骨形态发生蛋白2复合纤维蛋白凝胶促进兔胫骨牵张成骨

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0976

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (30): 4763-4768.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0976

• 组织工程骨及软骨材料 tissue-engineered bone and cartilage materials • 上一篇下一篇

骨形态发生蛋白2复合纤维蛋白凝胶促进兔胫骨牵张成骨

郭娇阳，徐陆晨，李运峰

四川大学华西口腔医院正颌与关节外科，口腔疾病研究国家重点实验室，国家口腔疾病临床医学研究中心，四川省成都市 610041

收稿日期:2018-04-28 出版日期:2018-10-28 发布日期:2018-10-28
通讯作者: 李运峰，副教授，硕士生导师，美国华盛顿大学牙学院访问学者，中华口腔医学会口腔颌面外科专业委员会青年委员，四川大学华西口腔医院正颌与关节外科，口腔疾病研究国家重点实验室，国家口腔疾病临床医学研究中心，四川省成都市 610041
作者简介:郭娇阳，女，1992年生，山西省长子县人，汉族，四川大学华西口腔医学院在读硕士，主要从事牵张成骨、骨质疏松研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81300858)

Recombinant human bone morphogenetic protein-2/fibrin gel enhances bone formation in a rabbit model of tibial distraction osteogenesis

Guo Jiao-yang, Xu Lu-chen, Li Yun-feng

Department of Oral & Maxillofacial Surgery, West China Hospital of Stomatology, State Key Laboratory of Oral Diseases, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China

Received:2018-04-28 Online:2018-10-28 Published:2018-10-28
Contact: Li Yun-feng, Associate professor, Master’s supervisor, Department of Oral & Maxillofacial Surgery, West China Hospital of Stomatology, State Key Laboratory of Oral Diseases, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
About author:Guo Jiao-yang, Master candidate, Department of Oral & Maxillofacial Surgery, West China Hospital of Stomatology, State Key Laboratory of Oral Diseases, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81300858

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

纤维蛋白凝胶：一种天然的具有较好生物相容性、生物可降解性及可塑性的高分子材料，在临床中主要用作生物分子释药载体、生物支架及填塞物等，起促进组织修复的作用。实验所用纤维蛋白凝胶由纤维蛋白原和凝血酶混合而成。

牵张成骨：通过对骨皮质切开的两骨段施加持续、稳定、缓慢的牵张力，刺激牵张区骨与软组织的再生，在临床中被广泛用于治疗各种病理条件下骨缺损及骨结构畸形，然而在这个过程中也同时存在着治疗周期长、成骨(或组织)质量不佳、并发症较多等缺点。

背景：关于药物缓释载体携载骨形态发生蛋白2在骨折愈合和骨缺损中的研究报道较多，但其在牵张成骨中的作用研究较少。

目的：探讨人重组骨形态发生蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2)复合纤维蛋白凝胶对兔胫骨牵张成骨骨形成的作用。

方法：采用酶联免疫吸附测定法检测rhBMP-2复合纤维蛋白凝胶的体外释放动力学。取48只健康新西兰大白兔，选取右侧胫骨行牵张成骨，胫骨延长10 mm后，随机分4组干预，牵张间隙内分别注射赋形剂(对照组)、纤维蛋白凝胶、rhBMP-2、rhBMP-2复合纤维蛋白凝胶。注射4，8周后，进行牵张胫骨X射线检测；注射8周后，进行Micro-CT、生物力学及组织学检测，观察牵张区骨痂成骨情况。

结果与结论：①体外药物释放实验显示，纤维蛋白凝胶可延长体外rhBMP-2的作用时间，整个周期可达17 d；②X射线显示，rhBMP-2复合纤维蛋白凝胶组牵张间隙内放射密度最高，皮质骨连接最好；③Micro-CT显示，rhBMP-2复合纤维蛋白凝胶组牵张区骨矿物质密度、骨体积分数、皮质骨厚度明显优于其他3组(P < 0.05)；④组织学观察显示，rhBMP-2组、rhBMP-2复合纤维蛋白凝胶组牵张间隙皮质骨形成和骨连接效果好于对照组、纤维蛋白凝胶组，且rhBMP-2复合纤维蛋白凝胶组牵张间隙皮质骨形成和骨连接效果好于rhBMP-2组；⑤生物力学测试显示，rhBMP-2组、rhBMP-2复合纤维蛋白凝胶组极限载荷高于对照组、纤维蛋白凝胶组(P < 0.05)，且rhBMP-2复合纤维蛋白凝胶组极限载荷高于rhBMP-2组(P < 0.05)；⑥结果表明，纤维蛋白凝胶是一种理想的rhBMP-2缓释载体，rhBMP-2复合纤维蛋白凝胶可促进兔胫骨牵张成骨中的骨形成。

