肺癌细胞株A549的常见肿瘤干细胞抗原分析和细胞分选比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.25.009

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (25): 3989-3994.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.25.009

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肺癌细胞株A549的常见肿瘤干细胞抗原分析和细胞分选比较

彭卓¹，党晓燕¹，张秋红²，张瑞¹，杨拴盈²

西安交通大学第二附属医院，¹急诊科，²呼吸内科，陕西省西安市 710004

修回日期:2017-07-12 出版日期:2017-09-08 发布日期:2017-10-09
通讯作者: 杨拴盈，博士，博士生导师，教授，主任医师，西安交通大学第二附属医院呼吸内科，陕西省西安市 710004
作者简介:彭卓，女，1980年生，陕西省西安市人，汉族， 2006年西安交通大学医学院毕业，硕士，主治医师。
基金资助:
国家自然科学基金(81350032)

Phenotypic analysis of common cancer stem cell markers and cell sorting in lung cancer cell line A549

Peng Zhuo¹, Dang Xiao-yan¹, Zhang Qiu-hong², Zhang Rui¹, Yang Shuan-ying²

¹Department of Emergency, ²Department of Respiratory Medicine, Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, Shaanxi Province, China

Revised:2017-07-12 Online:2017-09-08 Published:2017-10-09
Contact: Yang Shuan-ying, M.D., Doctoral supervisor, Professor, Chief physician, Department of Respiratory Medicine, Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, Shaanxi Province, China
About author:Peng Zhuo, Master, Attending physician, Department of Emergency, Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, Shaanxi Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81350032

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
细胞表型：细胞膜上(或细胞内)表达的分子种类谱系，一般在干细胞和肿瘤细胞应用较多，能够反映某些细胞的基本生物学特性。
肿瘤干细胞肿瘤球：肿瘤组织内存在的类似于干细胞的少数肿瘤细胞，该类细胞具有自我更新和多向分化的能力，是整个肿瘤组织细胞的祖细胞。肿瘤干细胞在低黏附和无血清的培养环境下生长，增殖为圆形的细胞球。

摘要
背景：多项研究表明癌症有可能是起源于肿瘤组织内一个细胞亚群即肿瘤干细胞，近期的研究发现肺癌内也存在肿瘤干细胞，但肺癌内存在的肿瘤干细胞的表型目前仍未取得一致。
目的：对人类非小细胞肺癌细胞株A549通过目前最常见的肿瘤干细胞表面抗原进行全面系统分析。

方法：A549肺癌细胞株在常规高糖培养环境下，培养1周后进行表面抗原的检测。使用流式细胞术分析A549细胞CD133，CD44，CD24以及ABC运转蛋白家族G2的表达情况，并且通过流式分选的方法分离出CD44⁺/CD24⁺和CD44⁺/CD24^-两类亚群细胞，在低黏附、无血清并添加生长因子的环境下观察肿瘤干细胞肿瘤球形成的能力。
结果与结论：①细胞表型变化：A549细胞中度表达肿瘤干细胞常见的抗原CD44(64.23%)和CD24(58.62%)，而CD133和ABC运转蛋白家族G2的表达率很低，均约为0.9%，其中CD133/CD44双阳性的细胞数比例极低。表型为CD44⁺/CD24⁺和CD44⁺/CD24^-的细胞群比例分别为54.64%和23.38%。两类亚群细胞在碱性成纤维细胞生长因子及表皮生长因子存在的条件下，无血清培养均可形成肿瘤干细胞肿瘤球；②肿瘤球形成效率：CD44⁺/CD24⁺和CD44⁺/CD24^-的细胞群其肿瘤干细胞肿瘤球形成效率与A549细胞相比差异无显著性意义；③结果说明：CD44和CD24也许并非肺癌肿瘤干细胞的特异性标志，对于肺癌内肿瘤干细胞的表型鉴别还需要更多的研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-6767-8049(彭卓)

