骨形态发生蛋白2联合基因转染骨髓间充质干细胞复合同种异体骨修复极限骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0458

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (9): 1313-1318.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0458

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骨形态发生蛋白2联合基因转染骨髓间充质干细胞复合同种异体骨修复极限骨缺损

王小志¹，杨桦¹，张辰²，何惠宇¹，巴娇娇³

¹新疆昌吉回族自治州人民医院口腔科，新疆维吾尔自治区昌吉市 831100；²中国南方航空股份有限公司新疆分公司医务室，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830002；³新疆生产建设兵团总医院口腔科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000

修回日期:2017-10-26 出版日期:2018-03-28 发布日期:2018-04-03
作者简介:王小志，新疆昌吉回族自治州人民医院口腔科，新疆维吾尔自治区昌吉市 831100
基金资助:
国家自然科学基金(81060088)：三维打印构建组织工程化牙槽骨的实验研究

Bone defect repair using allogenic bone carrying bone morphogenetic protein-2 and gene transfected bone marrow mesenchymal stem cells

Wang Xiao-zhi¹, Yang Hua¹, Zhang Chen², He Hui-yu¹, Ba Jiao-jiao³

¹Department of Stomatology, People’s Hospital of Changji Hui Autonomous Prefecture, Changji 831100, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; ²Infirmary of the Xinjiang Branch of China Southern Airlines, Urumqi 830002, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; ³Department of Stomatology, General Hospital of Xinjiang Construction Corps, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Revised:2017-10-26 Online:2018-03-28 Published:2018-04-03
About author:Wang Xiao-zhi, Department of Stomatology, People’s Hospital of Changji Hui Autonomous Prefecture, Changji 831100, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81060088

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
骨涎蛋白：主要由成骨细胞分泌，在骨改建过程中，伴随成骨细胞从前体细胞逐渐向成熟形态分化的同时，骨涎蛋白的表达呈正相关性，说明骨涎蛋白是骨大量形成的标志物，检测成骨实验研究中局部骨涎蛋白的表达量，可直接反映成骨细胞已处于分化成熟阶段。因此，骨涎蛋白多分布在趋向钙化的软骨组织附近或已钙化的骨基质中。同时骨涎蛋白也是一种作用优良的血管形成分子，还能触发成骨样细胞，使其在与Ⅰ型胶原的α-2链相结合时具有优先权，后者沉淀形成羟基磷灰石结晶，加速矿化的完成。
骨形态发生蛋白2：属于转化生长因子β超家族，具有诱导未分化间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞定向分化与增殖的能力，是骨组织形成过程中最关键的调节因子，可促进成骨细胞分化成熟，在调节骨和软骨生长发育的同时，也参与骨组织重建过程，诱导骨内、外膜及骨髓基质细胞向骨母细胞分化成熟，加强骨床再生能力，同时活化并诱导血管周围间充质细胞分化为软骨和成骨细胞。
碱性成纤维细胞生长因子：是一种强力的促细胞分裂原，在成骨过程中至关重要，因此对骨损伤的修复发挥重要作用。成骨细胞的胞膜表面存在碱性成纤维细胞生长因子受体，成骨细胞合成的碱性成纤维细胞生长因子以自分泌或旁分泌形式释放到胞外与受体结合，可促进骨原细胞分化为成骨细胞，诱导成骨细胞分裂、增殖，并促使其合成骨基质、钙结合蛋白及含有羟基磷灰石颗粒的基质小泡，加快基质钙化。