ORCID: 0000-0001-8729-7158(郭娇阳)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 人重组骨形态发生蛋白2, 牵张成骨, 纤维蛋白凝胶, 骨生成, 缓释, 生物材料

Abstract:

BACKGROUND: Numerous reports have been made on the use of bone morphogenetic protein-2 suspended in sustained release carrier in the fracture healing and bone defect repair. However, little is reported on its effect during distraction osteogenesis.

OBJECTIVE: To investigate the effect of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) suspended in fibrin gel on bone formation during distraction osteogenesis in rabbits.

METHODS: The in vitro release kinetics of rhBMP-2 suspended in fibrin gel was tested using an enzyme-linked immunosorbent assay. Unilateral tibial lengthening 10 mm was achieved in 48 healthy New Zealand rabbits. After the completion of osteodistraction, vehicle, fibrin, rhBMP-2 or rhBMP-2 suspended in fibrin (rhBMP-2+fibrin) was injected into the center of lengthened gap in the corresponding group with 12 animals in each group. At 8 weeks after injection, distracted callus was examined by histological, Micro-CT and biomechanical tests. Radiographs of the distracted tibia were taken at both 4 and 8 weeks after injection.

RESULTS AND CONCLUSION: Fibrin gel prolonged the life span of rhBMP-2 in vitro with a sustained release during 17 days. The rabbits undergoing treatment with rhBMP-2+fibrin gel showed the best results in radiation density and cortical bone connection by the radiological observation, in bone mineral density, bone volume fraction, and cortical bone thickness by the Micro-CT evaluation and in ultimate load by the biomechanical test when compared to other groups (P < 0.05). In histological images, rhBMP-2+fibrin treatment showed increased callus formation and better gap bridging compared to the other groups. To conclude, fibrin gel holds the promise to be a good carrier of rhBMP-2, and rhBMP-2 suspended in fibrin promotes bone formation in the rabbit model of tibial distraction osteogenesis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Bone Morphogenetic Proteins, Fibrin, Gels, Osteogenesis, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

郭娇阳，徐陆晨，李运峰. 骨形态发生蛋白2复合纤维蛋白凝胶促进兔胫骨牵张成骨[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(30): 4763-4768.

Guo Jiao-yang, Xu Lu-chen, Li Yun-feng. Recombinant human bone morphogenetic protein-2/fibrin gel enhances bone formation in a rabbit model of tibial distraction osteogenesis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(30): 4763-4768.

图/表（结果） 7

2.1 rhBMP-2的体外释放动力学分别检测50，500 IU凝血酶制备的纤维蛋白凝胶缓释rhBMP-2的释放动力学，两组释放曲线相似(图2)，随着时间的推移，rhBMP-2的释放量逐渐增多，70%的rhBMP-2在前3 d呈爆发性释放，之后持续释放，直到第17天。实验中使用由50 IU凝血酶制备的纤维蛋白凝胶支架。

2.2 动物实验影像学结果 X射线片结果显示，注射4，8周后的各组牵张间隙内新骨形成和改建情况，见图3。对照组和纤维蛋白凝胶组没有可辨别的放射密度不同；rhBMP-2组牵张间隙的放射密度高于对照组和纤维蛋白凝胶组，表明矿化有所增强；在rhBMP-2复合纤维蛋白凝胶组观察到牵张间隙内最高的放射密度和最好的皮质骨连接。通过图像编辑通信系统定量分析4组牵张胫骨象素值比，结果见表1，与rhBMP-2组比，rhBMP-2复合纤维蛋白凝胶组注射4，8周后的象素值比分别增加了71.1%和37.5%(P < 0.05)。