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 肺癌, 细胞株A549, CD133, CD44, CD24, ABCG2, 肿瘤球, 碱性成纤维细胞生长因子, 表皮生长因子, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: It has been widely reported that the most types of cancer are probably originated from cancer stem cells (CSCs) which are subpopulations of tumor cells. Recent studies also suggested that lung cancer could arise from CSCs. However, the phenotypic characteristics of CSCs in lung cancer have not been precisely described.
OBJECTIVE: To systematically analyze the expression of the most common CSC markers in cell line A549.
METHODS: A549 cells were cultured for 1 week under the condition of conventional high glucose. After that, flow cytometry was used to assess the expression of putative stem cell markers, including CD133, CD24, CD44 and ABCG2. Cells were then sorted according to the expression of CD44 and CD24 markers by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and characterized using their sphere-forming capacity in serum free medium supplemented with several growth factors.
RESULTS AND CONCLUSION: A549 cells expressed the CSC markers CD44 and CD24 at 64.23% and 58.62%, whereas the expression of both ABCG2 and CD133 was around 0.9%. Double-positive CD44/133 populations were rare. CD44⁺/CD24⁺ and CD44⁺/CD24^- subpopulations respectively exhibited 54.64% and 23.38% expression. CD44⁺/CD24⁺ and CD44⁺/CD24^- subsets were sorted by FACS. Both isolated subpopulations formed spheres in the serum free medium supplemented with basic fibroblast growth factor and epidermal growth factor. However, there was no significant difference in the sphere formation efficiency among CD44⁺/CD24⁺ and CD44⁺/CD24^- subsets as well as A549 cells. Our findings suggest that CD44 and CD24 cannot be considered as potential markers for isolating lung CSCs in cell line A549, and further investigation using in vivo assays is required.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Tissue Engineering, Lung Neoplasms

中图分类号:

R394.2

彭卓，党晓燕，张秋红，张瑞，杨拴盈. 肺癌细胞株A549的常见肿瘤干细胞抗原分析和细胞分选比较[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(25): 3989-3994.

Peng Zhuo, Dang Xiao-yan, Zhang Qiu-hong, Zhang Rui, Yang Shuan-ying. Phenotypic analysis of common cancer stem cell markers and cell sorting in lung cancer cell line A549[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(25): 3989-3994.

图/表（结果） 1

2.1 A549细胞的常见肿瘤干细胞抗原分析 为了评估A549细胞内的肿瘤干细胞存在情况，实验使用流式细胞技术分析了最常见的肿瘤干细胞的表面标志包括CD133，CD44，CD24和ABCG2的表达情况。

如表1所示，实验发现A549细胞中度表达CD44和CD24，而CD133和ABCG2的表达水平极低，均在1%以下。鉴于CD44为很多类型的肿瘤包括肺癌肿瘤干细胞的表型之一，其与CD24联合使用进行肿瘤干细胞的纯化^[16-17^，^25]，如CD44⁺/CD24⁺为结肠癌的肿瘤干细胞^[19]，而CD44⁺/ CD24^-细胞群为乳腺癌和前列腺癌的肿瘤干细胞^[16^，^18]，因此对于A549细胞，实验同时使用荧光双抗体标记技术考察了A549细胞中CD44⁺CD24⁺和CD44⁺CD24^-两群细胞的比例，结果发现CD44⁺CD24⁺双阳性细胞的比例达到(54.64± 3.30)%，CD44⁺CD24^-的细胞比例为(23.38±2.70)%。表1列出了A549细胞的常见肿瘤干细胞的表达平均水平以及CD44⁺CD24⁺和CD44⁺CD24^-等各群细胞的比例情况，其中因A549细胞中CD133的表达比例很低，所以CD133⁺CD44⁺双阳性的比例很少。从流式细胞图中可以直接看出CD133，CD44，CD24和ABCG2的表达水平，同时也能直接获得CD44⁺CD24⁺和CD44⁺CD24^-等各群细胞的比例情况(图1)。

2.2 CD44⁺/CD24⁺及CD44⁺/CD24^-细胞的分选和鉴定结果 因CD44⁺/CD24⁺细胞和CD44⁺/CD24^-细胞为目前报道较多的常见肿瘤肿瘤干细胞亚群^[16^，^18-19]，而A549细胞中这两类细胞群均占有一定程度的比例，因此实验分选出CD44⁺/CD24⁺细胞和CD44⁺/CD24^-两个亚群细胞进行分析。通过荧光抗体双标A549细胞后，细胞上流式细胞仪进行分选。分选出的细胞继续培养1周，两群细胞的增殖情况均良好，细胞在形态上和A549细胞群并无显著性差异。培养1周后，为了鉴别其表型的稳定性，实验再次对这两类细胞的CD44抗原和CD24抗原进行了荧光双标后上流式细胞仪确认，结果表明，分选出的CD44⁺/CD24⁺细胞群，培养1周后，其CD44和CD24双阳性的细胞比例维持在高水平98.72%(图2)；而CD44⁺/CD24^-细胞群在培养1周后，其CD44⁺/CD24^-的比例仍然维持在98.16%的高水平。实验结果表明，分选出的CD44⁺CD24⁺双阳性细胞和CD44⁺CD24^-的细胞群表型稳定，可以进行下一步的肿瘤干细胞特性比较分析。

