1.1 设计 随机对照动物实验。
1.2 时间及地点 实验于2016年3月至2017年6月在昆明医科大学基础医学院生物化学实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 健康成年清洁级雄性SD大鼠40只,体质量180-220 g,由昆明医科大学实验动物中心提供,许可证号:SYXK(滇)2011-0004,适应性喂养2周用于实验。
1.3.2 药物 人参皂苷Rg1由昆明医科大学药学院提供。
1.3.3 实验主要试剂和仪器 丙二醛(MDA)检测试剂盒,产品编号S0131,碧云天;总超氧化物歧化酶活性(SOD)检测试剂盒(产品编号S0101,碧云天);谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒(碧云天,产品编号S0053);细胞凋亡检测试剂盒POD法(roche,产品编号11684817910);BAX抗体(santa,产品编号sc-493);Bcl-2抗体(santa,产品编号sc-492);Procaspase-3抗体(santa,产品编号sc-7148);Caspase-3 cleavage p17抗体(abcam,产品编号ab49822);β-Actin抗体(santa,产品编号sc-47778)。冰冻切片机Leica CM 1950(德国);直流电泳仪(北京六一仪器厂);全波段酶标仪(Thermo Fisher Scientific);免疫印迹组件及垂直电泳转印系统(Bio-Rad Laboratories Inc)等。
1.4 实验方法
1.4.1 动物分组及造模 40只SD大鼠随机分为4组(n=10),分别为正常对照组,模型对照组,人参皂苷Rg1低剂量 [30 mg/(kg·d)] 组,人参皂苷Rg1高剂量 [30 mg/(kg·d)]组。适应性喂养2周后,正常对照组SD大鼠喂养正常饲料,模型对照组以高糖高脂饲料(15%猪油,5%蛋黄粉,2%胆固醇,1%白糖,77%普通饲料)喂养14周,治疗组SD大鼠以高糖高脂饲料喂养14周后加用人参皂苷Rg1灌胃治疗8周。
1.4.2 取材 各组动物禁食12 h后,麻醉状态下,行心脏取血,4 000 r/min,离心5 min获得血清;取实验动物的肝脏组织,部分放入体积分数4%的甲醛固定液中,4 ℃保存,用于免疫组织化学、TUNEL染色和苏木精-伊红染色;部分冻存于-80 ℃冰箱内用于冰冻切片油红染色和蛋白质印记检测;部分放入RNA保护液,用于Q-PCR检测。
1.4.3 苏木精-伊红染色 取材→固定→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→推片→贴片→烤片→脱蜡→染色→封固,封固后置于普通光学显微镜下观察。
1.4.4 油红染色 冰冻切片,贴片后放于油红染液中,乙醇洗片,苏木精染片,酸化乙醇酸化,用水冲洗后水性封片剂封固,置于光学显微镜下观察。
1.4.5 TUNEL染色 严格按照罗氏公司TUNEL试剂盒说明说进行操作。光学显微镜下观察凋亡细胞,细胞核呈棕黄色则为阳性细胞。
1.4.6 氧化应激指标测定 ①谷胱甘肽的检测:严格按照碧云天公司的试剂盒说明书进行操作; ②超氧化物歧化酶检测:严格按照碧云天公司的试剂盒说明书进行操作;③丙二醛检测:严格按照碧云天公司的试剂盒说明书进行操作。
1.4.7 免疫组织化学分析 免疫组织化学观察Bax、Bcl-2、Procaspase-3、Caspase-3 cleavage p17在肝细胞的表达情况。石蜡包埋肝脏组织标本制备切片,脱蜡进行组织抗原修复,蒸馏水冲洗,PBS漂洗3次。过氧化氢室温孵育5-10 min,以消除内源性过氧化物酶的活性。随后蒸馏水冲洗,PBS浸泡。体积分数5%-10%正常山羊血清封闭,室温孵育30 min后用一抗工作液,37 ℃孵育1.0-2.0 h或者4 ℃冰箱过夜。PBS冲洗3 min,3次。滴加适量生物素标记的二抗工作液,37 ℃孵育15 min。PBS冲洗,每次 3 min,共3次。DAB显色。自来水充分冲洗,复染,脱水,透明,封固。在光学显微镜下观察结果。
1.4.8 Q-PCR检测相关mRNA 引物设计与合成,通过Oligo 7.36 Demo软件设计引物。
引物序列:
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Bax
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上游引物:GAG GAT GAT TGC TGA TGT G,
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下游引物:AGT TGA AGT TGC CGT CTG,扩增片段89 bp;
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Bcl-2
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上游引物:GGC TAC GAG TGG GAT ACT G,
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下游引物:GGC TGG AAG GAG AAG ATG,扩增片段:80 bp;
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Caspase-3
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上游引物:GCA GTT TTG TGT GTG TGA TT,
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下游引物:GAG TTT CGG CTT TCC AGT,扩增片段70 bp。
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提取肝脏细胞总RNA,RNA纯度和浓度的测定,cDNA反转录,Q-PCR扩增体系构建及扩增反应,反应条件为扩增条件为:第1步:4 ℃ 2 min,95 ℃ 5 min,第2步:95 ℃10 s,60 ℃ 30 s,这一步重复40次,第3步95 ℃15 s,60 ℃1 min,95 ℃15 s,Q-PCR数据的采集和分析,实验重复3次。
1.4.9 Western blotting蛋白质检测 提取肝脏组织的总蛋白质,BCA法蛋白定量。蛋白变性后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),各个泳道的上样量一致。电泳完成后切胶,转膜,将PVDF膜用5%的脱脂牛奶封闭2 h后,分别加入Bax、Bcl-2、Procaspase-3、Caspase-3 cleavage p17一抗(1∶1 000),4 ℃孵育12 h后,PVDF膜用TBST洗涤3次,加入二抗孵育2 h,用TBST洗膜3次,将膜沥干放入发光试剂中,取出置于荧光成像仪中进行曝光检测目的条带,以β-Actin为内参,采用Image J计算Bax、Bcl-2、Procaspase-3、Caspase-3 cleavage p17的蛋白相对表达量,实验重复3次。
1.5 主要观察指标 ①用显色法检测血清中氧化应激指标;②苏木精-伊红染色观察肝组织病理形态变化;③油红染色观察肝组织的脂滴;④TUNEL染色观察肝细胞的凋亡情况;⑤通过Q-PCR从mRNA水平检测肝脏组织中Bax、Bcl-2、Caspase-3的表达情况;⑥通过免疫组织化学、Western Blotting从蛋白质水平检测肝脏组织中的凋亡关键因子Bax、Bcl-2、Procaspase-3、Caspase-3 cleavage p17表达情况。
1.6 统计学分析 实验数据资料以x±s表示,使用SPSS 21.0版本进行数据分析,数据符合正态分布及方差齐后采用one-way ANOVA,P < 0.05时结果有统计学意义。反之,如数据不符合正或者方差不齐则需要使用秩和检验,P < 0.05时结果有统计学意义。
中国组织工程研究杂志出版内容重点:组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程