2.3 动物实验Micro-CT检查结果图4示为各组Micro-CT图像，图5示定量分析结果。与影像学结果一致，对照组和纤维蛋白凝胶组骨矿含量、股矿物密度、骨体积分数和皮质骨厚度值较低；相比于对照组和纤维蛋白凝胶组，rhBMP-2组的结果较好；从图像中可看出，rhBMP-2复合纤维蛋白凝胶组牵张间隙内皮质骨形成和骨连接明显优于其他组，同时也说明在rhBMP-2复合纤维蛋白凝胶组骨矿含量、股矿物密度、骨体积分数和皮质骨厚度值最高。

2.4 动物实验组织学观察结果图6示各组牵张胫骨的组织学图片，与影像学和Micro-CT结果一致，纤维蛋白凝胶组相比于对照组并没有促进骨痂形成；相比对照组和纤维蛋白凝胶组，经rhBMP-2治疗的两组皮质骨均增厚，但rhBMP-2复合纤维蛋白凝胶组牵张间隙皮质骨形成和骨连接的效果优于单独使用rhBMP-2组。

2.5 动物实验生物力学测试结果图7示三点弯曲实验结果，对照组和纤维蛋白凝胶组延长胫骨极限荷载没有明显区别；与对照组比，经rhBMP-2治疗的两组延长胫骨极限荷载有所增加，在rhBMP-2复合纤维蛋白凝胶组组中更为明显，说明rhBMP-2与纤维蛋白凝胶联合治疗有效促进了牵张间隙内骨形成。然而，rhBMP-2复合纤维蛋白凝胶组牵张胫骨的愈合能力仍然远远小于对照组中对侧正常胫骨。

参考文献

[1] McCarthy JG,Katzen JT,Hopper R,et al.The first decade of mandibular distraction: lessons we have learned.Plast Reconstr Surg. 2002;110: 1704-1713.

[2] 李永頔,朱鹏娜,王冬香,等.骨保护素/核因子κB受体活化因子配体在甲状旁腺激素调控下颌骨牵张成骨中的表达效应[J].华西口腔医学杂志, 2016, 34(3):234-238.

[3] Saleh M,Royston S.Management of nonunion of fractures by distraction with correction of angulation and shortening.J Bone Joint Surg B. 1996; 78:105-109.

[4] Aronson J.Limb-lengthening, skeletal reconstruction, and bone transport with the Ilizarov method.J Bone Joint Surg Am.1997;79:1243-1258.

[5] 谢红军,王银龙,周健.低强度脉冲超声对牵张成骨新骨形成的研究进展[J].国际口腔医学杂志,2008,35(2):186-188．

[6] El-Hakim IE,Azim AM,El-Hassan MF,et al.Preliminary investigation into the effects of electrical stimulation on mandibular distraction osteogenesis in goats.Int J Oral Maxillofac Surg.2004;33:42-47.

[7] Aronson J.Modulation of distraction osteogenesis in the aged rat by fibroblast growth factor. Clin Orthop Relat Res.2004;(425):264-283.

[8] Li G,Ryaby JT,Carney DH,et al.Bone formation is enhanced by thrombin-related peptide TP508 during distraction osteogenesis.J Orthop Res.2005;23:196-202.

[9] Haque T,Hamade F,Alam N,et al.Characterizing the BMP pathway in a wild type mouse model of distraction osteogenesis.Bone. 2008;42: 1144-1153.

[10] Yang X,Gong P,Lin Y,et al.Cyclic tensile stretch modulates osteogenic differentiation of adipose-derived stem cells via the BMP-2 pathway. Arch Med Sci.2010;6:152-159.

[11] Rakian A,Yang WC,Gluhak-Heinrich J,et al.Bone morphogenetic protein-2 gene controls tooth root development in coordination with formation of the periodontium.Int J Oral Sci.2013; 5:75-84.

[12] Issa JP,do Nascimento C,Lamano T,et al.Effect of recombinant human bone morphogenetic protein-2 on bone formation in the acute distraction osteogenesis of rat mandibles.Clin Oral Implants Res.2009;20:1286-92.

