MnFe2O4纳米胶束合成及其应用于磁共振分子影像的可行性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.47.014

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (47): 7090-7096.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.47.014

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MnFe₂O₄纳米胶束合成及其应用于磁共振分子影像的可行性

杨华¹，龚明福²，邹利光²，张松²，舒通胜²，周培华¹

¹重庆市中医院放射科，重庆市 400021；²解放军第三军医大学新桥医院放射科，重庆市 400037

收稿日期:2016-08-21 出版日期:2016-11-18 发布日期:2016-11-18
通讯作者: 周培华，主任医师，重庆市中医院放射科，重庆市 400021
作者简介:杨华，男，1978年生，重庆市人，博士，副主任医师，主要从事磁共振分子影像研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81071197，81501521)；重庆市前沿与应用基础研究一般项目(cstc2015jcyjA1338)

Synthesis of MnFe₂O₄ nanomicelles and its application in magnetic resonance molecular imaging

Yang Hua¹, Gong Ming-fu², Zou Li-guang², Zhang Song², Shu Tong-sheng², Zhou Pei-hua¹

¹Department of Radiology, Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital, Chongqing 400021, China; ²Department of Radiology, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University of PLA, Chongqing 400037, China

Received:2016-08-21 Online:2016-11-18 Published:2016-11-18
Contact: Zhou Pei-hua, Chief physician, Department of Radiology, Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital, Chongqing 400021, China
About author:Yang Hua, M.D., Associate chief physician, Department of Radiology, Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital, Chongqing 400021, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81071197, 81501521; Frontier and Applied Basic Research Projects in Chongqing, No. cstc2015jcyjA1338

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
MnFe₂O₄纳米胶束：铁酸盐(MnFe₂O₄)纳米粒在结构上为金属粒子(M ²+)和铁粒子(Fe ³⁺)构成的内部支架，氧原子形成外围包被。通过分子工程改变M ²⁺可获得不同弛豫活性的MFe₂O₄纳米微粒，其中MnFe₂O₄由于具有易于反磁化的特性，相对其他铁酸盐纳米粒具有更高的饱和磁化强度，被广泛应用在包括药物释放、生物传感及磁共振分子成像等生物医学领域。同时，锰/铁纳米粒中Mn ²⁺具有顺磁性，可明显缩短T1时间，因而可将锰/铁纳米粒用于磁共振双对比成像。
高温热解法合成铁氧化物纳米粒：第一步，金属盐与配体(如油胺、油酸等)结合形成能溶于非极性溶剂金属配合物；第二步，金属配合物在还原剂存在的条件下逐级升温、分解、还原形成纳米粒的核心，这个步骤决定纳米粒的分散性；第三步，金属离子在纳米粒核心的表面吸附最终形成纳米粒，这个过程决定纳米粒的粒径。

背景：研究已证明，多个纳米粒簇样聚集或增大纳米粒的粒径可增加纳米粒的饱和磁化强度，但粒径的增大会降低纳米粒在体内的有效循环时间。
目的：合成MnFe2O4纳米胶束，检测其应用于磁共振分子影像的可行性。
方法：采用高温热解法合成MnFe₂O₄纳米粒，以聚乙二醇-聚已内酯两亲嵌段聚合物自组装包裹MnFe₂O₄4纳米粒，形成聚乙二醇-聚已内酯-MnFe₂O₄纳米胶束。对MnFe₂O₄纳米粒及聚乙二醇-聚已内酯-MnFe₂O₄纳米胶束的粒径、形态、包被物、铁/锰构成比、分散性等参数进行表征。将不同铁浓度(0，0.01，0.02，0.03，0.04，0.06，0.08，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mmol/L)的聚乙二醇-聚已内酯-MnFe2O4纳米胶束或聚乙二醇-聚已内酯-Fe₃O₄溶液放于EP管中，利用磁共振测量弛豫率。
结果与结论：①MnFe₂O₄纳米粒呈单分散性，粒径约11 nm，Zeta粒径为(11.18±1.72) nm，铁/锰摩尔构成比为2.13∶1；聚乙二醇-聚已内酯-MnFe₂O₄纳米胶束由十几个到数十个纳米粒聚集呈团状或簇状，粒径为52-86 nm，zeta粒径为(78.8±12.4) nm；②聚乙二醇-聚已内酯-MnFe2O4纳米胶束或聚乙二醇-聚已内酯-Fe₃O₄的信号变化趋势相似，随着铁浓度的增加，T1WI信号强度先升高后降低；T2WI信号强度逐渐降低，且在T2*WI信号强度降低更明显；③结果表明，聚乙二醇-聚已内酯-MnFe₂O₄纳米胶束粒径适中，单分散性好，T₂弛豫效能强，有望作为敏感的T2WI对比剂应用于磁共振分子影像。

