建立双膦酸盐性颌骨坏死动物模型

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.36.011

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (36): 5799-5805.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.36.011

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建立双膦酸盐性颌骨坏死动物模型

吴世超1，王颖姝2，轩宾1，张健1

1天津医科大学口腔医院，天津市 300070；2天津市滨海新区塘沽口腔医院，天津市 300450

收稿日期:2017-08-30 出版日期:2017-12-28 发布日期:2018-01-04
通讯作者: 张健，主任医师，天津医科大学口腔医院口腔颌面外科，天津市 300070
作者简介:吴世超，男，1980年生，天津市人，满族，2004年佳木斯大学口腔医学院毕业，医师，主要从事口腔修复及种植修复方面工作。
基金资助:
天津市高等学校科技发展基金计划项目(20130130)

Establishing an animal model of bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw

Wu Shi-chao1, Wang Ying-shu2, Xuan Bin1, Zhang Jian1

1Stomatological Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China; 2Tanggu Stomatological Hospital of Binhai New District, Tianjin 300450, China

Received:2017-08-30 Online:2017-12-28 Published:2018-01-04
Contact: Zhang Jian, Chief physician, Stomatological Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China
About author:Wu Shi-chao, Physician, Stomatological Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China
Supported by:
the Science and Technology Development Program of Tianjin Universities, No. 20130130

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
双膦酸盐：双膦酸盐(bisphosphonate，BP)作为抗骨吸收药物，临床上广泛用于治疗骨质疏松、佩吉特病以及恶性肿瘤的骨转移。分为静脉滴注和口服两种给药方式，其中唑来膦酸是静脉给药的双膦酸盐药物中抗骨吸收特性最强的。
颌骨坏死：由于细菌感染以及物理或化学因素，使颌骨产生炎性病变，导致活性骨组织死亡，形成死骨。

摘要
背景：大部分双膦酸盐性颌骨坏死者由于拔牙、种植等颌骨创伤引起，创口不愈合，并发感染流脓，疼痛不适，最终死骨形成，其致病机制尚不清楚。
目的：建立成熟稳定的双膦酸盐性颌骨坏死动物模型，观察双膦酸盐性颌骨坏死的临床表现、影像学改变及组织病理学特点，为进一步探讨双膦酸盐性颌骨坏死的致病机制奠定基础。
方法：24只雌性SD大鼠随机分为2组，每组12只。实验组腹腔注射唑来膦酸(0.2 mg/kg)，每周3次持续12周；对照组腹腔注射等量生理盐水，每周3次持续12周。12周后所有大鼠麻醉下拔除左下第1磨牙，临床观察拔牙创愈合情况。拔牙后8周所有动物安乐死。对大鼠左下颌骨进行X射线片检查和Micro-CT检查，探究其影像学改变。对下颌骨软硬组织进行苏木精-伊红染色和Masson染色，探究其组织病理学特点，进一步确定双膦酸盐性颌骨坏死动物模型。
结果与结论：①拔牙后8周，临床观察发现实验组大鼠拔牙创不愈合，并且实验动物口内可见死骨暴露；②影像学检查及组织病理学检查均证实双膦酸盐性颌骨坏死的发生；③组织学染色结果显示实验组拔牙创周围牙龈胶原纤维纤细；④结果说明，腹腔注射唑来膦酸联合拔牙的方法能够成功诱导大鼠发生双膦酸盐性颌骨坏死样病变。唑来膦酸的软组织毒性及抗血管形成作用能够促进双膦酸盐性颌骨坏死发生，创伤带来的酸性局部微环境也提高了发生双膦酸盐性颌骨坏死的可能性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-3537-2280(吴世超)

关键词: 组织构建, 骨组织工程, 颌骨, 骨坏死, 双膦酸盐, 唑来膦酸, 动物模型, 大鼠

Abstract:

BACKGROUND: Bisphosphonates-related osteonecrosis of the jaw (BRONJ) is thought to be caused by trauma to dentoalveolar structures after dental extraction and implantation that have a limited capacity for bone healing followed by infection, suppuration and pain, further inducing equestration, but the pathogenesis is poorly understood.
OBJECTIVE: To establish a stable animal model of BRONJ, and to observe its clinical manifestations, radiological changes and pathological characters, thereby paving ways for further understanding the pathogenesis of BRONJ.
METHODS: Twenty-four female Sprague-Dawely rats were randomly allocated into experimental and control groups (n=12 per group). The rats in the experimental group were given the intraperitoneal injection of 0.2 mg/kg zoledronic acid, and the controls received the intraperitoneal injection of same volume of normal saline, three times weekly for consecutive 12 weeks. Subsequently, left first mandibular molars were extracted under general anesthesia, and the bone healing was observed. At 8 weeks after tooth extraction, all the rats were euthanized. The rat left jaws were examined by X-ray and micro-CT to explore the imaging changes. The histopathological characteristics of the mandibular soft and hard tissues were investigated by hematoxylin-eosin staining and Masson staining, to further testify the BRONJ model.
RESULTS AND CONCLUSION: At 8 weeks after tooth extraction, the wound was unable to heal, and nonvital bone tissues were visible in the experimental group. The findings revealed on radiographies and pathological sections were in accordance with the characteristics of BRONJ. Masson staining results showed slender collagen fibrils around the dental extraction wound were slender in the experimental group. These results indicate that the intraperitoneal injection of zoledronate combined with tooth extraction can induce BRONJ in rats. The soft tissue toxicity and anti-angiogenesis of zoledronic acid can promote the occurrence of BRONJ, and the local acidic microenvironment caused by trauma probably is involved in the occurrence of BRONJ.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Phosphates, Jaw, Osteonecrosis, Models, Animal, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

吴世超，王颖姝，轩宾，张健. 建立双膦酸盐性颌骨坏死动物模型[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(36): 5799-5805.

Wu Shi-chao1, Wang Ying-shu2, Xuan Bin1, Zhang Jian1. Establishing an animal model of bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(36): 5799-5805.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 24只雌性SD大鼠随机分为2组，每组12只，分为实验组和对照组，给药期间对24只大鼠进行临床观察。其中2只实验组大鼠未成功建立BRONJ动物模型，模型建立成功率为83.3%。

2.2 临床观察结果在给药期间，每周记录实验动物的体质量，密切观察动物的健康状态，结果发现在没有外界创伤刺激的情况下，腹腔注射唑来膦酸第8周后，实验组大鼠体质量开始出现下降趋势，而对照组大鼠体质量依然保持稳定增长(见图1)。在拔牙以前，所有动物的口腔软硬组织均完好无破溃。在拔牙后4周，对照组大鼠拔牙创基本愈合，表面黏膜完整。而实验组大鼠拔牙创未愈合，表面黏膜未形成良好封闭。拔牙后8周，实验组大鼠拔牙创仍未愈合，表面黏膜较薄，并且有死骨暴露(见图2)。

2.3 影像学检查结果实验组X射线片检查显示，拔牙创位置未发生骨愈合，依然存在低密度影像。对照组X射线片检查显示，拔牙位置骨创基本愈合，未出现明显的低密度影像(见图3)。Micro-CT结果显示实验组拔牙位置依然存在不规则的骨缺损，并且在创口底部及四周存在不同程度的骨破坏和炎性吸收(见图4)。通过Micro-CT对大鼠下颌骨组织微结构进行定量分析，发现实验组大鼠拔牙创周围牙槽骨骨体积分数、骨密度、骨小梁数量及厚度均下降，骨小梁分离度升高(见表1)。

2.4 苏木精-伊红染色及Masson染色结果实验组拔牙创位置下颌骨的苏木精-伊红染色切片显示，拔牙创周围硬组织中骨陷窝空虚，骨小梁结构遭到破坏，存在大量炎性细胞以及死骨碎片。对照组拔牙创位置下颌骨的苏木精-伊红染色可见正常的骨陷窝及其中的骨细胞，骨小梁结构正常，排列紧密，在拔牙窝的表面已经形成的新的结缔组织覆盖，并且有新生血管(见图5)。