[13] Ashinoff RL,Cetrulo CL Jr,Galiano RD,et al.Bone morphogenic protein-2 gene therapy for mandibular distraction osteogenesis.Ann Plast Surg. 2004;52:585-590;discussion 591.

[14] Li G,Bouxsein ML,Luppen C,et al.Bone consolidation is enhanced by rhBMP-2 in a rabbit model of distraction osteogenesis.J Orthop Res. 2002;20:779-788.

[15] 黄鑫,孟国林,刘建,等.rhBMP-2壳聚糖微球的制备及体外检测[J].中国矫形外科杂志, 2009,17(15):1172-1174.

[16] Chung YI,Ahn KM,Jeon SH,et al.Enhanced bone regeneration with BMP-2 loaded functional nanoparticle-hydrogel complex.J Control Release.2007;121:91-99.

[17] Hosseinkhani H,Hosseinkhani M,Khademhosseini A,et al. Bone regeneration through controlled release of bone morphogenetic protein-2 from 3-D tissue engineered nano-scaffold.J Control Release. 2007;117: 380-386.

[18] Wildemann B,Kandziora F,Krummrey G,et al.Local and controlled release of growth factors (combination of IGF-I and TGF-beta I, and BMP-2 alone) from a polylactide coating of titanium implants does not lead to ectopic bone formation in sheep muscle.J Control Release.2004; 95:249-256.

[19] 黄琳琳,曾奕明,施丽泳.多种生长因子纤维蛋白凝胶释放系统的建立[J].国际呼吸杂志, 2015,35(10):766-770.

[20] Chudek J,Kowalczyk A,Kowalczyk AK,et al.Quality of life (QOL) evaluation after acute coronary syndrome with simultaneous clopidogrel treatment.Arch Med Sci. 2014;10:33-38.

[21] Pandit AS,Wilson DJ,Feldman DS.Fibrin scaffold as an effective vehicle for the delivery of acidic fibroblast growth factor (FGF-1).J Biomater Appl. 2000;14:229-242.

[22] Taylor SJ,Sakiyama-Elbert SE.Effect of controlled delivery of neurotrophin-3 from fibrin on spinal cord injury in a long term model.J Control Release.2006;116:204-210.

[23] Gorodetsky R,Peylan-Ramu N,Reshef A,et al.Interactions of carboplatin with fibrin(ogen), implications for local slow release chemotherapy.J Control Release.2005;102:235-245.

[24] Wang EA,Rosen V,D'Alessandro JS,et al.Recombinant human bone morphogenetic protein induces bone formation.Proc Natl Acad Sci U S A. 1990;87(6):2220-2224.

[25] Singh S,Song HR,Venkatesh KP,et al.Analysis of callus pattern of tibia lengthening in achondroplasia and a novel method of regeneration assessment using pixel values. Skeletal Radiol. 2010;39:261-266.

[26] Song SH,Sinha S,Kim TY,et al.Analysis of corticalization using the pixel value ratio for fixator removal in tibial lengthening.J Orthop Sci. 2011; 16:177-183.

[27] Zheng LW,Wong MC,Rabie AB,et al.Evaluation of recombinant human bone morphogenetic protein-2 in mandibular distraction osteogenesis in rabbits: Effect of dosage and number of doses on formation of bone.Br J Oral Maxillofac Surg.2006;44:487-494.

[28] Abbaspour A,Takata S,Sairyo K,et al.Continuous local infusion of fibroblast growth factor-2 enhances consolidation of the bone segment lengthened by distraction osteogenesis in rabbit experiment.Bone. 2008; 42:98-106.

[29] Kona? E,Emin Mavili M,Korkusuz P,et al.Acceleration of distraction osteogenesis with drug-releasing distractor.J Craniofac Surg. 2009;20: 2041-2048.

[30] Foley RL,Nixon AJ.Insulin-like growth factor I peptide elution profiles from fibrin polymers determined by use of high-performance liquid chromatography.Am J Vet Res. 1997;58:1431-1435.

[31] Brittberg M,Sjögren-Jansson E,Lindahl A,et al.Influence of fibrin sealant (Tisseel) on osteochondral defect repair in the rabbit knee.Biomaterials. 1997;18:235-242.