2.3 CD44⁺/CD24⁺，CD44⁺/CD24^-和A549细胞的肿瘤成球能力比较 肿瘤干细胞悬浮成球实验是目前比较理想的鉴定肿瘤干细胞的方法，尽管有一些报道表明，对于肿瘤干细胞要形成悬浮肿瘤球，培养环境中不一定需要特定的生长因子^[26-28]。但是实验仍然采用了经典的添加碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子的方法对于CD44⁺/CD24⁺及CD44⁺/CD24^-两类细胞亚群的成球能力进行了考察。结果显示，CD44⁺/CD24⁺及CD44⁺/CD24^-以及A549细胞群中的少部分细胞能够形成肿瘤球，球的大小相似，体积无显著性差异(图3)。进一步考察统计它们形成肿瘤球的效率，结果显示，各细胞群的成球效率均在5%以下，CD44⁺/ CD24⁺及CD44⁺/CD24^-细胞亚群及A549细胞肿瘤球形成效率之间差异无显著性意义(图4)，提示分选出的CD44⁺/ CD24⁺及CD44⁺/CD24^-两类细胞群相对于A549细胞并没有包含数量更多的肿瘤干细胞。

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引言

非小细胞肺癌为目前世界上癌症致死的主要原因之一，其高患病率和高死亡率迫切需要找到更为有效的干预方法，因此对于肺癌肿瘤进展的发病机制还需要进行更深入的研究^[1^-^2]。肿瘤干细胞的发现也许会为肺癌的治疗带来更为有效的契机，肿瘤干细胞为肿瘤细胞内一个亚群，其来源目前认为是正常的干细胞转化而来，或者是特定的祖细胞或前体细胞通过一系列遗传变异的累积发展而来^[3]。肿瘤干细胞的主要特征类似一般的干细胞，表现为自我更新、多系分化、高端粒酶活性和ABC转运体的表达，同时，肿瘤干细胞一般对于凋亡和传统的放化疗方法存在一定程度的抵抗^[4-5]。多项研究提示，在肺癌的治疗中，传统的化疗或放疗能够清除大部分肿瘤细胞，但是难以清除肿瘤干细胞，因此剩余的肺癌肿瘤干细胞能再产生新的肿瘤细胞从而导致了肿瘤的复发^[6-8]。显然，对于肺癌肿瘤干细胞生物学特性的分析将会有助于从细胞分子层面进一步了解肺癌发生以及治疗后再复发的原因。

对于肺癌肿瘤干细胞生物学特性分析的一个前提是对于肺癌组织内肿瘤干细胞表型进行鉴定。但是目前因肺癌本身肿瘤组织的多样性以及不一致性^[8]，并没有确切的公认一致的表型去鉴定肿瘤干细胞。所以对于分离肺癌肿瘤干细胞目前仍然缺乏特征性的形态学证据以及细胞中表达的抗原谱系的证据。现在已经发现最常见的可以作为肿瘤肿瘤干细胞的特征性抗原包括CD133，CD44，CD24以及ABC运转蛋白家族G2(ATP-binding cassette superfamily G member 2，ABCG2)。CD133属于5次跨膜糖蛋白，是目前报道最多的肿瘤细胞株或者肿瘤组织中肿瘤干细胞的特征性抗原^[9-11]。因此，也有多项研究试图通过CD133去考察肺癌中的肿瘤干细胞^[12-13]，最近的一项研究结果发现CD133⁺的细胞具有致瘤性，这种特性依赖于一种与胚胎干细胞发育有关的转录因子Oct-4^[14]，似乎支持CD133⁺细胞具有肺癌肿瘤干细胞的特征，但CD133⁺细胞是否能够代表所有肺癌组织和肺癌细胞株中的肿瘤干细胞，目前还未有定论。CD44属于一种具有多种功能的跨膜糖蛋白，为另外一种常见的肿瘤干细胞抗原，其单独应用或者和其他干细胞表型比如CD24联合应用进行肿瘤干细胞的纯化^[15-17]。比如CD44⁺/CD24^-细胞群为乳腺癌和前列腺癌的肿瘤干细胞^[16^，^18]，而CD44⁺/CD24⁺为结肠癌的肿瘤干细胞^[19]。尽管目前的研究已经发现CD133和CD44是肺癌肿瘤干细胞最重要的抗原，但CD133和CD44对于肺癌肿瘤干细胞的评估和鉴定是否具有普遍性仍然未知，另外CD133和CD44双阳性的细胞是否更能准确反映肺癌中真正的肿瘤干细胞，目前仍然缺乏这类研究。更重要的是，既然CD44和CD24的结合分析可以确认乳腺癌、前列腺癌和结肠癌内的肿瘤干细胞，那么CD44联合CD24是否可以确认肺癌内的肿瘤干细胞，这是一个很值得探究的问题。

