周实验侧可见根尖周区域有炎性细胞浸润，见图1A；术后三四周可见大量的淋巴细胞，炎症进入慢性期，见图1B。其结果表明成功建立了大鼠实验性根尖周炎模型。

2.3 大鼠根尖组织免疫组织化学染色结果染色结果显示主要在根尖周区域附近、牙槽骨纤维组织中的炎症细胞、根尖炎症渗出液中可见髓样分化因子88阳性细胞表达。细胞呈椭圆形或圆形，胞浆棕黄色，胞核呈蓝色。髓样分化因子88阳性细胞在各时间点病灶区中均呈阳性表达，见图2。正常对照(0周)可见少量髓样分化因子88阳性细胞，见图2A。1周时可见病灶区少量髓样分化因子88阳性细胞表达，见图2B；2周时髓样分化因子88阳性细胞数量增加，见图2C；3周时髓样分化因子88阳性细胞表达呈现高峰，病灶区可见大量阳性细胞，见图2D；4周时髓样分化因子88阳性细胞表达量降低，见图2E。

1-4周4个时间点之间髓样分化因子88阳性细胞比较差异均有显著性意义(F=724.365，P=0.000，见图3)。

RT-PCR结果发现髓样分化因子88的mRNA水平在实验组各时间点中均较对照组高，且对照组与实验组各时间点比较，差异均有显著性意义(P < 0.05)。在1周到3周，髓样分化因子88的mRNA水平随时间呈上升趋势，并在第3周达到高峰。到第4周，髓样分化因子88的mRNA趋势下降。且1周与2，3周比较，差异有显著性意义(P < 0.05)，与第4周比较，差异无显著性意义(P > 0.05)，第3周的表达量与第4周比较，差异有显著性意义(P < 0.05)。

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引言

材料方法

1.1 设计建立实验性根尖周炎动物模型。

1.2 时间及地点实验于2016至2017年在大连医科大学口腔医学院完成。

1.3 材料

实验动物：健康状况良好体质量180-220 g的雄性SD大鼠25只，出生后饲养至6周，由大连医科大学SPF动物实验中心提供，SCXK(辽)2008-0002。

实验仪器：显微照相系统OLYMPUS(BX-43、日本)、超低温冰箱(Thermo，美国)、便携式电动牙钻(DENSPLY公司，日本)、数显鼓风干燥箱(博讯公司，中国)、冷冻切片机(Thermo，美国)、超低温冰箱(Thermo，美国)。

实验试剂：多聚甲醛(国药公司，中国)、DAB显色试剂盒(中杉金桥公司，中国)、苏木精-伊红(Solarbio，中国)、髓样分化因子88(MyD88)多克隆抗体(Santa Cruz公司，美国)。

1.4 实验方法

1.4.1 建立动物模型取SD大鼠25只，使用小号球钻于大鼠双侧下颌第1磨牙牙合面行开髓术，用小号K挫探查根管口，将髓室开放于口腔环境中，建立大鼠根尖周炎模型。禁食24 h，禁水2 h后，正常条件喂养，并实时观察。

1.4.2 制备冷冻切片在规定时间点0，1，2，3，4周各随机取5只SD大鼠用乙醚麻醉后进行心脏灌流固定，剖取下颌骨，40 g/L多聚甲醛固定，EDTA脱钙，低温液氮冷冻OCT包埋，制作连续的冷冻切片，厚度12 μm，-80 ℃保存。

1.4.3 苏木精-伊红染色冷冻切片于0.02 mol/L PBS室温漂洗，苏木精染色10 min，流动水下冲洗后，放在60 ℃温水中返蓝，浸入伊红中染色5 s，浸入乙醇脱水，浸入二甲苯，用树胶封固，树胶晾干后显微镜下观察。

1.4.4 免疫组织化学染色冷冻切片放在37 ℃烘干箱中烘干；用0.02 mol/L PBS清洗；体积分数3%H₂O₂去离子水和80%甲醇溶液固定60 min；PBST漂洗；正常山羊血清工作液封闭1 h；敷一抗MyD88多克隆抗体，浓度为1∶150，放在4 ℃孵育1 d；PBST漂洗；敷二抗1液：生物素化山羊抗兔IgG 1 h；PBST漂洗；敷辣根酶标记链霉卵白素工作液50 min；PBST漂洗；敷发色剂DAB 10 min；TBS漂洗；PBS漂洗；苏木精染色1 min，用流动水冲洗，去除多余染料；伊红复染5 s；乙醇脱水；二甲苯透明；封固；拍照。阴性对照为PBS替代一抗。采用OLYMPUS(BX-43)光学显微镜，物镜20倍，计数下颌第1磨牙近中牙槽骨区域阳性细胞数，每个标本选取5张连续切片的均值(单位：个/病损)。