[32] Fakhry A,Ratisoontorn C,Vedhachalam C,et al.Effects of FGF-2/-9 in calvarial bone cell cultures: differentiation stage-dependent mitogenic effect, inverse regulation of BMP-2 and noggin, and enhancement of osteogenic potential.Bone.2005;36:254-266.

[33] Otto F,Thornell AP,Crompton T,et al.Cbfa1, a candidate gene for cleidocranial dysplasia syndrome, is essential for osteoblast differentiation and bone development.Cell. 1997;89:765-771.

[34] 杨绍安,靳安民.富含酸性成纤维细胞生长因子纤维蛋白凝胶预防失神经支配运动终板退行性变的免疫组织化学研究[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(16):3089-3092.

引言

牵张成骨又称为骨痂延长、骨痂撑开和骨牵张，是用于修复骨骼缺损，延长或扩宽肢体骨骼的一种外科技术。在牵张过程中，骨皮质切开术切开的两骨段在张力作用下逐渐分离，从而刺激牵张间隙内新骨形成^[1-2]。由于牵张成骨在延长或扩宽骨骼的同时可以增加其周围软组织的量，因此在整形外科及颅面缺损修复方面应用广泛^[3-4]。然而牵张成骨所需治疗时间较长，成骨(或组织)质量不佳，并发症较多，其在临床应用中受到了一定限制。

学者们尝试了很多种加快牵张成骨中骨生成的方法，比如机械压缩、电或电磁刺激、低强度脉冲超声，以及使用一些生长因子和细胞因子等^[5-8]，虽然其中部分研究结果较为理想，但是对人类有效的方法却很少。作为一种高效骨诱导因子，骨形态发生蛋白对胚胎骨生长，骨折愈合，牵张成骨中的骨形成等意义重大^[9-11]。局部注射人重组骨形态发生蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2)加快骨形成的作用，也在很多牵张成骨模型中得到了证实^[12-14]。然而，由于外源性骨形态发生蛋白2在体内半衰期短，无法长时间保持有效的活性，更为理想的骨形成似乎需要合适的载体，以延长骨形态发生蛋白2在体内的作用时间。

许多载体物质可以复合rh-BMPs的同时不损伤其骨诱导活性^[15-18]，但使用天然生物材料却是最佳的选择。由纤维蛋白原和凝血酶混合而成的纤维蛋白凝胶，本身就是一种生理相关基质，不仅可以促进伤口区细胞相互作用，而且可为骨愈合提供合适基质，因此被认为是一种天然伤口愈合基质^[19-20]。由于具有较好的生物相容性、生物可降解性及与细胞较强的结合能力，纤维蛋白凝胶作为一种理想的赋形剂和生物分子释放载体，在细胞迁移和生长因子应用方面意义重大^[21-23]。

实验中应用天然生物材料纤维蛋白凝胶作为rhBMP-2的缓释载体，通过延长体外rhBMP-2的作用时间，探讨了其对兔胫骨延长区骨形成的作用，采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测rhBMP-2的体外释放动力学，通过影像学、组织学、Micro-CT和生物力学测试评价控释系统在体内的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2017年2至10月在四川大学华西口腔医学院口腔疾病研究国家重点实验室完成。

1.3 材料 Tissucols®试剂盒(Baxter AG，Vienna，Austria)；rhBMP-2(R&D Systems，Minneapolis，USA)；ELISA试剂盒(BMP-2 Quantikine enzyme-linked immunosorbent assay kit，R&D Systems，Minneapolis， USA)；Micro-CT80(Scano Medical AG，Switzerland)；商业材料分析系统(Instron 4302；Instron，Norwood，MA，USA)。

实验动物：实验使用48只6月龄新西兰大白兔，由四川大学华西动物实验中心提供，许可证号：SCXK(川) 2103-17，体质量2.5-3.5 kg。所有动物实验均遵照四川大学动物伦理委员会的要求。实验动物单笼饲养，在12 h昼夜交替的标准环境条件下，喂以食物和水。所有动物在整个实验周期中自由活动。

