神经干细胞的培养鉴定及分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.17.014

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (17): 2708-2713.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.17.014

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

神经干细胞的培养鉴定及分化

朱琼¹，皋月娟²，高顺记¹，陈重¹，刘政¹，徐亚丽¹

¹解放军第三军医大学第二附属医院超声科，重庆市 400037；²解放军第三○二医院超声科，北京市 100039

修回日期:2017-01-10 出版日期:2017-06-18 发布日期:2017-06-29
通讯作者: 徐亚丽，博士，副主任医师，副教授，解放军第三军医大学第二附属医院超声科，重庆市 400037
作者简介:朱琼，女，1990年生，重庆市人，汉族，2009年第三军医大学毕业，在读硕士，主要从事神经干细胞治疗阿尔茨海默病的作用及机制研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81471795)；全军医学科技青年培育计划(16QNP102)

Cultivation, identification and differentiation of neural stem cells

Zhu Qiong¹, Hao Yue-juan², Gao Shun-ji¹, Chen Zhong¹, Liu Zheng¹, Xu Ya-li¹

¹Department of Ultrasound, Second Affiliate Hospital of Third Military Medical University, Chongqing 400037, China; ²Department of Ultrasound, the 302nd Hospital of PLA, Beijing 100039, China

Revised:2017-01-10 Online:2017-06-18 Published:2017-06-29
Contact: Xu Ya-li, M.D., Associate chief physician, Department of Ultrasound, Second Affiliate Hospital of Third Military Medical University, Chongqing 400037, China
About author:Zhu Qiong, Studying for master’s degree, Department of Ultrasound, Second Affiliate Hospital of Third Military Medical University, Chongqing 400037, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81471795; the Military Medical Incubation Plan for the Youth, No. 16QNP102

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
神经干细胞：是具有自我更新和多向分化潜能的原始细胞，主要存在于侧脑室下区和海马齿状回颗粒下层，不仅能分化为多种类型的神经细胞替代缺失神经组织，同时能产生多种细胞因子，如脑源性神经营养因子、神经生长因子及胶质源性神经营养因子等，并促进突触发生，调节其可塑性，且能重建部分环路和功能，是神经元替代治疗的理想靶细胞。
细胞分化：指同一来源的细胞逐渐由全能到多能，最后到单能，从而产生形态功能不同的细胞群的过程，其本质是基因组在时间和空间上的选择性表达。如神经干细胞能分化为多种类型神经细胞：星形胶质细胞、小胶质细胞及神经元。同时该过程受局部微环境调节，多种理化因素都能诱导全能细胞产生分化，如血清诱导神经干细胞分化。

摘要
背景：神经干细胞在神经损伤修复和退行性疾病中有广泛的应用前景，体外培养鉴定及促神经元诱导分化是后续研究的基础。
目的：采用悬浮神经球培养法分离培养神经干细胞并对其鉴定，了解生物学特性。
方法：采用悬浮神经球培养法从C57BL/6胎鼠大脑半球分离培养神经干细胞，观察形态特征及超微结构，CCK-8法绘制生长曲线，流式细胞仪检测细胞周期，免疫荧光法检测特异性标志蛋白Nestin的表达；用体积分数为1%和10%的血清诱导分化后，免疫荧光法检测GFAP、βⅢ-tubulin和MBP的表达。
结果与结论：①体外培养得到悬浮生长的神经球，生长曲线和细胞周期表明细胞增殖力强；②透射电镜观察到神经干细胞核浆比高，呈未分化状态；③Nestin免疫荧光阳性；④不同体积分数的血清诱导后均可分化为星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞，体积分数为1%血清能诱导分化得到更多的神经元细胞；⑤结果表明，采用悬浮神经球培养法成功分离培养得到了神经干细胞，低体积分数血清有利于神经干细胞向神经元分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0002-1810-5009(朱琼)

关键词: 干细胞, 分化, 神经干细胞, 培养, 鉴定, 血清, 诱导分化, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Neural stem cell transplantation is an emerging therapeutic option in the recovery of neural lesions and neurodegenerative diseases. Neural stem cell culture and differentiation lay a foundation for the further study.
OBJECTIVE: To improve the techniques for the isolation, cultivation, differentiation and identification of neural stem cells, and to explore the biological characteristics of cells.
METHODS: The neural stem cells from C57BL/6 fetal rats were isolated and cultured in vitro using neurophere culture method followed by morphological and ultrastucture examination. The growth curve and cell cycle of passage 3 cells were drawn and analyzed. Nestin expression was tested by immunofluorescence. Neural stem cells induced in 1% and 10% fetal bovine serum were identified using anti-GFAP, anti-βIII-tubulin and anti-MBP by immunofluorescence.
RESULTS AND CONCLUSION: The neurospheres exhibited strong cell proliferation ability. Under transmission electron microscope, there was a high nuclear/cytoplasmic ratio in the neural stem cells, indicating a low differentiation degree. Immunofluorescence analysis revealed that neural stem cells were positive for Nestin. The induced cells were positive for GFAP, βIII-tubulin, and MBP, indicating these cells were induced to differentiate into astrocytes, neurons and oligodendrocytes, and there were more neurons in 1% fetal bovine serum than those in 10% fetal bovine serum. In conclusion, we could successfully isolate neural stem cells in C57BL/6 mice, and low concentration of fetal bovine serum contributes to more neurons differentiated from neural stem cells.