摘要
背景：组织工程技术为骨缺损带来新的治疗路径，生物基因转染优化了组织工程骨修复骨缺损的效果。
目的：观察骨形态发生蛋白2与碱性成纤维细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞/同种异体骨修复绵羊极限骨缺损的效果。
方法：取9只阿勒泰大尾绵羊，制作双侧髂骨极限性骨缺损模型，左侧植入骨形态发生蛋白2与碱性成纤维细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞/同种异体骨复合材料(实验组)，其中3只右侧植入骨髓间充质干细胞/同种异体支架骨复合材料(细胞支架组)，3只右侧植入同种异体支架骨材料(同种异体骨组)，3只右侧植入β-磷酸三钙材料(磷酸三钙组)。植入后4，8，12周进行组织学、免疫组织化学染色观察。
结果与结论：①组织学观察：植入12周时，实验组同种异体骨材料大范围吸收，破骨样细胞逐渐减少，成骨样细胞增多，骨小梁周围骨纤维基质逐渐致密，可见大面积成片状新骨，骨小梁结构清晰，骨改建明显，术区始终未见炎性细胞浸润；其余3组支架骨材料降解，但无明显骨改建；②免疫组织化学观察：植入12周时，实验组骨涎蛋白与Ⅰ型胶原呈强阳性表达，其余3组骨涎蛋白与Ⅰ型胶原呈弱表达；③结果表明：骨形态发生蛋白2联合碱性成纤维细胞生长因子基因转染的骨髓间充质干细胞复合同种异体骨，可完全修复羊极限骨缺损。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-4852-2700(王小志)

关键词: 骨形态发生蛋白, 碱性成纤维细胞生长因子, 骨髓间充质干细胞, 极限骨缺损, 组织工程, 生物材料

Abstract:

BACKGROUND: Bone tissue engineering technology brings a new path to treat bone defects, and moreover, gene transfection optimizes the effects of tissue-engineered bone in bone repair.
OBJECTIVE: To observe the effect of allogenic bone carrying bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) and basic fibroblast growth factor (bFGF) transfected bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) in the repair of critical-sized bone defects of the sheep ilium.
METHODS: Nine Altay sheep were taken to make animal models of critical-sized bone defects in the bilateral ilia. Allogenic bone carrying BMP-2 and bFGF-transfected BMCSCs was implanted into the left side of the ilium (n=9, experimental group), while allogenic bone carrying BMSCs (n=3, cell scaffold group), allogenic bone (n=3, allogenic bone group) and β-tricalcium phosphate (n=3, β-TCP group) were implanted into the right side of the ilium, respectively. Histological observation and immunohistochemical staining were performed at 4, 8, 12 weeks after implantation.
RESULTS AND CONCLUSION: Findings from histological observation showed that: at 12 weeks after implantation, the experimental group exhibited obvious bone remodeling, largely absorbed bone allograft, gradually reduced osteoclast-like cells and increased osteoblast-like cells, clear trabecular structure, dense bone matrix around the trabecular bone, and large area of flaky new bone tissues. Bone materials also degraded in the other three groups, but no remodeling occurred. Immunohistochemical staining showed that at 12 weeks after implantation, bone sialoprotein type I collagen in the experimental group were strongly positive, while they were weakly expressed in the remaining three groups. Overall, our findings indicate that the allogenic bone carrying BMP-2 and bFGF-transfected BMSCs can thoroughly repair critical-sized bone defects of the sheep ilium.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Morphogenetic Proteins, Basic Fibroblast Growth Factor 2, Stem Cells, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

王小志，杨桦，张辰，何惠宇，巴娇娇. 骨形态发生蛋白2联合基因转染骨髓间充质干细胞复合同种异体骨修复极限骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(9): 1313-1318.

Wang Xiao-zhi, Yang Hua, Zhang Chen, He Hui-yu, Ba Jiao-jiao. Bone defect repair using allogenic bone carrying bone morphogenetic protein-2 and gene transfected bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(9): 1313-1318.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析 植入后4，8，12周观察，实验动物均未感染或死亡，伤口愈合良好，均进入结果分析。

2.2 大体观察结果 植入后4周，实验组术区骨膜覆盖完好，骨皮质高度与周围骨平齐，口腔探针检测硬度无明显下降，剖面可见植入材料与周围骨界限较清晰，植入材料内部见致密结缔组织，至8，12周时骨皮质连续性、高度及硬度均与周围正常骨组织一致，且剖面见植入材料与周边骨组织界限不清。