1.4 实验方法

1.4.1 体外释放实验

纤维蛋白凝胶的制备：按照Tissucols®试剂盒说明书制备纤维蛋白凝胶。用双联注射器的2个针筒分别打出 25 µL 50 IU或500 IU凝血酶溶液和纤维蛋白溶液。参照既往研究^[24]，100 µg rhBMP-2可有效促进骨痂形成。因此研究中每只动物使用100 µg rhBMP-2。将rhBMP-2加到凝血酶中，混匀，然后再加入纤维蛋白原溶液，最后用移液枪将混合物移到无菌注射器中待用。

rhBMP-2的体外释放检测：将含100 µg rhBMP-2的纤维蛋白凝胶支架置入盛有1 mL PBS的离心管中，37 ℃温育24 h之后，用1 mL新鲜PBS置换释放介质，以监测支架中rhBMP-2的持续释放情况，重复以上步骤21次。按照说明书，在室温下用ELISA试剂盒测定rhBMP-2的释放浓度，每个样本做3个复孔。取3次结果的平均值，用以计算rhBMP-2的累积释放量。

1.4.2 动物实验

动物模型建立：所有实验兔经静脉分别注射20 mg/kg 戊巴比妥钠和4 mg/kg盐酸氯胺酮钠麻醉。将新西兰大白兔固定于手术台上，取右后肢中间入路，施以2 cm的切口以暴露胫骨，小心分离骨膜。安放带4个自攻螺丝的自制单边外置牵张器于胫骨，在第2，3根螺丝之间用一线锯行骨膜下骨切开术，骨切开线的位置基本位于靠近腓骨端下(图1)。最后复位骨膜，肌肉和皮肤，3-0丝线缝合创口。外置牵张器则原位保留至活检。骨切开术7 d后，以1 mm/d的速率(每12 h牵张0.5 mm)连续牵张10 d，共延长胫骨10 mm。

实验分组干预：牵张结束后，将48只实验模型动物随机分为4组，每组12只。按照牵张间隙内注射试剂的不同分为：对照组注射0.5 mL生理盐水(赋形剂)；纤维蛋白凝胶组注射50 µL纤维蛋白凝胶；rhBMP-2组注射100 µg rhBMP-2(将100 µg rhBMP-2溶解于0.5 mL生理盐水中)；rhBMP-2复合纤维蛋白凝胶组注射50 µL纤维蛋白凝胶+ 100 µg rhBMP-2。注射8周后，注射过量戊巴比妥钠处死实验动物，切取牵张胫骨标本。

1.5 主要观察指标

1.5.1 影像学评价注射后4，8周后，拍摄牵张胫骨的正侧位X射线片。机器条件设置为40 kV，1.2 mA。参照既往研究，通过图像编辑通信系统(PACS，INFINITT Co. Ltd，Seoul Korea)用象素值比定量比较组间成骨情况^[25-26]。

1.5.2 Micro-CT检查注射8周后，采用Micro-CT80分析胫骨牵张区再生骨组织及其周围骨组织的形态和骨量变化，每组6例。将样本保存在体积分数10%甲醛中，以防止在扫描过程中干燥。三维重建后，感兴趣区被定义为10 mm长的牵张骨痂。检测感兴趣区域的骨矿物质密度、骨矿含量、骨体积分数和皮质骨厚度。

1.5.3 组织学分析 Micro-CT检测之后，取牵张区胫骨标本置于体积分数10%甲醛液中固定5 d，在4 ℃ 15%的EDTA中脱钙6周，然后脱水。经石蜡包埋后，按6 µm厚切取冠状面切片，行苏木精-伊红染色，用于组织学分析，每组6例。

1.5.4 生物力学测试小心分离软组织，用一商业材料分析系统(Instron 4302；Instron，Norwood，MA，USA)对牵张区胫骨进行三点弯曲实验，以分析其生物力学性质，每组6例。对照组的对侧胫骨作为正常对照。在向下压缩过程中，记录载荷位移曲线。牵张区胫骨的极限荷载用于统计学分析。

1.6 统计学分析所有数据以x(_)±s的形式表示，结果采用SPSS 12.0(SPSS，Chicago，IL，USA)统计软件进行方差分析和SNK检验，以检测组间差异情况，当P < 0.05时认为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