实验组拔牙创周围牙龈组织的苏木精-伊红染色结果显示，其上皮钉突变圆钝且排列不规则，个别位置牙龈上皮厚度明显降低，呈上皮萎缩。实验组组拔牙创对侧相应位置牙龈组织的苏木精-伊红染色结果显示其上皮钉突变短，但牙龈上皮的厚度没有明显变化。对照组拔牙创及对侧正常牙龈组织的苏木精-伊红染色结果显示，其上皮钉突狭长，牙龈上皮厚度较均匀一致(见图6)。实验组拔牙创及对侧相应位置的周围牙龈组织Masson染色结果显示，胶原纤维呈蓝色，比较纤细，并且排列紊乱。对照组拔牙创周围牙龈组织的Masson染色结果显示，胶原纤维正常，并且排列紧密(见图7)。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2016年12月在天津医科大学完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物及分组本次研究得到了天津医科大学动物伦理审查委员会的批准。选用8周龄健康雌性SD大鼠24只，体质量200-220 g，由天津医科大学动物实验中心提供，动物合格证编号：SCXK-(军)2012-0004，SPF级。实验基地位于天津医科大学动物实验中心。24只大鼠随机分为实验组和对照组，每组12只。所有动物接受标准实验饲养，保持饲养室内温度和湿度为(20±2)℃和40%-60%，每天12 h光照，适应性饲养3 d。

1.3.2 实验仪器和材料病理组织全自动脱水系统(Leica，德国)；Micro-CT(西门子临床前多学科影像产品Inven.PET.SPECT.CT，德国)；X射线牙片机(西诺德，德国)；组织石蜡包埋机(Leica，德国)；组织石蜡切片机(Leica，德国)；显微镜及成像系统(Nikon，日本)；唑来膦酸(Novartis公司惠赠，瑞士)；水合氯醛、EDTA Na2粉剂、二甲苯、Masson三色染色试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司)；苏木精-伊红染色试剂盒(北京嘉美生物有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 BRONJ动物模型的建立实验组大鼠腹腔注射唑来膦酸(剂量为0.2 mg/kg)每周给药3次，分别在周一、周三、周五的上午9：00至11：00对动物进行药物注射，持续12周。对照组动物腹腔注射等量生理盐水，每周3次持续12周。12周后在体积分数5%水合氯醛(剂量为 10 mL/kg )麻醉下行左下磨牙拔除术，术前禁食5 h，5 min后大鼠进入麻醉状态，将大鼠四肢固定，仰卧位打开口腔，碘伏消毒，阿替卡因局部麻醉，分离牙龈后利用血管钳拔除2颗左下磨牙，为了将拔牙创伤统一标准，利用台式低速手机配合球钻在拔牙创位置磨除一直径大小约2 mm的骨缺损，磨除过程中生理盐水降温，严格控制创口出血，棉球压迫止血，术后隔离复苏。术后3 d给予青霉素(每只大鼠腹腔注射8×10⁴U，1次/d)预防感染，术后进软食，1周后回复正常硬质食料。密切观察拔牙创愈合情况并记录。拔牙后8周动物全部安乐死(二氧化碳吸入)。取大鼠左侧下颌骨、拔牙创周围牙龈以及对侧牙龈。剔除骨骼表面附着的肌肉，生理盐水冲洗，组织置于40 g/L多聚甲醛中固定。

1.4.2 造模成功的检测标准造模后大鼠拔牙创愈合不良，黏膜未完全覆盖，有死骨暴露等表现；影像学检查显示拔牙创位置未发生愈合，存在低密度影像，在三维方向上有不同程度的炎性吸收和破坏，内部结构被破坏。下颌骨拔牙创硬组织切片检查发现，骨细胞消失，骨陷窝空虚，骨小梁结构被破坏，存在大量炎性细胞浸润，提示发生骨坏死。以上为BRONJ动物模型成功建立的标准。

1.5 主要观察指标

1.5.1 临床观察从腹腔注射唑来膦酸药物起，密切观察大鼠全身状况，并且每周记录大鼠体质量，直到进行拔牙操作。拔牙后密切观察大鼠拔牙创愈合情况。

1.5.2 影像学检查对固定后的下颌骨样本进行X射线片检查和Micro-CT扫描。所有组的拔牙侧下颌骨进行传统的X射线牙片机投照。采用平行投照的方式，距离焦点为 10 cm，曝光时间为0.18 s。利用Micro-CT扫描拔牙侧下颌骨的内部微结构。Micro-CT的采集设置为X射线管电压为80 kV，电流强度为500 μA。所成影像通过数字图像采集系统输入计算机，兴趣区域为拔牙创周围牙槽骨，进行分析比较。