术后4周，细胞支架组术区骨膜覆盖完好，骨皮质表面虽连续，但有个别点状凹陷，口腔探针检测硬度无明显下降，剖面可见植入材料与周围骨界限较清晰，植入材料内部见结缔组织，随时间点推移有所增加，但不明显，总体较实验组疏松，植骨区特别是中间部位硬度随时间推移有所下降。

术后4周，同种异体骨组术区骨膜覆盖完整，骨皮质表面虽连续，但普遍存在点状及槽状凹陷，口腔探针检测硬度较周围正常骨组织降低，剖面可见植入材料与周围骨界限较清晰，植入材料内部见结缔组织，结缔组织内可见部分支架材料松散存在，随时间点推移有所增加，但不明显，总体较实验组疏松，植骨区特别是中间部位硬度随时间推移明显降低。

术后4周，磷酸三钙组术区骨膜覆盖完好，但皮质骨明显突出隆起，高于周围正常组织，口腔探针检测硬度与周围正常骨组织基本一致，剖面见术区皮质骨明显增厚隆起，植入材料与周围骨组织界限清楚，材料松散存在，结构性差，植入材料内部见结缔组织，随时间推移变化不明显。

2.3 组织学观察结果 植入4周末，实验组术区同种异体骨支架骨存在部分吸收，周围常见多核破骨样细胞围绕，支架被纤维结缔组织包裹，植入材料与周围骨组织界面区可见大片连续的成骨样细胞及成软骨样结构，术区中央个别位点可见新形成的骨小梁结构，并可见成骨样细胞呈圈状排列，见图2。至8，12周，术区同种异体骨材料大范围吸收，破骨样细胞逐渐减少，成骨样细胞增多，骨小梁周围骨纤维基质逐渐致密，可见大面积成片状新骨，骨小梁结构清晰，术区始终未见炎性细胞浸润。

植入4周末，细胞支架组苏木精-伊红染色显示术区同种异体支架骨少量吸收，周围常见多核破骨样细胞围绕，少量成骨细胞，支架被纤维结缔组织包裹，但较实验组明显稀疏，植入材料与周围骨组织界面区可见连续的成骨样细胞及成软骨样结构，术区中央为无活性样死骨结构。至8，12周，支架骨材料存在一定量的降解吸收，中央区依然为无活性样骨结构，骨小梁内纤维结缔组织较4周时略致密。

植入4周末，同种异体骨组、磷酸三钙组植入材料与周围骨组织界面区可见连续的成骨样细胞及成软骨样结构，术区中央主要为无活性样死骨结构，细胞成分较单一，至8，12周末变化不明显。

2.4 免疫组织化学观察结果

实验组：植入后4周末，在术区可见中等量阳性表达的骨涎蛋白及Ⅰ型胶原，术区细胞间质可见大范围棕黄染色，且植入材料与正常骨界面区较多，植入材料中央也可见阳性表达，随时间点推移，阳性表达范围明显增加，以致棕黄色染色连成片状布满视野(图3，4)。

细胞支架组：植入后各时间点骨涎蛋白及Ⅰ型胶原表达在少量细胞间质部位为阳性，多在植入材料与正常骨界面区，棕黄色染色不连续，呈小范围片状，随时间点推移，阳性染色范围略有增加，但不明显。

同种异体骨组：植入后各时间点骨涎蛋白及Ⅰ型胶原表达在少数细胞间质部位为弱阳性，分散存在，植入材料中央未见，随时间推移弱阳性表达未见增强及扩大。

磷酸三钙组：植入后各时间点骨涎蛋白及Ⅰ型胶原表达仅在个别细胞间质部位为弱阳性，分布较散，植入材料中央未见，且与时间长短不成比例，其余部位基本未见表达。

2.5 免疫组化统计分析结果 各组免疫组织化学骨涎蛋白、Ⅰ型胶原阳性表达平均光密度值结果见表1，2。组间方差分析显示差异有统计学意义(P < 0.05)。由表可看出各组骨涎蛋白及Ⅰ型胶原阳性表达的平均光密度值在各组中随时间推移略有增加，但实验组平均光密度值均明显高于其他各组(P < 0.05)，但其自身在时间上并无统计学差异。细胞支架组、同种异体骨组、磷酸三钙组各组间两指标比较差异均无显著性意义。

参考文献

[1] 王硕,韦兴.丝素蛋白复合物在骨缺损中的应用[J].中国骨与关节杂志,2015,4(5):415-419.