肿瘤内的肿瘤干细胞具有主动转移出某些外源或者内源性复合体的能力，其中介导分子之一为ABCG2。研究表明这类分子可以广泛表达在正常组织细胞中，并且高表达在一类叫做SP细胞的干细胞亚群中^[20]。最近一项研究发现，从多个肺癌细胞株中分离的SP细胞表现出强大的侵袭性，以及对于化疗药物的抵抗，因此SP细胞具有更强大的致瘤性^[21]。也有研究表明人类肺癌细胞株A549中存在肿瘤干细胞，包括SP细胞群^[21-22]。但是表达ABCG2的肺癌细胞是否就能够代表肺癌内的肿瘤干细胞，目前仍然缺乏足够的研究。

A549是目前最常用的人类肺癌细胞株，但是目前对于A549细胞中存在的肿瘤干细胞的抗原表型特征仍然缺乏较全面的考察。因此实验使用流式细胞术检测了A549中常见的肿瘤干细胞抗原的表达情况，包括CD133，CD24，CD44以及ABCG2。鉴于大部分上皮细胞来源的肿瘤中，CD44⁺/CD24^-以及CD44⁺/CD24⁺细胞亚群具有一定肿瘤干细胞的生物学特性，而肺癌中的该类细胞群的生物学特性仍然未知，因此实验从A549细胞中分离出这两类亚群，并且考察其肿瘤干细胞肿瘤球的形成潜能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学实验。

1.2 时间及地点 于2016年1至6月在西安交通大学医学院中心实验室完成。

1.3 材料 人类肺癌细胞株A549(第3代)购置于北京协和医学院基础医学研究所细胞中心。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养和传代 人类肺癌细胞系A549培养于高糖细胞培养基High Glucose Dulbecco’s modified Eagle’s Medium中(DMEM-HG，美国Gibco公司)，培养液中含体积分数10%胎牛血清(fetal calf serum，FCS；美国Invitrogen公司)、NaHCO₃(美国Sigma)、HEPES(美国Sigma公司)以及青链霉素(美国Invitrogen公司)。细胞在25 cm²培养瓶中(美国Corning公司)浓度达到80%融合时，去除培养液，PBS轻轻冲洗1遍后，加入体积分数0.25%胰蛋白酶(美国Sigma公司)消化后，加入FCS中和血清，转移入15 mL离心管(美国Corning公司)以800×g离心5 min，DMEM-HG培养液重悬后，接种于新的培养瓶中。

1.4.2 流式细胞免疫表型分析 体积分数0.25%胰酶消化细胞，使用40 g/L多聚甲醛4 ℃固定15 min，用含体积分数0.1%叠氮钠和0.5%牛血清白蛋白的PBS洗2遍后重悬细胞，加入小鼠抗人的一抗，包括CD133，CD44，CD24和ABCG2(美国Santa Cruz公司)在4 ℃孵育1 h，PBS洗2遍后重悬细胞，加入FITC或者PE标记的荧光二抗(美国Santa Cruz公司)孵育30 min，用PBS清洗2次后以PBS重悬细胞上FACS Calibur(美国BD公司)流式细胞仪进行检测分析，相同物种相同IgG亚类FITC或PE标记的抗体做阴性对照。各个表型分析实验重复3次，取均值确定最终结果。