1.4.5 RT-PCR 分别取各时间点大鼠根尖组织加Trizol提取并纯化RNA，将此RNA作为模板参照反转录试剂盒操作方法反转录合成cDNA。引物由上海生物工程有限公司设计并合成，内参为GAPDH。大鼠相关基因引物序列如表1。

表1 大鼠相关基因引物序列

Table 1 Primer sequences for related genes in rats

引物	序列长度
引物	(bp)
GAPDH F	AAA TGG TGA AGG TCG GTG TG 118
GAPDH R	TGA AGG GGT CGT TGA TGG
髓样分化因子88 F	CGA GAG CTG GAG CAA ACG GAG TTC AAG 163
髓样分化因子88 R	GCT GGC TAG TGA TGG ACC ACA CGC A

1.5 主要观察指标大鼠根尖组织髓样分化因子88 (MyD88)表达。

1.6 统计学分析通过SPSS20.0软件，运用单因素方差分析的统计学方法，计量资料用x(_)±s表示，并进一步采用LSD法比较不同时间点两两之间的髓样分化因子88表达情况。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

根尖周病变是由于根管内细菌毒素长期存在而导致的慢性炎症以及牙槽骨吸收的疾病^[16-18]。慢性根尖周炎症导致骨动态平衡失调，使得破骨细胞大量增殖，牙槽骨吸收，严重者会导致牙齿松动甚至脱落。先天性免疫细胞通过模式识别受体可以特异性的识别病原体相关分子模式(PAMP)，继而产生先天性免疫，介导适应性免疫^[19-20]。与先天免疫相关的识别受体同效应细胞表面作用作为天然免疫系统抵御病原微生物的第一道防线。研究表明TLRs可能参与天然免疫识别微生物，具体机制尚不明确。最早在1997年有学者在哺乳动物身上发现了Toll的同源蛋白，称其为“Toll样受体”。至今共13个家族成员被鉴定出来^[21-22]，并参与天然免疫反应^[23-24]。随后有研究发现对于识别入侵的病原体TLRs发挥了至关重要的作用^[25-26]，其中髓样分化因子88作为TLR2/MyD88信号通路中重要的衔接蛋白，可将信号由上游介导向下游^[8-9]。

目前对于口腔致病菌与髓样分化因子88的关系许多学者已进行了研究。临床许多疾病的发生发展过程均有TLRs/MyD88信号通路的参与。通过髓样分化因子88信号途径使口腔致病菌的致病因子介导炎症信号导入细胞内^[27-28]，从而引发炎症。李晓杰等^[29]通过在RT-PCR检测发现TLR2在大鼠根尖周炎中表达并参与炎症反应进程。胡少婷等^[30]研究发现使用髓样分化因子88抑制剂可减少白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、白细胞介素12的表达^[31-32]，阻止重组耻垢分枝杆菌感染的THP-1细胞的炎症扩散。He等^[33-35]研究发现CpG DNA通过TLR9/MyD88信号通路影响小鼠成牙本质细胞样细胞中的白细胞介素8、MDPC-23、基质金属蛋白酶13的蛋白和mRNA表达水平，介导了免疫应答并发挥作用。Ogawa等^[36]研究发现牙龈卟啉单胞菌脂多糖和它的脂质成分通过TLR4/MD2-MyD88的激活可诱导细胞。在脂多糖对TLR4在人牙髓干细胞基因表达影响的研究中，显示脂多糖通过增强白细胞介素8和TLR4的表达，激活白细胞介素8基因转录的启动子，诱发炎症^[37]。髓样分化因子88已被众多学者做了大量的研究，但在根尖周炎动物模型上较少有研究，该实验参照以往研究学者及本课题组以往的建模方法选择大鼠下颌双侧第1磨牙进行开髓^[38]，建立根尖周炎模型，观察根尖周炎各个时期在组织水平的发展变化，从而研究髓样分化因子88在根尖周炎中的表达情况。由苏木精-伊红染色结果发现术后1周，病灶区有少量中性粒细胞；术后2周，大部分牙髓组织坏死，炎症浸润范围变大，且炎症发展到急性期；从术后3周开始到4周，淋巴细胞数量逐渐增多，脓肿形成，炎症进入慢性期状态。通过观察苏木精-伊红染色结果，证明大鼠根尖周炎动物模型建立成功，病理过程与以往学者研究的大鼠根尖周炎相一致^[39-40]。由免疫组织化学结果可见髓样分化因子88阳性细胞主要分布在根尖周围病灶区、根分叉区、牙槽骨纤维组织的炎症细胞以及根尖炎症渗出液中，并且发现1周到2周髓样分化因子88阳性细胞表达处于上升趋势，淋巴细胞、中性粒细胞多见；3周时达到高峰，淋巴细胞为主；4周时呈下降趋势，转为慢性。髓样分化因子88的表达趋势与根尖周反应的急慢性炎症期的进程一致。RCR结果又进一步验证了髓样分化因子88的mRNA水平在1-4周的趋势与免疫组织化学染色相一致，1-3周呈上升趋势，到第4周下降。