ORCID: 0000-0002-0666-9501(周培华)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 纳米材料, 纳米胶束, MnFe₂O₄, 磁共振成像, 分子影像, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that the saturation magnetization of nanoparticles can be increased by increasing of particle size of nanoparticles or cluster-like aggregation of multiple nanoparticles. But the increased particle size can reduce the cycle time of nanoparticles in the body.
OBJECTIVE: To synthesize MnFe₂O₄ nanomicelles and explore the feasibility of its application in magnetic resonance molecular imaging.
METHODS: MnFe₂O₄ nanoparticles were synthesized using thermal decomposition method and self-assembled with polyethylene glycol-polycaprolactone amphiphilic diblock copolymers (PEG-PCL) to construct PEG-PCL-MnFe₂O₄ nanomicelles. The characteristics of the MnFe₂O₄ nanoparticles and nanomicelles were tested. Then, MnFe₂O₄ nanoparticles and nanomicelles at different iron concentrations (0, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.06, 0.08, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 mmol/L) were placed into EP tubes. Relaxation rate of the nanomicelles were measured using magnetic resonance scanner.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) MnFe₂O₄ nanoparticles appeared as round under transmission electron microscopy. The size of nanoparticles was 11 nm with good monodispersion. The Zeta-particle size was (11.18±1.72) nm. The molar ratio of Fe/Mn was 2.13:1. The size of PEG-PCL-MnFe₂O₄ nanomicelles ranged from 52 to 86 nm, with a mean Zeta-particle size of (78.8±12.4) nm. (2) The signal intensity (SI) change of PEG-PCL-MnFe₂O₄ nanomicelles and PEG-PCL-Fe₃O₄nanomicelles shared similar trend according to iron concentration. With the increasing of iron concentration, SI first increased and then decreased in T1WI, and it gradually decreased in T2WI and T2*WI. The SI changes in T2*WI were significantly stronger than that in T2WI and T1WI. Taken together, our results show that PEG-PCL-MnFe₂O₄ nanomicelles are expected to perform as a sensitive contrast agent used in T2WI as their moderate particle size, good monodisperse and strong T₂ relaxation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Nanostructures, Magnetic Resonance Imaging, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

杨华，龚明福，邹利光，张松，舒通胜，周培华. MnFe₂O₄纳米胶束合成及其应用于磁共振分子影像的可行性[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(47): 7090-7096.

Yang Hua, Gong Ming-fu, Zou Li-guang, Zhang Song, Shu Tong-sheng, Zhou Pei-hua. Synthesis of MnFe₂O₄ nanomicelles and its application in magnetic resonance molecular imaging[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(47): 7090-7096.

图/表（结果） 4

2.1 MnFe₂O₄纳米粒的表征结果透射电镜下，纳米粒呈大小较均匀的圆形，粒径为11 nm左右，Zeta粒径为(11.18±1.72) nm，单分散性好，见图1。

电感耦合等离子体原子发射光谱仪检测示Mn质量浓度为166.9 mg/L，Fe质量浓度为363.5 mg/L，两者的摩尔浓度比为1∶2.13。

2.2 PEG-PCL-MnFe₂O₄纳米胶束的表征结果透射电镜下，纳米粒呈团状及簇状分布，胶束由十几个到几十个纳米粒聚集而成，粒径52-86 nm，Zeta粒径(78.8±12.4) nm，与MnFe₂O₄纳米粒比较粒径明显增大，且粒径分布增宽，见图2。