1.4.3 流式细胞分选 10 cm培养板待细胞浓度融合到80%以上时，去除培养液，用PBS洗2遍之后加入体积分数0.25%胰酶消化细胞，3 min后加入含体积分数10%血清的培养液中和，充分吹打细胞为单细胞悬液。离心后用无菌PBS洗2遍后重悬，然后加入FITC和PE标记的CD44和CD24荧光抗体(美国BD公司)，相同物种相同IgG亚类FITC和PE标记的抗体做阴性对照。抗体和细胞在4 ℃孵育1 h，无菌PBS洗2遍后以冰PBS重悬细胞，尽快上流式细胞仪FACS AriaIII(美国BD公司)进行分选。分选时上机的细胞数总量为(5-10)×10⁶，分选后的细胞用无菌收集管收集后，离心力800×g，离心5 min后，以正常培养液重悬，继续放置到CO₂培养箱培养1周后进行流式细胞鉴定并行后续肿瘤干细胞悬浮成球分析。流式细胞术鉴定步骤同上，其中第一抗体为FITC和PE标记的CD44和CD24荧光抗体。

1.4.4 肿瘤干细胞悬浮成球实验 因为肿瘤干细胞的自我更新和分化潜能，这些细胞可以在非黏附以及无血清的条件下，在一定生长因子的刺激下形成肿瘤球^[23]。肿瘤细胞悬浮成球实验被认为是获取具有干性肿瘤细胞的实验之一。

为了评估3种细胞群(CD44⁺/CD24⁺，CD44⁺/CD24^-以及A549细胞群)的成球能力，各群细胞分离为单细胞后以5×10³的浓度接种在超低黏附6孔板内(美国Corning公司)，每类细胞群接种6个复孔。培养环境为HG-DMEM，质量浓度20 μg/L的表皮生长因子以及10 μg/L的碱性成纤维细胞生长因子(Gibco公司，美国)。培养7-10 d后，在倒置显微镜下计数细胞球直径为100-500 μm的细胞球，肿瘤球形成效率以形成的肿瘤球数目除以接种的细胞数目再乘以100%来确定^[24]。最终的肿瘤球形成效率以各个细胞群6个孔形成的平均值来确定。

1.5 主要观察指标 A549细胞表面CD133、CD44、CD24和ABCG2的表达水平；CD44⁺CD24⁺和CD44⁺CD24^-两类细胞群的比例；CD44⁺CD24⁺和CD44⁺CD24^-以及A549细胞形成肿瘤球的效率。免疫表型分析实验重复3次，最后结果以3次实验的均值确定。肿瘤球形成效率实验以每个细胞群的6个孔的克隆球形成比例均值确认最后结果。

1.6 统计学分析 实验数据以x(_)±s表示。采用SPSS 17.0软件进行数据分析，组间数据差异的比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

越来越多的证据显示，肿瘤的发生、复发和转移是和肿瘤干细胞相关联。肿瘤干细胞具有自己独特的生物学特性，包括自我更新、分化以及抗凋亡，对于化疗或者放疗治疗敏感度低。通过细胞表型分析，多种肿瘤已经成功分离出肿瘤干细胞，包括乳腺癌，前列腺癌及结肠癌^[16^，^18-19]。但是，目前从肺癌组织或者细胞系中鉴定的肿瘤干细胞表型并未统一，因此，实验考察了人类肺腺癌细胞株A549细胞最常用的肿瘤干细胞表型，包括CD133，CD44，CD24和ABCG2，并且着重分析了两类亚群细胞CD44⁺/CD24⁺以及CD44⁺/CD24^-的肿瘤球形成潜能。实验发现A549细胞中度表达CD44和CD24，因此实验分选出CD44⁺/CD24⁺以及CD44⁺/CD24^-两类细胞亚群，比较了这两类细胞之间以及和A549细胞本身的肿瘤干细胞肿瘤球形成的效率差异，结果发现CD44⁺/CD24⁺和CD44⁺/CD24^-两类亚群细胞在形成肿瘤球的效率上并无显著差异，而且这两类细胞与A549细胞在形成肿瘤球效率上也没有显著性差别。实验首次阐明了在其他肿瘤的肿瘤干细胞鉴定中起重要作用的CD44和CD24两种分子，对于A549细胞株的肿瘤干细胞的分离鉴定并不占据重要地位。