通过该研究，发现髓样分化因子88在大鼠根尖周炎动物模型中有表达，并且其表达的趋势与根尖周炎反应的进程一致，首次揭示了髓样分化因子88在大鼠根尖周炎中的表达情况，这为根尖周炎症在临床上的预防和治疗提供了一定的实验依据。但是对于TLR2/MyD88信号通路上，髓样分化因子88与其下游因子的相互作用关系，以及髓样分化因子88在根尖周炎症反应和骨破坏中的具体作用还需进一步研究。

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Expression of myeloid differentiation factor 88 in a rat model of experimental periapical periodontitis

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[2]	张咪, 吴赛璇, 董明, 陆颖, 牛卫东. 根尖周炎模型小鼠白细胞介素24的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 679-684.
[3]	杨彩会, 刘启成, 董明, 王丽娜, 左美娜, 陆颖, 牛卫东. 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶促进慢性根尖周炎模型小鼠的骨破坏[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3654-3659.
[4]	李啸群, 徐凯航, 纪方. 补骨脂异黄酮抑制破骨细胞分化缓解小鼠去卵巢骨质疏松[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 186-190.
[5]	范思奇, 曾平, 农焦, 刘金富, 钱晓芬. 通络生骨胶囊含药血清对破骨细胞及Toll样受体4/核因子κB信号通路的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(14): 2155-2160.
[6]	李啸群, 徐凯航, 纪方. 补骨脂异黄酮抑制破骨细胞分化缓解小鼠去卵巢骨质疏松[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(在线): 4-.
[7]	许国峰, 李学斌, 唐一钒, 赵寅, 周盛源, 陈雄生, 贾连顺. 人黄韧带细胞骨化发生过程中的自噬[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1174-1181.
[8]	周玉, 龙小安, 李宁, 王纯. 有限元法分析髌腱炎状态时的生物力学变化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1280-1286.
[9]	伍琦, 廖瑛, 孙光华, 周桂娟, 廖源, 刘静, 钟培瑞, 成果, 邓程远, 王甜甜. 依降钙素干预膝骨关节炎模型大鼠软骨下骨的变化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(5): 709-715.
[10]	杨敏杰, 刘伟, 涂宏飞, 李莉, 费素娟. 藏红花素保护溃疡性结肠炎模型大鼠的作用及相关机制[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(29): 4673-4679.
[11]	吴大雷, 周守恒, 闫健伟, 李博, 许诺, 史春, 高阳. 杜仲醇提取物可促进根尖周炎模型大鼠骨组织的愈合[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(23): 3685-3689.
[12]	张路遥. 能量代谢分子SIRT1在运动改善2型糖尿病骨代谢中的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(2): 276-281.
[13]	宋旭东, 何云武, 李勇霖, 陈静, 胡君兰. 超声引导下椎旁神经阻滞治疗带状疱疹相关疼痛的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(11): 1797-1804.
[14]	徐慧君, 史东梅, 张咪, 吴赛璇, 董明, 陆颖, 牛卫东. Asxl1在炎性微环境中对成骨细胞增殖分化的作用[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(1): 130-135.
[15]	庞巨涛，张新虎，孙建华，周连军，刘斌，李凤国，李文哲. 经皮球囊扩张椎体后凸成形后椎体再骨折的危险：回顾性多因素分析[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(8): 1182-1187.