Key words: Neural Stem Cells, Cells, Cultured, Serum, Cell Differentiation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

朱琼，皋月娟，高顺记，陈重，刘政，徐亚丽. 神经干细胞的培养鉴定及分化[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(17): 2708-2713.

Zhu Qiong, Hao Yue-juan, Gao Shun-ji, Chen Zhong, Liu Zheng, Xu Ya-li. Cultivation, identification and differentiation of neural stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(17): 2708-2713.

图/表（结果） 2

2.1 神经干细胞的形态 在解剖显微镜下剥离脑膜及血管，得到大脑半球。采用机械分离和酶消化法得到大量单细胞。原代培养第1天光镜下见部分细胞贴壁，部分细胞悬浮呈单细胞，折光性好，第2天悬浮细胞部分聚集呈细胞团，大小不均，较大者约有十几个细胞，克隆球直径逐渐增大，呈桑葚状，随着直径的增大，部分克隆球中心变暗。将克隆球消化传代后，克隆球大小更加均匀，形态更加规整，未见明显突起，折光性好(图2)。

2.2 神经干细胞的增殖能力 由细胞生长曲线(图3)可见，前2 d细胞生长缓慢，之后细胞增殖较快，进入对数生长期，从第6天开始，细胞增殖缓慢，进入平台期。细胞周期结果显示(图4)，53.23%的神经干细胞处于G₀+G₁期，G₂期占12.58%，S期占34.19%，G₂/G₁=1.99。根据增殖公式计算得增殖指数为87.86%，说明绝大部分细胞处于增殖状态。

2.3 神经干细胞的超微结构 透射电镜观察神经干细胞体积较小，胞核大且明显，核内染色质丰富，以常染色质为主，核仁较大，胞浆少，核浆比大，胞浆中含有大量的核糖体和线粒体，其余细胞器很少，表明该细胞分化程度低。大量的核糖体和线粒体表明细胞合成代谢能力旺盛，生命活动力强。细胞间可见细胞连接(图5)。

2.4 神经干细胞标志蛋白Nestin的表达 免疫荧光结果显示(图6)，无论是接种的克隆球，还是单个细胞，细胞核均较小，被DAPI染成蓝色，胞浆呈绿色，说明Nestin呈阳性表达。克隆球向外呈放射状，越靠近中心，细胞密度越大，细胞越紧密，不易被染色，故中心未见染色细胞。

2.5 神经干细胞的诱导分化 免疫荧光结果显示，大多数细胞GFAP反应阳性，胞浆丰富呈绿色，有多个短突起，贴壁牢固，说明大部分神经干细胞分化为星形胶质细胞(图7A)；少量细胞MBP反应阳性，呈绿色，说明少数神经干细胞分化为少突胶质细胞(图7B)；部分细胞βtubulin Ⅲ反应阳性，呈红色，突起较少但较长，说明部分神经干细胞分化为神经元(图7C，D)。其中，含体积分数为1%胎牛血清的培养基能诱导分化生成更多的神经元(图7D)，而含体积分数为10%胎牛血清的培养基能诱导分化生成更多的星形胶质细胞，说明低体积分数的血清有助于神经干细胞向神经元细胞分化，而高体积分数血清促使神经干细胞向胶质细胞分化。该分化结果进一步证实了分离培养得到的细胞为神经干细胞，且该细胞具有多向分化能力。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞观察性实验。

1.2 时间及地点 于2015年6至12月在第三军医大学第二附属医院中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 孕12-14 d C57BL/6小鼠，体质量25- 35 g，由第三军医大学实验动物中心提供，许可证号为SCXK(渝)2005-0007。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。

1.3.2 主要试剂和仪器 DMEM/F12、B27、Accutase、胎牛血清(Gibco公司)；表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子(Peprotech公司)；Anti-Nestin、Anti-Myelin Basic Protein(Millipore公司)；Anti-GFAP(Santa公司)；Anti-βⅢ-tubulin(Abcam公司)；二抗(中杉金桥)；流式细胞周期试剂盒(碧云天)。解剖显微镜、激光共聚焦显微镜(德国Leica公司)；透射电子显微镜(荷兰Philips公司)；酶标仪(澳大利亚Tecan公司)；流式细胞仪(美国Becton Dickison公司)；