红外光谱检测显示(图3)，油相MnFe₂O₄纳米粒在 2 800 cm^-1和2 900 cm^-1处(细黑箭)可见明显的峰，这是由于十六烷二醇内的亚甲基(-CH₂)的对称及非对称振动引起的吸收峰^[27]。当连接PEG后，在1 710 cm^-1处(粗黑箭)可见一明显的吸收峰，这是PEG内羰基的吸收峰，说明含有羰基的PEG-PCL两嵌段聚合物包被纳米胶束。而在650-1 500 cm^-1出现的细小振动峰则与MnFe₂O₄存在有关。

2.3 PEG-PCL-MnFe₂O₄纳米胶束的磁共振成像结果 PEG-PCL-MnFe₂O₄和PEG-PCL-Fe₃O₄两种纳米胶束溶液的磁共振信号改变，见图4所示。两种纳米胶束的信号变化趋势相似：①当铁浓度低于0.4 mmol/L时，T1WI信号强度逐渐升高；当铁浓度高于0.4 mmol/L后，T1WI信号强度开始降低；②T2WI信号强度随着铁浓度的增加逐渐下降，以T2*WI信号强度改变更明显(P < 0.05)。T₂ mapping显示：随着铁浓度的增加T₂值逐渐降低，且PEG-PCL-MnFe₂O₄的T₂值降低较PEG-PCL- Fe₃O₄更明显，在浓度相同的条件下，与PEG-PCL- Fe₃O₄比较，PEG-PCL-MnFe₂O₄ T₂值更低，R₂值更高，r₂斜率更大，弛豫效能更强。

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引言

分子影像是指应用影像学方法对活体器官、组织内细胞和分子水平生物学过程进行成像和分析的一门学科^[1]。自Weissleder^[2]于1999年首次提出分子影像概念以来，分子影像取得了长足的发展。2002年，第一届国际分子影像会议召开，更是让分子影像在学术界得到了广泛关注。美国医学会已将分子影像学定义为未来十个最具发展潜力的前沿医学领域之一。分子成像包括荧光显像、磁共振显像及核素显像等，根据不同的成像方法需要不同的分子影像探针^[3]，其中，基于纳米粒的分子探针是目前研究最多的探针之一。首先，纳米探针的物理特性呈粒径依赖性，使其能够满足体内外不同领域、不同层次的需要^[4-5]；第二，相对于细小的分子影像介质，网状内皮系统吞噬进入血流的纳米粒，表现出特有的大小和表面依赖性，这为不同被动靶模式用于不同疾病诊断提供了可能^[6]；第三，包裹在纳米粒表面的包被材料能够为生物分子提供多个结合位点，为主动靶向提供分子基础^[7]。

由于具有化学和磁化稳定性，铁酸盐(MFe₂O₄)纳米粒尤其是Fe₃O₄在过去受到广泛关注。这类纳米粒在结构上为金属粒子(M²⁺)和铁粒子(Fe³⁺)构成的内部支架，氧原子形成外围包被。通过分子工程改变M²⁺可获得不同弛豫活性的MFe₂O₄纳米微粒，其中锰/铁纳米粒(MnFe₂O₄)由于具有易于反磁化的特性，相对其他铁酸盐纳米粒具有更高的饱和磁化强度^[8]，被广泛应用在包括药物释放、生物传感及磁共振分子成像等生物医学领域^[9-12]。同时，锰/铁纳米粒中Mn²⁺具有顺磁性，可明显缩短T₁时间，因而可将锰/铁纳米粒用于磁共振双对比成像^[13-15]。近年来，进一步研究发现，锰/铁纳米粒能在体内代谢缓慢释放Mn²⁺，有望在不增加潜在毒性的情况下作为Mn²⁺的缓释剂应用于锰增磁共振成像^[16-18]。