[2] 王雷,余德涛.引导性骨再生膜管治疗骨缺损:怎样更好的走向临床?[J].中国组织工程研究,2013,17(42):7449-7454.

[3] Fishero BA,Kohli N,Das A,et al.Current concepts of bone tissue engineering for craniofacial bone defect repair. Craniomaxillofac Trauma Reconstr.2015;8(1):23-30.

[4] 王小志,何惠宇,杨楠,等.基因转染骨髓间充质干细胞复合同种异体骨修复绵羊极限骨缺损[J].中国组织工程研究,2013,17(47): 8141-8148.

[5] 许慧芬,何惠宇,唐小雪.物理联合化学或化学方法处理去抗原异种松质骨支架与骨髓间充质干细胞的细胞相容性[J].中国组织工程研究,2012,16(6):958-962.

[6] 杨楠,何惠宇,胡杨,等.复合骨髓间充质干细胞同种异体支架骨修复羊髂骨极限缺损[J].中国组织工程研究, 2013,17(16): 2859-2868.

[7] 邬薇薇,胡杨,何惠字,等.BMP-2、bFGF基因转染的大鼠骨髓干细胞与牙胚细胞在体外混合培养对成牙基因的影响[J].口腔医学研究,2015,31(1):18-22.

[8] 胡杨,盛磊,马莹,等.碱性成纤维细胞生长因子-慢病毒真核表达载体的构建及转染[J].中国组织工程研究与临床康复, 2011, 15(6):1009-1014.

[9] 杨楠.bFGF转染骨髓间充质干细胞附和支架材料的动物实验[D].新疆:新疆医科大学,2013:8-55.

[10] 杨川博,何惠宇,崔杰,等.骨髓基质干细胞复合煅烧骨的皮下成骨[J].中国组织工程研究,2013,17(16):2883-2890.

[11] Francisco JS,Moraes HP,Dias EP.Evaluation of the Image-Pro Plus 4.5 automatic counting of labeled nuclei by PCNA immunohistochemistry.Braz Oral Res.2004;18(2):100-104.

[12] 臧程程,赵志颖,陈阵.人牙髓成牙本质细胞和神经组织中钠钙交换体1型通道蛋白的免疫组化研究[J],中华口腔医学杂志,2015, 50(10):627-630.

[13] 许蕾,韩建国,李家锋.人BMP-2体外定向诱导犬BMSCs向成骨方向分化的实验研究[J].泰山医学院学报,2015,36(9):971-974.

[14] 徐世旭,阳富春.骨形态发生蛋白的成骨作用及其在骨组织工程中的应用[J].医学综述,2008,14(2):193-195.

[15] 安新玲,韩金祥,王世力.骨形态发生蛋白的研究进展[J].食品与药品,2009,11(11):69-73.

[16] 王兴,崔鹏程,马瑞娜,等.rhBMP-2诱导异位软骨修复重建兔气管缺损的实验研究[J].现代生物医学进展,2011,11(10):1838-1840.

[17] 肖后生,徐亮.骨形成蛋白在脊柱关节病中研究进展[J].安徽医学, 2011,32(2):226-228.

[18] 杨丽,张荣华,朱晓峰,等.骨代谢与TGF-β1、BMP-2的关系[J].山东医药,2004,44(15):57-58.

[19] Cui L,Yin S,Liu W,et al.Expanded adipose-derived stem cells suppress mixed lymphocyte reaction by secretion of prostaglandin E2.Tissue Eng.2007;13(6):1185-1195.

[20] 孙兰英,王其宝,包崇云,等.碱性磷酸酶mRNA在体内组织工程骨中的表达[J].国际口腔医学杂志,2011,38(4):388-391.