1.5.3 组织形态学检查

(1)硬组织苏木精-伊红染色：将40 g/L多聚甲醛固定后的下颌骨放入EDTA脱钙液中(EDTANa2 100 g加入450 mL蒸馏水，加入20 g NaOH，加入0.2 mol/L的PBS 500 mL，最后稀盐酸调pH值到7.2，蒸馏水定容至1 000 mL)。脱钙期间保持隔3 d更换一次脱钙液，直到组织变软。然后利用病理组织全自动脱水系统对样本按照设定好的梯度乙醇和二甲苯依次进行脱水。脱水完成后石蜡包埋，沿下颌骨体长轴垂直方向切片(4 μm)、捞片、烤片，予苏木精-伊红染色。中性树脂封固，光镜下观察下颌骨硬组织并进行拍照。

(2)软组织苏木精-伊红及Masson染色：40 g/L多聚甲醛对拔牙创周围及对侧软组织进行固定后，进行常规梯度酒精脱水、包埋、切片(4 μm)、捞片、烤片。对软组织切片行常规苏木精-伊红染色。根据Masson染色试剂盒说明书，对软组织切片行Masson染色。光镜下观察拔牙创周围软组织并进行拍照。

1.6 统计学分析利用SPSS 20.0软件对实验数据进行统计学处理，数据采用x(_)±s的形式表示，组内比较采用重复测量方差分析，两组间比较采用t 检验，以双侧P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

3.1 BRONJ动物模型的建立研究通过腹腔注射唑来膦酸联合拔牙的方法成功建立BRONJ大鼠动物模型，模拟了BRONJ的发生发展过程和临床症状。

首先，在动物的选择方面，从机体系统发育角度来看，最能够模拟人类疾病发生、发展的动物是黑猩猩或者大猩猩。但是由于维持此类动物所需研究经费高昂，并且涉及到动物伦理相关问题，此类动物的应用受到限制。其他大型动物例如比格犬和小型猪，也被考虑建立BRONJ动物模型^[3]。其中Allen和Burr等学者通过长期用药，成功利用比格犬建立BRONJ 动物模型^[4-6]。Pautke等^[7]学者利用小型猪成功建立BRONJ动物模型。但是，大型动物高昂的花费使其没有得到广泛应用。在动物选择上，更多是选择啮齿类动物，从完成的基因图谱来看，SD大鼠与人类存在基因相似性，而且SD大鼠属于哺乳类动物，利用其建立动物模型能够模拟BRONJ在人体内的发生、发展过程。从体型来看，由于其颌骨尺寸大，便于实验操作例如拔牙。在选择动物的性别方面，以往存在两种观点，一种观点认为动物的性别在BRONJ模型建立过程中没有差异^[8-9]。另外一种观点认为，应该选择去势雌性大鼠，啮齿类动物不经过皮质内重建，研究表明经过卵巢切除能够刺激大鼠进行皮质内重建，卵巢切除的大鼠模仿人类皮质内成骨，提供可靠的动物模型研究。骨皮质内重塑遭到抑制可能为BRONJ致病机制中的一部分^[10]。但是，建立动物模型的首要目标是尽可能模拟颌骨坏死的临床表现。能够定义颌骨坏死的一个关键因素是暴露死骨是否持续存在超过8周，此应该为判断颌骨是否发生坏死的标准。在以往的动物模型研究中，有学者利用雄性Wistar大鼠^[11]，雄性SD大鼠^[8]，以及雌性SD大鼠^[12]，经过临床观察和组织学观察均确认发生颌骨坏死。这也说明抑制骨皮质内重塑并不是BRONJ致病机制中的一部分。

其次，在模型建立方法方面，建立BRONJ动物模型都是基于双膦酸盐药物联合创伤刺激的原理。双膦酸盐药物的给药方式包括口服、静脉注射以及腹腔注射。口服双膦酸盐胃肠道黏膜吸收率不足0.7%，静脉给药吸收率是口服给药吸收率的142.8倍^[13]。双膦酸盐类静脉给药经过6 h，有56%-66%保留在骨骼中^[14]。腹腔注射给药是通过腹膜吸收入血，与静脉注射的药物吸收率无明显差异。因此腹腔注射和静脉注射的给药方式建立动物模型周期较短。给予动物创伤的方式主要包括拔牙和牙周炎等方式^[10^，^15]。