1.4 实验方法

1.4.1 原代神经干细胞的分离、培养 取孕12-14 d的C57BL/6小鼠，解剖取出胚胎，断颈取头部，于解剖显微镜下依次剥离头皮、颅骨、脑膜和血管(图1)，分离得到两侧大脑半球。将得到的大脑半球用眼科剪剪碎成1 mm³的碎块，收集于离心管中，D-Hank’s液清洗2次。以上步骤均在冰上操作。然后加入0.25%的trypsin-EDTA和DNAase 100 μL于37 ℃下消化10 min，加入胎牛血清终止消化，并用吸管反复轻柔吹打20次得到混悬液。取混悬液，用70 μm的细胞滤器过滤，得到单细胞悬液，1 000 r/min离心2次，每次5 min，加入神经干细胞培养基(95%DMEM/F12，2%B27，20 μg/L表皮生长因子，20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子，1%双抗)重悬，以1×10⁹ L^-¹的细胞浓度接种于50 mL透气培养瓶中，体积分数为75%乙醇消毒瓶口后置于体积分数为5%CO₂，37 ℃的细胞培养箱中，次日首次换液，之后每2 d半量换液1次，培养期间观察细胞生长情况。离心时采用差速离心法，即将细胞悬浮液收集于离心管中，根据神经球的大小，选用不同的离心时间，神经球越大，离心时间越短，前2 d换液是采用1 000 r/min离心60 s，之后采用1 000 r/min离心30 s，使神经球沉淀，从而分离开单个悬浮细胞或死细胞。

1.4.2 神经干细胞的传代培养 每天观察神经干细胞生长情况，待克隆球较大，球心折光度变暗时，收集到离心管中，1 000 r/min离心30 s，去上清，然后加入Accutase于37 ℃下消化15 min，轻柔吹打20次，采用差速离心法，先进行1 000 r/min离心30 s，使消化不充分的神经球沉淀，再取上清进行1 000 r/min离心5 min，沉淀可根据情况再次消化。然后加入神经干细胞培养基重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹，接种于培养瓶中继续培养，隔日半量换液1次，5 d传代1次。

1.4.3 CCK-8法绘制神经干细胞的生长曲线 将第3代培养第4天的神经干细胞消化成单细胞悬液，按照2×10³/孔的密度，接种于用0.1 g/L多聚赖氨酸包被过的96孔板中，每孔100 μL，连续检测7 d，每天5个复孔，1个空白对照孔，于体积分数为5%CO₂、37 ℃的孵箱培养。分别于第1，2，3，4，5，6，7天，在各孔中加入10 μL CCK-8试剂，然后放回孵箱继续培养2 h，用酶标仪检测各孔的吸光度值，激发波长为450 nm。取5个复孔的平均吸光度值减去空白对照孔的吸光度值，得到对应时间点的吸光度值。以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制神经干细胞的生长曲线。

1.4.4 流式细胞仪检测神经干细胞的细胞周期 取第3代培养第4天的神经干细胞，消化成单细胞悬液，用PBS洗2次，加入体积分数为70%乙醇固定，4 ℃过夜，PBS洗涤2次，加入100 μL RNase消化，然后加入PI染料0.5 mL，于4 ℃条件下孵育30 min，流式细胞仪检测细胞周期，根据公式计算增殖指数(PI)=[(S+G₂/M)/(G₀/G₁+S+ G₂/M)]x100%。

1.4.5 透射电镜观察神经干细胞的超微结构 取第3代培养第4天的神经干细胞，PBS清洗2次后收集于1.5 mL EP管中，缓慢加入电镜级戊二醛固定细胞2 h，再用生理盐水冲洗3次，每次10 min，然后用1%锇酸后固定，乙醇和丙酮梯度脱水，送电镜室制片并于透射电镜下观察。

1.4.6 免疫荧光检测神经干细胞标志蛋白Nestin的表达 取第3代培养第4天的克隆球或消化后的单细胞以适当的密度接种于用0.1 g/L多聚赖氨酸包被过的共聚焦皿中，继续培养24 h；37 ℃预热的PBS轻轻漂洗细胞2次；40 g/L多聚甲醛室温下固定细胞10 min，PBS洗3次，每次5 min；0.5%TritonX-100处理细胞10 min，PBS洗3次，每次5 min；体积分数为10%山羊血清封闭15 min；弃封闭液，加入200 μL按1︰200稀释的anti-Nestin，4 ℃孵育过夜；弃一抗，PBS洗涤3次，每次5 min，用滤纸吸干多余的液体，加入200 μL按1︰200稀释的FITC-山羊抗小鼠IgG，37 ℃温育45 min，PBS洗涤3次，每次5 min，操作过程注意避光；DAPI染色3 min，PBS洗3次，每次5 min；封固后激光共聚焦显微镜观察。

