肾组织干细胞治疗急性肾衰竭的可行性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.01.020

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
肾小管上皮细胞：是兼有免疫调节作用且生物学功能十分活跃的细胞，是肾小管间质的主要细胞。当受到缺氧、中毒、细胞或炎性反应因子、血浆蛋白或葡萄糖等损伤因素作用后，肾小管上皮细胞活化、增生，小管扩张，管型形成，最终导致小管萎缩、凋亡和(或)纤维化。肾小管上皮细胞损伤不仅是引起急性肾衰竭的直接原因，而且由小管萎缩引起的肾间质纤维化还是导致终末期肾病的主要原因和共同病理过程。
上皮-间充质细胞转化：肾间质肌成纤维细胞主要来源为骨髓干细胞、肾小管上皮细胞转化和肾间质局部成纤维细胞活化。肾小管上皮细胞失去自身的细胞特性而获得肌成纤维的特性，称为上皮-间充质细胞转化。研究表明，上皮-间充质细胞转化在肾间质纤维化的发生和发展中起重要作用，而抑制或逆转上皮-间充质细胞转化的发生和发展，已成为控制肾间质纤维化的重要途径之一。

摘要
背景：研究表明，肾组织干细胞主要存在于肾乳头部位，其具有类似于间充质干细胞的特性，目前尚不能肯定其是否参与了肾小管上皮细胞损伤的修复。
目的：探讨肾组织干细胞治疗急性肾衰竭的效果及可行性。
方法：纳入40只SD大鼠，10只用于肾组织干细胞培养，其余30只随机分为3组，实验组和对照组制备急性肾衰竭动物模型，正常组不做任何处理。模型制备后6 h，实验组尾静脉注入肾组织干细胞，对照组注入相同剂量的生理盐水，正常组不做任何处理。移植后10 d检测肾功能，获取肾组织标本进行组织学观察。
结果与结论：①对照组的尿素氮、肌酐水平均显著高于正常组和实验组(P < 0.05)；实验组与正常组之间差异无显著性意义(P > 0.05)；②正常组皮质和外髓质小管未出现异常改变，无炎性浸润；对照组外髓质小管萎缩，炎症细胞浸润，上皮细胞肿胀；实验组有轻微炎症细胞浸润和细胞肿胀等病变，但较对照组明显较轻；③结果表明，肾组织干细胞移植能有效改善急性肾衰竭大鼠的肾功能，促进上皮细胞再生，达到良好的组织修复效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-1668-828X(胡跃世)

关键词: 干细胞, 移植, 肾组织干细胞, 肾小管, 肾小管损伤, 上皮细胞, 急性肾衰竭

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that renal tissue stem cells mainly exist in the renal papillae, holding similar characteristics to mesenchymal stem cells, yet it is unknown whether they are involved in the renal repair of tubular epithelial injury.
OBJECTIVE: To explore the effect and feasibility of renal tissue stem cells in the repair of acute renal failure.
METHODS: Renal tissue stem cells were isolated and culture from the renal tissue of 10 Sprague-Dawley rats. Another 30 Sprague-Dawley rats were randomly assigned into experimental group, model group or normal control group. An animal model of acute renal failure was made in the experimental and model groups. Six hours after modeling, experimental rats were respectively given tail vein injection of renal tissue stem cells in the experimental group, given the same volume of normal saline in the model group, and given no treatment in the normal control group. Ten days after transplantation, the renal function was detected, and renal tissue samples were taken and observed histologically.
RESULTS AND CONCLUSION: After transplantation, levels of urea nitrogen and creatinine were improved significantly in the experimental group (P < 0.05), which were similar to those in the normal control group (P > 0.05). No abnormal changes and no inflammatory infiltration in the cortex and outer medullary tubules were found in the normal control group, while in the experimental group, inflammatory cell infiltration and epithelial cell swelling were visible but milder than the model group. To conclude, our experimental findings show that the renal tissue stem cells get ideal effects on the renal function of acute renal failure rats by promoting epithelial cell regeneration.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Kidney Tubular Necrosis, Acute, Acute Kidney Injury, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

胡跃世，李鹏，曹志华，刘磊，王阳. 肾组织干细胞治疗急性肾衰竭的可行性[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(1): 110-114.

Hu Yue-shi, Li Peng, Cao Zhi-hua, Liu Lei, Wang Yang. Feasibility of renal tissue stem cell therapy for acute renal failure[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(1): 110-114.

图/表（结果） 1

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照组动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年10至12月在南阳市中心医院实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 纳入40只SD雄性大鼠，清洁级，体质量350 g左右，其中10只用于肾组织干细胞培养，其余30只用于动物体内实验，由北京市维通利华实验动物技术有限公司提供，SYXK(京)2013-0032，研究相关方案符合动物伦理学要求。

1.3.2 主要试剂与仪器 水合氯醛、DMEM培养液(上海乔源生物制药有限公司)；胶原酶(上海普迈生物科技有限公司)；胎牛血清(北京沃比森科技有限公司)；胰蛋白酶(北京美科美生物技术开发有限公司)；MTT(北京乔邦医药科技有限公司)；HgCl₂(上海嵘崴达实业有限公司)；多聚甲醛(北京索莱宝科技有限公司)；苏木精(上海复申生物科技有限公司)；伊红(上海研域生物科技有限公司)；切片机(温州顶历医疗器械有限公司)；CO₂培养箱()济南来宝医疗器械有限公司；流式细胞仪(北京恒泰丰科试验设备有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠肾组织干细胞分离培养与鉴定^[6-8] 取10只SD大鼠，腹腔注入10%水合氯醛(10 mL/kg)麻醉，分离双侧肾脏，纵向切开肾脏，获取肾乳突尖部组织，置入EP管中，PBS清洗、剪碎后加入胶原酶充分消化，离心，弃上清，接种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM 培养液中，置入37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱进行培养，3 d后第1次换液，之后每隔2 d或3 d换液1次，待细胞接近80%融合后，加入胰蛋白酶进行消化传代培养。