[21] 张丽君,丁焕文,王捷,等.碱性成纤维细胞生长因子基因转移对成骨细胞生长特性的影响[J].中国组织工程研究与临床康复, 2007, 11(41):8238-8241.

[22] Sun L,Wu L,Bao C,et al.Gene expressions of Collagen typeⅠ,ALP and BMP-4 in osteo-inductive BCP implants show similar pattern to that of natural healing bones.Mater Sci Eng C.2009;29(6):1829-1834.

[23] Bourque WT,Hall BK,Gross M.The presence of several growth factors during the stage of fracture repair.J Bone Joint Surg(Br).1993;75(Supply):282-285.

[24] 张鹏飞,史欣,袁梦桐,等.牙髓干细胞成骨诱导的新进展[J].现代生物医学进展,2015,15(31):6198-6200.

[25] 袁林,曹凯华,童心.骨涎蛋白在不同类型种植体骨界面改建中的变化[J].牙体牙髓牙周病学杂志,2012,22(6):319-322.

[26] 李景辉,刘大勇,张方明,等.应用人恒牙牙髓干细胞与明胶支架构建组织工程骨的研究[J].北京口腔医学,2013,21(1):21-26.

[27] 黄强,沈彬.Ⅰ型胶原与原发性骨质疏松的相关性研究进展[J].华西医学,2009,24(1):244-246.

[28] Ong SJ,Jeon O,Yang HS,et al.Effects of culture conditions on steogenic differentiation in human esenchymal stem cells.J Microbiol Biotechnol.2007;17(7):1113-1119.

[29] 夏欣一,崔英霞,杨滨,等.Ⅰ型胶原基因突变与成骨不全研究进展[J].中国优生与遗传杂志,2009,17(5):12-13.

[30] 王征,毛克亚,侯喜君,等.多孔β-磷酸三钙修复骨缺损的实验研究[J].解放军医学杂志,2008,9(3):1136-1138.

[31] 刘昌奎,谭新颖,罗金超,等.同种异体骨支架复合自体骨髓间充质干细胞修复下颌骨节段缺损动物模型的建立[J].口腔医学研究, 2015,31(1):27-30.

引言

材料方法

1.1 设计 自身对照，动物观察实验。

1.2 材料

实验动物：12月龄健康阿勒泰大尾绵羊9只，雌雄不拘，体质量(30±2) kg，圈养于新疆医科大学动物中心。

实验材料及试剂：BMP-2联合bFGF基因转染的骨髓间充质干细胞复合同种异体支架骨、骨髓间充质干细胞、同种异体支架骨及β-磷酸三钙由新疆医科大学第一附属医院口腔科提供^[5-6]；一抗Rabbit Anti-BSP(兔抗骨桥蛋白抗体)及Rabbit Anti-Collagen Ⅰ(兔抗Ⅰ型胶原抗体，北京博奥森)；二抗为山羊抗兔抗体；显色液为浓缩型DAB试剂盒(北京中杉金桥)。

实验用主要仪器：生物安全操作柜(Thermo，德国)；1×71倒置荧光显微镜(OLYMPUS，日本)；BCD-216SDN冰箱(Hair，中国)；BHC-1300IIB2超净工作台(苏洁，中国)；二氧化碳孵育箱(Thermo，美国)；LEICA DM 3000显微镜、LEICA RM 2135切片机(Leica，德国)；EYELA SLI-700恒温培养箱(东京理化，日本)；GZX-9070 MBE数显鼓风干燥箱(博迅，中国)；TG16-WS高速离心机(湘仪，中国)；M1-211A微波炉(美的，中国)；SA810015T通风柜(升仕，中国)。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞的培养和筛选