另外，双膦酸盐药物的使用剂量方面也是经过慎重考虑。鉴于实验动物骨改建模式及基因表达与人类存在差异性，双膦酸盐药物在动物体内的摄取和再释放可能出现变化。因此，在建立BRONJ动物模型过程中确定唑来膦酸药物的使用剂量应该考虑以下几个方面：①肿瘤患者的唑来膦酸使用剂量为0.067 mg/(kg•周)；②啮齿类动物相对较快的骨代谢；③双膦酸盐药物的给药途径，腹腔注射及静脉注射能够提高血药浓度；④尽可能提高药物剂量，以缩短实验周期^[16]。结合以往研究经验，本次实验选择的药物剂量为0.2 mg/kg，每周3次，以此来适应SD大鼠较高的骨代谢速率，模拟肿瘤患者体内唑来膦酸的摄取和再释放模式，缩短实验周期。

3.2 BRONJ的临床表现、影像学改变以及组织形态学特点实验组大鼠下颌骨拔牙创位置出现愈合不良，黏膜未闭合，并且有死骨暴露，这十分符合以往研究病例中报道的BRONJ 的临床表现。

通过每日体质量记录发现，在实验期间，对照组大鼠体质量呈现上升趋势。然而，实验组大鼠在持续给药8周后，体质量出现下降趋势。唑来膦酸能够在一定程度上抑制大鼠体质量上升甚至是降低体质量的作用，在以往的研究中也有学者作出类似的报道，在70 d的实验期间，对照组大鼠体质量呈上升趋势，而实验组大鼠在27 d开始出现体质量增加趋势放缓^[17]。以往研究发现，长期应用唑来膦酸能够对肝脏和肾脏产生毒性作用，而且能够引起胃部血管扩张，继续发展下去能够在胃部形成炎性细胞病灶^[18-19]。因此，本研究认为唑来膦酸长期应用引起的肝、肾毒性以及胃部病变是导致大鼠体质量上升趋势放缓或体质量下降的原因。

影像学评价对于骨创伤的愈合非常重要，在以往建立的BRONJ动物模型中，有大约28%的病例出现影像学改变。本次研究发现，唑来膦酸组下颌骨拔牙创位置出现低密度影像，这种影像学改变能够在一定程度上反映拔牙创延迟愈合或者发生BRONJ，以往建立的BRONJ动物模型也发现类似X射线影像改变^[11]。Micro-CT结果显示实验组拔牙创位置依然存在较大范围不规则的骨缺损，骨结构遭到严重破坏。以往建立的动物模型也通过Micro-CT检测观察骨骼病变位置在三维方向上发生的改变，进一步了解病变范围以及骨骼结构发生的变化，其中包括骨密度、骨小梁数量、厚度以及分离度等评价指标^[16]。组织学评价是判断BRONJ最敏感的手段，在影像学检查的基础上本研究进行了进一步的组织形态学检测。

本研究发现，唑来膦酸组拔牙侧及拔牙对侧牙龈组织的苏木精-伊红染色结果均表现为，牙龈上皮的上皮钉突变圆钝且排列不规则，而且拔牙侧牙龈组织的苏木精-伊红染色显示个别位置牙龈上皮明显变薄。唑来膦酸组拔牙创及对侧相应位置的周围牙龈组织Masson染色结果均显示，胶原纤维纤细，并且排列紊乱。以上研究结果表明，唑来膦酸存在软组织毒性，并且能够干扰胶原纤维的形成。以往有学者研究发现，以接受BP患者口腔内最高药物浓度为基础，探究双膦酸盐对人类上皮细胞影响，发现唑来膦酸能够抑制上皮细胞代谢活性，诱导上皮细胞发生形态学改变和凋亡，表现出细胞毒性作用^[20-21]，这也在一定程度上解释了唑来膦酸组牙龈上皮钉突变圆钝且排列不规则的形成机制。与此同时，唑来膦酸能够抑制牙周膜成纤维细胞活性，并且能够诱导成纤维细胞发生坏死和凋亡^[22-23]，从而抑制胶原纤维形成，导致实验组Masson染色结果显示胶原纤维纤细，并且排列紊乱。拔牙创位置下颌骨苏木精-伊红染色结果显示，对照组拔牙创位置表现出明显的骨重建和骨形成，创口表面出现新生结缔组织，并且有血管形成为创口愈合和骨形成提供血运；实验组拔牙创周围骨陷窝空虚，出现碎裂的死骨片，并且存在大量炎性细胞，未见新生血管形成，这表明了唑来膦酸作用下大鼠拔牙创位置出现骨坏死。在以往学者建立的BRONJ动物模型中，也有类似这样的组织形态学表现^[17^，^24]。另外，有研究表明双膦酸盐药物不仅抑制破骨吸收，而且能够抑制血管形成，从而进一步促进骨坏死形成。实验研究发现唑来膦酸对血管内皮细胞增殖和迁移的抑制作用随药物浓度升高而逐渐显著，同时能够显著提高血管内皮细胞的凋亡^[25]。唑来膦酸对血管形成的抑制作用也一直被认为是引起BRONJ的致病机制的一部分。