1.4.7 神经干细胞的诱导分化及鉴定 将第3代培养第4天的神经干细胞消化成单细胞悬液，按2×10⁶ L^-¹的细胞浓度接种于多聚赖氨酸包被后的共聚焦培养皿中，分别用含体积分数为1%和10%胎牛血清的培养基培养7 d，然后进行GFAP、βⅢ-tubulin和MBP免疫荧光染色，抗体浓度均为1︰200稀释，操作步骤同上，于激光共聚焦显微镜下观察。

1.5 主要观察指标 神经干细胞的形态、生物学特征及分化能力。

讨论

原代取材培养神经干细胞，能较好的保持细胞本身的生物学特性。有研究表明，神经干细胞在胚胎第12天时开始出现，15 d时达到高峰^[16]，故实验用孕12-14 d的C57BL/6胎鼠，采用机械消化法和酶消化法分离得到神经干细胞，通过细胞的形态结构及标志性蛋白(Nestin^[17]、GFAP^[18]、βⅢ-tubulin^[19]、MBP^[20])检测，证实成功分离得到神经干细胞，为后续神经干细胞移植治疗奠定了良好的实验基础。由于神经干细胞呈悬浮生长，而胎鼠大脑半球的其他细胞呈贴壁生长，且表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子能够使培养的神经干细胞得到纯化^[21]，故实验中直接取大脑半球进行消化，通过后续的换液及表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的作用，筛选得到神经干细胞，该方法较单独分离海马区操作更简单。

神经干细胞的增殖、分化、迁移与所处的微环境密切相关，如细胞因子^[22-25]、理化因素等^[26-28]。有研究发现，无血清培养条件下，神经元比例较高，而血清体积分数越高，胶质细胞的数量越多^[29]。Hung等^[30]研究发现，神经球在无血清培养基中，主要分化为纤维型星形胶质细胞，而在含体积分数为10%胎牛血清的培养基中，主要分化为原浆型细胞。实验分别用体积分数为1%和10%的血清诱导分化，均得到星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞，但体积分数为1%的血清能诱导神经干细胞分化产生更多的神经元细胞，而体积分数为10%的血清诱导神经元细胞数量相对较少，说明血清体积分数与神经干细胞的分化方向有关，低体积分数血清有利于向神经元分化，与报道相符。既往研究主要集中在神经干细胞移植后如何有效分化为神经元，重建神经环路，以改善神经功能^[31-32]。随着对星形胶质细胞的深入认识，发现星形胶质细胞在神经轴突和突触可塑性方面发挥着重要作用^[33-35]。高体积分数血清能够促进神经干细胞向星形胶质细胞分化，低体积分数血清有利于神经干细胞向神经元分化，因此能否通过调整血清体积分数以控制分化方向及比例，为神经干细胞移植治疗提供了新的思路。但血清成分比较复杂，具体是哪一种物质或某几种物质共同改变了神经干细胞的分化方向，尚无定论。

实验采用多聚赖氨酸包被培养板，使神经干细胞贴壁生长，以利于后续实验操作。有研究表明，多聚赖氨酸会促进神经干细胞分化，尤其是多聚赖氨酸的分子质量对神经干细胞的分化影响较大^[36-37]。从Nestin免疫荧光结果可见，贴壁神经球周围细胞向四周爬行伸长，有“逃离”克隆球的趋势，单个细胞交织成网，出现这种现象的原因可能与多聚赖氨酸使神经干细胞贴壁生长导致分化有关。为避免多聚赖氨酸对神经干细胞分化产生影响，能否选用其他方式使神经干细胞贴壁，是后续实验中应该关注的问题。

实验还检测了神经干细胞的细胞周期、生长曲线和超微结构。从细胞周期和生长曲线来看，提取得到的神经干细胞生长旺盛，增殖能力强。从超微结构来看，细胞表现出幼稚细胞的特性，细胞间有细胞连接，为发育中的细胞间信息的传递提供了通道。

综上所述，实验建立了从C57BL/6孕鼠大脑半球分离培养神经干细胞的方法，并进行鉴定。但由于目前对神经干细胞分化的认识尚不全面，神经干细胞移植后能否维持干性，能否实现有效的定向分化，能否建立细胞间连接，改善神经系统症状等问题，仍是目前研究的热点和难点。

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