骨形态发生蛋白2作为骨和软骨前体细胞的一种主要分化因子，其诱导骨形成和促进骨缺损愈合的作用在很多动物实验中都得到了证实。学者们已研究过局部应用骨形态发生蛋白2在不同模型中对牵张成骨的影响。在这些实验中得益于其有效的成骨能力，骨形态发生蛋白2明显促进了延长骨段的骨形成。然而，骨形态发生蛋白2在溶液中的半衰期较短，想要通过注射含骨形态发生蛋白2的溶液获得理想的骨形成仍存在一定困难。参照前期研究，在所需部位注射高剂量生长因子或持续给药能更有效地加快骨形成^[27-29]，但必须要考虑感染、长期使用的安全性及相关费用等问题。将骨形态发生蛋白2与合适的载体复合可较容易地克服单纯生物因子治疗的缺点。骨形态发生蛋白2与载体结合可减缓其扩散速率和被组织蛋白酶降解的速率，因此被认为可有效提高骨形态发生蛋白2的骨诱导能力。

已有研究报道过应用于骨缺损和骨折愈合中持续释放骨形态发生蛋白2的载药系统，但是很少有实验研究骨形态发生蛋白2复合载体在牵张成骨中的作用。Li等^[14]发现rhBMP-2和可吸收胶原海绵联合应用对牵张成骨骨形成有促进作用。但是在此实验中，rhBMP-2/缓冲液和rhBMP-2/胶原海绵对成骨的影响并没有明显区别，提示胶原海绵并不能有效维持牵张区rhBMP-2的稳定水平。此研究中另一个重要问题是需要进行二次手术将胶原海绵取出。另一研究表明与一次性注射含rhBMP-2壳聚糖相比，药物释放牵张器缓释rhBMP-2壳聚糖凝胶的方法，进一步提高了牵张成骨的影像学和组织学参数^[29]。然而，此实验中缺乏单独使用rhBMP-2对成骨作用的数据，所以很难得出有效结论。

作为临床上一种良好的组织密封剂，纤维蛋白凝胶被越来越多地被用作转运生长因子的载体，应用于组织工程^[19-22]。此次体外释放实验表明，两种不同浓度凝血酶制成的纤维蛋白凝胶，均可持续释放rhBMP-2。考虑到操作的简便性，此次研究中最终用于动物实验的纤维蛋白凝胶由50 IU的凝血酶制备。因为将rhBMP-2整合到含500 IU凝血酶的高分子纤维蛋白凝胶中存在一定难度。据前期研究报道，纤维蛋白复合物携载25 µg胰岛素样生长因子1可在体外释放有效成分达22 d^[30]。另一研究表明，移植纤维蛋白可在原位缓释药物至少2周^[31]。与既往研究结果一致，此次实验指出，rhBMP-2复合纤维蛋白凝胶缓释周期可达 17 d，最终释放量为总量的95%，而70%的rhBMP-2在则前3 d释放。在体内应用时，这种前期爆发性的释放过程可以对成骨细胞形成强有力的刺激，加速骨形成。

既往研究指出在细胞环境中，纤维蛋白可与一系列蛋白特异结合，包括纤维蛋白原、白蛋白、FGF2和血管内皮生长因子，从而有利于未分化间充质干细胞的迁移和分化^[32-34]。有研究表明，纤维蛋白凝胶作为一种生物支架材料，可有效促进大鼠颅骨缺损模型中骨再生^[19]。然而，在骨组织工程中调节骨形成的生物学机制与牵张成骨不同。此次研究中与对照组比，纤维蛋白凝胶组对骨形成并没有表现出促进作用，说明纤维蛋白凝胶仅是一种缓释生物因子的载体，其自身对增强成骨没有任何影响。