细胞的收集及培养：提取新疆阿勒泰大尾绵羊髂骨区骨髓后，采用全骨髓培养法将其转入25 cm²细胞培养瓶内，放入培养箱中培养备用。

细胞的筛选：选取第3代羊骨髓间充质干细胞，用BMP-2、bFGF慢病毒液转染，形成BMP-2与bFGF转染的骨髓间充质干细胞。用含Blasticidin 6 mg/L的DMEM筛选基因转染后的羊骨髓间充质干细胞，10-12 d后见数个大小不等、分散的细胞团块^[7]。

1.3.2 骨髓间充质干细胞与同种异体骨的复合培养 参照本课题组前期实验方法^[8-10]，在6孔板中放入大小合适的灭菌绵羊同种异体骨，加入适量用DMEM/F12充分预湿后吸干培养液，向每块支架骨滴加细胞浓度为1×10¹⁰ L^-1的BMP-2与bFGF转染及未转染的骨髓间充质干细胞悬液100 μL，置于37 ℃二氧化碳孵育箱孵育2 h后，加入适量DMEM/F12放入培养箱备用。

1.3.3 实验动物模型建立 实验前将阿勒泰大尾绵羊禁食水24 h，耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠0.005-0.02 mg/kg麻醉。双侧髂骨区备皮，碘伏消毒，由皮逐层分至髂骨骨膜，翻开骨膜，慢速骨钻滴水冷却制备15 mm(长)×10 mm (宽)×10 mm(高)骨缺损(前期实验证实无法自我愈合^[4])，见图1；9只动物左侧缺损均植入BMP-2与bFGF转染的骨髓间充质干细胞与同种异体骨复合体，作为实验组；右侧缺损随机植入骨髓间充质干细胞+同种异体骨、β-磷酸三钙及同种异体骨各3只，分别设置为细胞支架组、磷酸三钙组、同种异体骨组，分层缝合术区^[9]。

1.3.4 免疫组织化学染色 植入后4，8，12周末各处死3只羊，取出髂骨，切取术区骨块(边界大于术区)，去尽周围软组织至软骨，体积分数10%甲醛液固定24 h，脱钙后常规脱水包埋，制备蜡块。选取各组蜡块进行组织切片，每组20张，放置于60 ℃烤箱过夜，每组切片随机抽取5张行苏木精-伊红染色，剩余切片进行免疫组织化学染色：二甲苯透明，梯度乙醇脱水，蒸馏水浸洗3次，5 min/次，体积分数3%H₂O₂浸洗10 min去除过氧化物酶，1×PBS浸洗3次，5 min/次，枸橼酸钠缓冲液微波修复10 min，室温冷却后1×PBS浸洗3次。滴加兔抗BSP抗体、兔抗Collagen Ⅰ抗体孵育，4 ℃冰箱过夜，1×PBS浸洗3次后滴加通用型二抗37 ℃ 孵育30 min，1×PBS浸洗3次，5 min/次。新鲜DAB液显色，自来水终止显色。苏木精复染，盐酸乙醇分化，1×PBS返蓝。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固^[4]。LEICA DM 3000数码显微镜观察及采集骨涎蛋白和Ⅰ型胶原的表达。参照Francisco等^[11]提出的研究方法，使用LEICA DM 3000数码显微镜筛选出有阳性表达的切片，每组选取20张，每张切片随机选取5个400倍光学视野，并严格在相同光源亮度、对比度、色彩饱和度、光圈、增益等条件下采集阳性表达视野图像。使用Image Pro Plus 6.0专业图像分析软件分析每组阳性表达的平均光密度值，平均光密度值越大则阳性染色越强^[12]。

1.4 主要观察指标 各组术区及周围组织大体、组织学及免疫组化观察结果。

1.5 统计学分析 数据以x(_)±s表示，由统计人员使用SPSS 17.0统计软件进行处理，两组间比较用t 检验，多组间比较用方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