纳米粒合成的方法很多，包括溶胶-凝胶法、微乳法、共沉淀、水热合成及高温热解等^[19-21]。其中，通过有机相高温热解法合成MFe₂O₄纳米粒操作简单，所合成纳米粒单分散性好且其大小可通过改变温度及金属前体的浓度来控制，是目前研究最多的方法^[22]。已证明，多个纳米粒簇样聚集或增大纳米粒的粒径可增加纳米粒的饱和磁化强度，但粒径增大会降低纳米粒在体内的有效循环时间^[23]。聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)修饰的纳米粒在水溶液中分散、稳定，能延长纳米粒在体内的循环时间^[24-25]。因而，实验拟通过高温热解法合成单分散的MnFe₂O₄纳米粒，采用PEG和聚已内酯(polycaprolactone，PCL)两亲性嵌段聚合物作为包被材料，通过自组装的方式形成PEG-PCL-MnFe₂O₄纳米胶束，并对其理化性质进行表征，了解其应用于磁共振分子影像的可行性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计对比观察实验。

1.2 时间及地点实验于2011年8月至2013年5月在解放军第三军医大学新桥医院完成。

1.3 材料

MnFe₂O₄纳米胶束合成实验的主要试剂与仪器：乙酰丙酮铁、乙酰丙酮锰、1，2-十六烷二醇、二苄醚、油酸、油胺、正己烷、ε-已内酯、聚乙二醇单甲醚(美国Aldrich公司)；透射电子显微镜(Hitachi-7500，日本日立)；Zeta-粒度仪(英国Malvern公司)；傅里叶红外分光光度计(美国Perkinelmer公司)；电感耦合等离子体原子发射光谱仪(德国斯派克公司)；磁共振成像仪(美国GE公司)。

1.4 实验方法

纳米粒的合成及表征：分别取乙酰丙酮铁(2 mmol)、乙酰丙酮锰(1 mmol)、油胺(6 mmol)和油酸(6 mmol)、 1，2-十六烷二醇(10 mmol)溶于二苄醚中，在N₂环境中下搅拌，溶液缓慢升温至200 ℃并恒温2 h，再缓慢加温到300 ℃，并回流1 h后自然冷却，无水乙醇离心数次，取沉淀，用无水正己烷分散待用。透射电子显微镜观察、测量纳米粒的形态、粒径，Zeta-粒度分析仪测量纳米粒的粒径及其单分散性，采用电感耦合等离子体原子发射光谱仪测量纳米粒中铁、锰的含量。

PEG-PCL-MnFe₂O₄纳米胶束的合成及表征：PEG-PCL两亲性嵌段聚合物及PEG-PCL-MnFe₂O₄纳米胶束的合成委托四川大学生物医学材料研究中心完成^[26]。大致步骤如下：首先以ε-已内酯和马来酰亚胺功能化聚乙二醇开环聚合，调节马来酰亚胺功能化聚乙二醇和ε-已内酯的比例，得到不同分子质量的PCL和马来酰亚胺功能化聚乙二醇嵌段的共聚物mPEG_2K-PCL_2K和Mal-PEG_3.5K- PCL_2K。再以mPEG_2K-PCL_2K和Mal-PEG_3.5K-PCL_2K的混合物作为载体，采用自组装聚合的方式将疏水的MnFe₂O₄纳米粒子聚集，形成包裹多个MnFe₂O₄纳米粒的、水相稳定的PEG-PCL-MnFe₂O₄纳米胶束。利用透射电镜、Zeta-粒度仪表征胶束的形态、粒径及粒径分布，红外光谱检测纳米粒及纳米胶束的表面官能基团。以相同的方法制备PEG-PCL-Fe₃O₄纳米胶束作为对照。