从形态学观察，本研究发现拔牙侧的软组织毒性作用表现更为明显，这可能与唑来膦酸的释放机制有关。双膦酸盐中的膦酸基团能够螯合羟基膦灰石中的钙离子，结合到骨骼中的双膦酸盐依然保持对破骨细胞的毒性作用，双膦酸盐能够通过内吞作用进入破骨细胞，从而抑制其功能和诱导凋亡^[26]。双膦酸盐几乎对所有能够内化它的细胞类型产生影响，表现为双膦酸盐对其他细胞毒性作用，例如上皮细胞和牙龈成纤维细胞^[27]。双膦酸盐在展现细胞毒性作用之前，首先应该从骨骼中释放出来。颌骨中的双膦酸盐是通过酸性物质释放出来的。酸性物质来源主要存在两种。一种是破骨细胞在骨吸收过程中释放酸性物质，从而使得双膦酸盐从骨表面得到释放。另外一种是创伤引起的pH值降低，例如拔牙创的组织愈合通常经过炎症、修复和重塑阶段，常常产生酸性物质^[28]。酸性环境在感染和外科手术伤口愈合过程很常见。创伤愈合过程中导致局部组织酸化，随后pH值降低增加双膦酸盐的释放，对周围环境中的细胞产生毒性作用^[29-30]。另外酸性环境导致含氮双膦酸盐的质子活化，增加了相应衍生物潜在毒性水平。口腔微环境中感染和pH变化，导致双膦酸盐得到释放和含氮双膦酸盐毒性水平的提升，从而进一步增强了双膦酸盐的软组织毒性作用。这也解释了本次研究中，与唑来膦酸组拔牙对侧软组织比较，唑来膦酸组拔牙侧软组织表现出更明显的毒性破坏作用。大多数BRONJ患者都接受过牙槽外科治疗，例如拔牙、种植、根尖周炎以及牙周病治疗等，这些都能导致局部微环境pH降低，这也表明局部感染和创伤是BRONJ致病机制中的一部分。与此同时有学者通过实验研究发现，为拔牙后大鼠创造碱性的创口愈合环境，能够有效预防大鼠发生BRONJ^[31]，这也说明了酸性局部微环境在BRONJ的致病过程中起到促进作用。

与以往国内外学者建立BRONJ动物模型的成功率比较，本次研究建立BRONJ动物模型的成功率较高，能够建立比较成熟稳定的BRONJ动物模型。但实验组仍有2只大鼠未成功建立动物模型，其中原因可能是腹腔注射给药方式对于药物剂量的把控不够精准，操作失误导致未把足量唑来膦酸药物注入腹腔内，通过腹膜吸收入血。为了将足量药物注入大鼠体内，以后的模型建立将采用尾静脉注射的方式，保证每次注射是正确有效，才能保证足量药物进入大鼠体内，有望提高建立BRONJ动物模型的成功率。

综上所述，腹腔注射唑来膦酸联合拔牙创伤的方法成功建立BRONJ动物模型，唑来膦酸的软组织毒性及抗血管形成作用能够促进BRONJ发生，创伤带来的酸性局部微环境也提高了发生BRONJ的可能性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

建立双膦酸盐性颌骨坏死动物模型

Establishing an animal model of bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw

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