BMP-2属于转化生长因子β超家族，具有诱导未分化间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞定向分化与增殖的能力^[13]，是骨组织形成过程中最关键的调节因子^[14]，可促进成骨细胞分化成熟，在调节骨和软骨生长发育的同时，也参与骨组织重建过程，诱导骨内、外膜及骨髓基质细胞向骨母细胞分化成熟^[15]，加强骨床再生能力，同时活化并诱导血管周围的间充质细胞分化为软骨和成骨细胞^[16-17]，修复并加速骨损伤的愈合，达到成骨目的^[18-19]。

bFGF是一种强力的促细胞分裂原，在成骨过程中至关重要，因此对骨损伤的修复发挥重要作用^[20]。成骨细胞胞膜表面存在bFGF受体，成骨细胞合成的bFGF以自分泌或旁分泌形式释放到胞外与受体结合，可促进骨原细胞分化为成骨细胞，诱导成骨细胞分裂、增殖，并促使其合成骨基质、钙结合蛋白及含有羟基磷灰石颗粒的基质小泡，加快基质钙化^[21]。另一方面，bFGF可促进成软骨细胞增殖，并合成以Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原为主的胶原，加速骨断端软骨形成^[22]。bFGF强大的促修复作用也体现在它的促血管生成方面，它能刺激血管内皮细胞增殖和迁移，诱导内皮细胞长入胶原基质中，并形成与毛细血管相似的管腔，对血管的爬入支架内起到了促进作用^[23]。

骨的诱导和形成过程由多种生长因子共同参与和调节，骨涎蛋白在此过程中发挥着不可替代的作用^[24]。骨涎蛋白主要由成骨细胞分泌，在骨改建过程中，伴随成骨细胞从前体细胞逐渐向成熟形态分化的同时，骨涎蛋白的表达呈正相关性，说明骨涎蛋白是骨大量形成的标志物，检测成骨实验研究中局部骨涎蛋白的表达量，可直接反映成骨细胞已处于分化成熟阶段。因此，骨涎蛋白多分布在趋向钙化的软骨组织附近或已钙化的骨基质中。同时骨涎蛋白也是一种作用优良的血管形成分子，还能触发成骨样细胞，使其在与Ⅰ型胶原的α-2链相结合时具有优先权，后者沉淀形成羟基磷灰石结晶，加速矿化的完成^[25]。因此，实验研究常将骨涎蛋白的表达量纳入成骨评价的标准，且一般验证结果良好^[26]。

Ⅰ型胶原由成骨细胞以原胶原的形式分泌^[27]，骨基质90%由Ⅰ型胶原构成，为钙盐沉积提供基础，Ⅰ型胶原的高水平表达通常提示成骨细胞的大量形成^[28]。Ⅰ型胶原决定着骨的韧性，它的存在能够保持骨结构的完整性，在抗骨组织断裂和形变中发挥重要作用，从而直接决定着骨的强度^[29]。

通过实验大体观察、组织学观察、免疫组织化学观察及统计学分析认为，磷酸三钙组在观察期内硬度略微降低，可能是因为术区植入材料降解较少，术区中央呈现死骨样结构，这与β-磷酸三钙自身降解周期过长，中心新骨形成较慢有关^[30]，在手术结合区有成软骨样结构及成骨样细胞出现，β-磷酸三钙孔洞内虽有部分纤维组织充填，但不能与材料连续，具有一定骨缺损修复能力，但无法完全修复髂骨极限缺损。同种异体骨组在观察期内硬度下降较大，可能与术区材料降解过快及过多但新骨形成很少有关^[31]，虽在在手术结合区观察到部分成软骨样结构及成骨样细胞出现，但支架材料孔洞内部为较疏松的结缔组织填充，且无法充满，术区中央呈现死骨样结构，具有一定骨缺损修复能力，也无法完全修复髂骨极限缺损。细胞支架组在观察期内硬度基本无变化，术区结合界面的成软骨样结构和成骨样细胞比前两组有所增加，术区新骨形成也增多，说明骨髓间充质干细胞在支架骨存在的基础上能分化成一定的新骨，但术区中央仍无法大范围成骨及纤维血管化，具有一定骨缺损修复能力，但无法完全修复髂骨极限缺损。实验组在观察期内硬度基本无变化，高度与周围正常组织一致，手术结合界面常见大片成软骨样结构，术区中央可见大量成骨样细胞，整个移植区的支架材料吸收降解较其他组多，材料周围常见破骨样细胞，但成骨细胞也较其他对照组多，支架材料孔洞内爬满纤维结缔组织，说明实验组术区支架材料被机体吸收降解的同时，新生类骨质及骨前体在逐渐替代吸收的支架材料，极限骨缺损区发生着剧烈的骨改建，达到修复极限骨缺损的要求。