CD133是目前最常用的鉴别肿瘤干细胞的标志，虽然CD133广泛用于分离肺癌干细胞和肺癌组织中的肿瘤干细胞，但目前并没有关于肺癌细胞株中CD133表达水平的一致数据^[9^，^17]。实验显示A549中只有0.94%的细胞表达CD133，这个数据和其他一些研究结果存在略微的差别，比如有实验发现肺癌细胞株中CD133的表达率为1.4%-3.6%，而另外一些研究显示CD133的阳性率只有0.2%甚至没有表达^[9^，^17]。CD133表达水平的差异也许和不同研究组使用的细胞株不同有关，肿瘤细胞系随着不断的传代，或者培养环境的不同，都会造成肿瘤细胞生物学特性的变化，这些生物学特性的变化会影响CD133蛋白的转录水平以及选择性剪切或者转录后修饰等等。

鉴于实验结果并不支持CD44和CD24作为肺癌细胞株A549中鉴别肿瘤干细胞的重要分子，详细考察CD133阳性细胞群其肿瘤干细胞的相关生物学特性即显得尤为重要，但是因A549细胞株中CD133阳性细胞的比例太低，因此分离CD133阳性细胞在流式分选技术上存在相当的难度，实验以后的研究也许会考虑使用CD133的磁珠分选方法替代流式细胞分选，从而考察CD133阳性细胞的肿瘤干细胞生物学特性。实验还发现肿瘤干细胞另外一个标志ABCG2的表达比例约为0.98%，目前这是首次对于A549细胞中ABCG2的表达比例进行的评估。比例极低的这类ABCG2阳性细胞，是否和肿瘤干细胞的生物学性质更为接近，是未来的研究需要关注的问题。

实验最重要的结果是关于A549细胞中两种传统的肿瘤干细胞分子CD44和CD24。最近一些研究结果也表明CD44高表达的细胞亚群也许更接近于肺癌内的肿瘤干细胞，而CD44/CD24表型在多种癌症中可以作为肿瘤干细胞的标志，包括乳腺癌、前列腺癌和结肠癌^[16^，^18-19]。实验结果表明，CD44和CD24在A549中的平均表达水平为(64.23±3.5)%和(58.62±2.8)%，通过细胞分选实验发现CD44⁺/CD24⁺和CD44⁺/CD24^-两种细胞亚群中的某些细胞都能够在非黏附的无血清环境下，依靠碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子的刺激维持增殖，并形成同等数量的肿瘤球，证明两种细胞亚群均含有同等比例的肿瘤干细胞。虽然目前有研究发现CD44和CD24在肺癌肿瘤干细胞中扮演着重要角色，但实验却表明，CD44以及CD24也许并不适合标记A549中的肿瘤干细胞，因为分选出来的CD44⁺/CD24⁺和CD44⁺/CD24^-两个亚群细胞相对于A549细胞，并未表现出显著增强的肿瘤球形成能力。当然，最终验证肿瘤干细胞的方法还是在体的动物移植实验，因此，实验结果未来会继续在NOD-SCID免疫缺陷小鼠中进行致瘤性的验证。另外，实验并没有考察A549细胞中CD44和CD133双阳性的细胞比例，原因是A549细胞中CD133表达的比例太低。但尽管这样，对于肺癌内肿瘤干细胞的准确鉴定应该还是需要基于多个细胞表型的交叉分析才能获得。

显然，对于肺癌中肿瘤干细胞的鉴定，无论对于细胞系还是肿瘤组织都具有重要意义，只有这样才能确定肿瘤干细胞的表型并且探究清楚肿瘤干细胞在整个肿瘤的生长转移再发中所起的作用，以找到更加明确的抗肿瘤治疗靶点。虽然关于肺癌肿瘤干细胞的研究已经取得了较大的进展，但在表型分析上还需要进行更多的工作，未来的研究希望能够发现明确一致的肿瘤干细胞表型，或者针对特定组织类型的肺癌是否存在一类统一且一致的肿瘤干细胞表型，这样使实验不仅可以通过抗体技术达到提纯分离肺癌中肿瘤干细胞的目的，而且可以针对这类特定表型的肿瘤干细胞开发抗肿瘤更有效的药物。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

肺癌细胞株A549的常见肿瘤干细胞抗原分析和细胞分选比较

Phenotypic analysis of common cancer stem cell markers and cell sorting in lung cancer cell line A549

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