收集对数期第3代细胞，利用流式细胞仪检测间充质干细胞标记CD90、CD29、CD44阳性表达，而造血细胞标记CD45阴性表达。

选取第3代细胞采用MTT法检测肾组织干细胞的增殖活性，连测9 d，以时间为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制生长曲线。

1.4.2 急性肾衰竭动物模型制备及分组治疗 取剩余30只SD大鼠，随机分为3组，分别为实验组、对照组、正常组，每组10只。实验组和对照组腹腔注射6 mg/kg HgCl₂制备急性肾衰竭动物模型，正常组不做任何处理^[9-10]。模型制备后6 h，取5×10⁶个肾组织干细胞悬浮于1 mL无菌生理盐水中，经尾静脉注入实验组大鼠，对照组注射相同剂量的生理盐水，正常组不做任何处理。术后3组动物进行常规喂养。

1.4.3 术后肾功能检测^[11] 移植后10 d，3组动物腹腔注射10%水合氯醛麻醉，开腹收集1.5 mL下腔静脉全血，置于4 ℃环境下静置6-8 h，离心，收集血清，采用全自动生化分析仪检测血清肌酐、尿素氮水平。

1.4.4 组织学观察^[12-13] 肾功能检测后取双肾组织，用40 g/L多聚甲醛进行固定，梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋，切片机切片，片厚8 μm，常规进行苏木精-伊红染色，置于镜下观察。

1.5 主要观察指标 ①大鼠肾组织干细胞培养结果；②大鼠肾组织干细胞增殖情况；③各组大鼠肾功能以及肾组织病理形态。

1.6 统计学分析 使用SPSS 18.0软件进行统计学分析，组内比较予以配对t 检验，组间比较予以单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

肾脏是人体重要的脏器之一，承担着及时排出多余水分、代谢废物以及维持内环境稳定等重要任务。药物、急性感染、呕吐、腹泻、外伤、大手术等是引起急性肾损伤的常见因素，而20%的病例由药物引起。如果治疗不及时，一部分患者还可能转变为慢性肾脏病，甚至终末期肾衰竭，需要透析治疗^[14]。

肾脏中具有内分泌功能的细胞，分泌多种活性物质调节肾脏的血流和水、盐的代谢。肾脏的各种疾病都与肾脏细胞发生结构和功能改变密切相关，因此治疗各种肾病最根本的就是恢复肾脏功能细胞的数量和质量。肾小管上皮细胞是兼有免疫调节作用且生物学功能十分活跃的细胞，是肾小管间质的主要细胞。在肾组织损伤修复过程中，肾小管上皮细胞具有强大的再生能力^[15-19]，可以有效恢复肾脏功能。肾小管上皮细胞的来源主要分为3部分：第一部分是肾脏固有细胞，第二部分是循环中的骨髓间充质干细胞，第三部分是肾组织干细胞^[20-21]。以往，大量学者对骨髓间充质干细胞与肾损伤问题进行了研究^[22-25]。通过研究发现，骨髓间充质干细胞外周静脉注射治疗之后，很多细胞无法在损伤部位长期存活和分化，治疗效果不佳^[26]，且经静脉注射的骨髓间充质干细胞只有极少数可以到达肾脏损伤部位，其余大多数则滞留在肝脏和肺脏处，无法获得理想的肾损伤改善效果。目前普遍认为，肾小管上皮细胞的自我更新过程中，主要通过肾脏组织干细胞来发挥出修复作用^[27]。Oliver等^[27]学者通过研究指出，在肾乳头的干细胞壁龛中存在一定的肾组织干细胞，能够参与到缺血损伤肾小管上皮细胞修复过程，发挥出重要的作用。实验尝试从大鼠肾脏乳头组织中分离培养出肾组织干细胞，探讨其治疗急性肾损伤的效果及可行性。细胞移植后10 d，对照组的尿素氮、肌酐水平均显著高于正常组和实验组(P < 0.05)，实验组与正常组之间差异无显著性意义(P > 0.05)。上述结果表明，经肾组织干细胞治疗后，大鼠肾功能得到显著改善。经过组织学检测还发现，实验组存在轻微炎症细胞浸润和细胞肿胀等病变，但较之对照组明显较轻。肾组织干细胞对损伤组织的修复主要是通过两方面作用实现的，一是旁分泌作用^[28-30]，二是直接迁移到损伤部位并分化为受损伤细胞。以往杨光等^[31-33]报道，体外环境下对肾组织干细胞进行诱导，可分化为肾小管上皮细胞。肾组织干细胞还可以通过减少肾小管氧化应激水平达到降低细胞氧化损伤的效果^[34]。

综上所述，利用肾组织干细胞治疗能有效改善急性肾衰竭大鼠肾功能，促进上皮细胞再生，达到良好的组织修复效果。