骨髓间充质干细胞提供成骨潜能细胞，BMP-2及bFGF优异的诱导成骨作用促使干细胞分化成骨样结构并加速骨缺损的修复，在同种异体骨提供完整支架支撑作用的同时，产生更强大的骨诱导能力，使整个组织工程骨的成骨修复过程具有良好的生物相容性及稳定的物理性能，最终促进机体成骨修复，为骨缺损提供了新的研究数据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

骨形态发生蛋白2联合基因转染骨髓间充质干细胞复合同种异体骨修复极限骨缺损

Bone defect repair using allogenic bone carrying bone morphogenetic protein-2 and gene transfected bone marrow mesenchymal stem cells

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[1]	李璇, 孙一民, 李龙飙, 王振铭, 杨静, 汪成林, 叶玲. 纳米改性聚己内酯微球的构建及对牙髓细胞的生物学效应[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(10): 1602-1608.
[2]	刘小刚, 李甜, 张舵. 中药有效成分促进骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 121-126.
[3]	麦丽萍, 何国东, 陈少贤, 朱杰宁, 侯兴华, 张梦珍, 李晓红. 乙醛脱氢酶3B1在人骨髓间充质干细胞自然衰老过程中的表达[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 40-44.
[4]	杨腾云, 李彦林, 刘德健, 王国梁, 郑竹君. 转化生长因子β3诱导外周血源性间充质干细胞成软骨分化的量效关系[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 45-51.
[5]	敬劲, 赵珊笛, 陈龙, 彭双麟, 唐辉, 郭代金, 曾馨仪, 肖金刚. 骨质疏松症小鼠脂肪干细胞结合双相磷酸钙陶瓷修复骨质疏松症小鼠颅骨缺损#br#[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 90-95.
[6]	崔帅帅, 杨晓红. miRNA在骨髓间充质干细胞自我更新、多向分化及命运和功能调控中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 101-106.
[7]	康悦, 刘洁. 环状RNA在间充质干细胞成骨分化中的生物学作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 107-112.
[8]	冯志国, 孙海飚, 韩晓强. 长链非编码RNA对骨相关细胞增殖、分化、凋亡的调控[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 113-120.
[9]	宋慧芳, 谈佳音, 康毅, 李斌, 毕志斐, 龙女, 夏仲年, 郭蕊. 低氧预处理增强老年人骨髓间充质干细胞条件培养基对H9C2细胞氧化应激损伤的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 1-6.
[10]	梅运运, 张建军, 王东. 高压氧联合NgR基因沉默骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 12-19.
[11]	谢兴奇, 胡伟, 屠冠军. 骨髓间充质干细胞来源外泌体与硫酸软骨素酶ABC联合治疗大鼠脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 20-26.
[12]	张学磊, 罗干, 于圣会, 顾祖超, 彭旭, 何学令, 刘艳, 张晓梅. 脱细胞神经联合骨髓间充质干细胞及富血小板凝胶治疗股神经损伤[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 27-32.
[13]	赵来赫, 夏冰, 马腾, 高楗勃, 李胜友, 高雪, 郑毅, 胡广文, 罗卓荆, 黄景辉. 骨髓间充质干细胞诱导为类许旺细胞的细胞外基质促进周围神经损伤后轴突再生[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 33-39.
[14]	林苗远, 李豫皖, 刘毅, 陈贝, 张莉. 组织工程皮肤的研究热点及应用价值[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 159-166.
[15]	张同同, 王中华, 文杰, 宋玉鑫, 刘林. 3D打印模型在颈椎肿瘤手术切除与重建中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1335-1339.