稳定期是牵张成骨骨形成中一个很重要的阶段，在此期间，外源性骨形态发生蛋白2作用于骨痂中的成骨细胞，从而加强骨痂矿化。与前期研究结果一致^[14^，²⁷^，^29]，此次实验结果明确表明，rhBMP-2的应用明显促进了延长骨段的骨钙化。在药物治疗后8周，对经rhBMP-2治疗两组进一步比较发现，rhBMP-2复合纤维蛋白凝胶组影像学、组织学、Micro-CT和生物力学测试等检测结果均明显优于单独使用rhBMP-2组，提示联合应用rhBMP-2和纤维蛋白凝胶可增强rhBMP-2的治疗作用。既往研究指出，单独使用rhBMP-2对牵张成骨骨愈合的作用呈剂量依赖性^[27^，^29]。在此次实验中两药物治疗组注射的rhBMP-2剂量相同，但没有载体复合的rhBMP-2在体内扩散较快且容易被蛋白酶降解，导致其在注射部位的有效浓度和剂量在短时间内低于治疗水平。然而纤维蛋白凝胶可保护体内rhBMP-2免被酶降解，同时，纤维蛋白凝胶的缓释作用可使rhBMP-2以较高的水平稳定表达。

结论：研究结果表明8周的观察期结束后，纤维蛋白凝胶复合rhBMP-2加快了兔胫骨牵张间隙内的骨再生，牵张间隙内的骨痂形成和骨连续性明显优于单独使用rhBMP-2。因此推断，纤维蛋白凝胶是一种理想的rhBMP-2的缓释载体，rhBMP-2复合纤维蛋白凝胶可延长rhBMP-2的作用时间，加强其对骨形成的促进作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

骨形态发生蛋白2复合纤维蛋白凝胶促进兔胫骨牵张成骨

Recombinant human bone morphogenetic protein-2/fibrin gel enhances bone formation in a rabbit model of tibial distraction osteogenesis

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 7

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	李黎, 马力. 磁性壳聚糖微球固定化乳糖酶及其酶学性质[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 576-581.
[2]	周安琪, 唐渝菲, 吴秉峰, 向琳. 骨膜组织工程设计：共性与个性的结合[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3551-3557.
[3]	甘丽莉, 熊娜, 刘燕飞. 水凝胶药物支架修复皮肤创面：临床应用可能性的挑战[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3578-3583.
[4]	郎丽敏, 何生, 姜增誉, 胡奕奕, 张智星, 梁敏茜. 导电复合材料在心肌梗死组织工程治疗领域的应用进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3584-3590.
[5]	刘方, 单争明, 汤雨蕾, 伍晓敏, 田卫群. 臭氧缓释水凝胶止血及促伤口愈合作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3445-3449.
[6]	刘鋆, 杨龙, 王伟宇, 周玉虎, 吴颖, 卢涛, 舒莉萍, 马敏先, 叶川. 聚3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯/聚乙二醇/氧化石墨烯组织工程支架的制备和性能评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3466-3472.
[7]	解健, 苏俭生. 静电纺丝取向纳米纤维作为组织工程生物支架的优势与特征[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2575-2581.
[8]	纪琦, 喻正文, 张剑. 3D打印金属基生物材料工艺和临床应用的问题与趋势[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2597-2604.
[9]	宋涯含, 吴云霞, 范道洋. 基于VOSviewer生物医学领域3D打印的知识图谱分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(15): 2385-2393.
[10]	钱楠楠, 张潜, 杨睿, 敖俊, 章涛. 间充质干细胞治疗脊髓损伤：细胞治疗及联合新药和生物材料[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 2114-2120.
[11]	罗雅馨, 毕浩然, 陈晓旭, 杨琨. 细胞外基质与组织的再生与修复[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(11): 1785-1790.
[12]	贾巍, 张满栋, 陈维毅, 王晨艳, 郭媛. 股骨假体材料对人工膝关节置换性能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1477-1481.
[13]	张利兴, 田昂, 李锡, 白希壮. TiO₂纳米管/羟基磷灰石载万古霉素涂层的释药性及生物毒性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1500-1506.
[14]	王倩, 李璐, 舒静媛, 董志恒, 靳友士, 王青山. 氧化锆基纳米羟基磷灰石功能梯度生物材料的微观形貌和物相分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1517-1521.
[15]	史正亮, 张华, 范志勇, 马维, 袁鹤, 杨冰. 几丁糖/聚乙烯醇导管联合脑源性神经营养因子缓释微球修复大鼠周围神经缺损[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1555-1559.