PEG-PCL-MnFe₂O₄纳米胶束的磁共振成像：将PEG-PCL-MnFe₂O₄纳米胶束溶解于PBS中，按铁摩尔浓度梯度稀释为0，0.01，0.02，0.03，0.04，0.06，0.08，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mmol/L 12个浓度的纳米胶束溶液，将溶液装于EP管中，于3.0 T磁共振扫描仪上进行轴位多层成像。扫描序列及参数为：自旋回波T1WI(TR=400 ms，TE=7.5 ms)，快速自旋回波T2WI(TR=3 800 ms，TE=85 ms)、梯度回波T2*WI (TR=270 ms，TE=6.9 ms，翻转角20°)及16回波T2 mapping (TR=2 400 ms，TE=13.7-109.7 ms)扫描。在中心层面进行信号强度(signal intensity，SI)测量，感兴趣区大小为15 mm²，并计算△SI，△SI=( SI_Nano–SI_PBS)/SI_PBS×100%，其中SI_PBS和SI_Nano分别代表PBS和纳米胶束溶液的信号强度，绘制时间-△SI(TIC)曲线。采用GE公司ADW 4.4工作站自带的T2软件在T₂ mapping图像测量纳米胶束溶液的T₂值，将T₂值取倒数进行线性回归即得到弛豫效能r₂。以PEG-PCL-Fe₃O₄纳米胶束作为对照。

1.5 主要观察指标 MnFe₂O₄纳米粒及PEG-PCL- MnFe₃O₄纳米胶束的粒径、形态、包被物、铁/锰构成比、分散性；PEG-PCL-MnFe₃O₄纳米胶束或PEG-PCL- Fe₃O₄溶液的弛豫效能。

1.6 统计学分析所有数据采用SPSS 13.0软件包分析，计量资料以x(_)±s表示，对不同序列之间的信号强度采用配对资料的wilcoxon符号秩和检验，P < 0.05为有差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

高温热解法合成铁氧化物纳米粒大致分为3个步骤^[28]：第1步，金属盐与配体(如油胺、油酸等)结合形成能溶于非极性溶剂金属配合物；第二步，金属配合物在还原剂存在的条件下逐级升温、分解、还原形成纳米粒的核心，这个步骤决定纳米粒的分散性；第三步，金属离子在纳米粒核心的表面吸附最终形成纳米粒，这个过程决定纳米粒的粒径。在纳米粒的合成过程中，在降温还原形成最终纳米粒之前，逐级升温的过程非常关键，它可以将纳米粒的核心的形成及晶核的生长2个过程划分开，保证纳米粒的单分散性。作者的经验是：在升温至200 ℃时维持2 h，可在保证纳米粒核心的同时形成更大保障纳米粒的单分散性。如果直接升温至 300 ℃，则会因为纳米粒核心没有完全形成而出现纳米粒的粒径分布的不一致。

磁性纳米粒活体应用之前需进行表面修饰，表面修饰后纳米粒需满足以下要素^[29-30]：首先，修饰后的纳米粒应具备极好水溶性；其二，修饰后的纳米粒应当具有较高的饱和磁化强度；第三，所采用包被材料应具有很好的生物相容性；第四，纳米粒能够逃避血浆蛋白和网状内皮系统的吸附和吞噬，延长血浆半衰期。多聚物包被的纳米粒不仅具有良好的水溶性，还能为纳米粒提供电荷斥力和空间位阻力，增大纳米粒在的胶体稳定性，并且多聚物的游离基团还可为纳米粒提供大量的基团，便于进一步连接生物分子。因而，多聚物是目前研究最多的修饰材料^[31-32]。PCL和PEG是目前生物医学领域较为常用的亲脂性和亲水性多聚物，具有很好的生物降解性和相容性，由两者聚合而成的两亲性嵌段聚合物PEG-PCL作为缓释材料在药物缓释领域广泛应用。近来，研究人员成功将PEG-PCL作为包被材料包裹纳米粒，形成包含一定数量纳米粒的纳米胶束，不仅明显增加了纳米粒的弛豫率，还有效延长了其在体内的循环时间^[33-34]。

在实验中成功合成了MnFe₂O₄和Fe₃O₄纳米胶束，磁共振成像显示两者具有相似的T₁、T₂效应，并且在相同铁浓度下，MnFe₂O₄纳米胶束较Fe₃O₄纳米胶束具有更强的T₂效能，这主要是由于MnFe₂O₄为混合型尖晶石结构，具有较小的磁晶各向异性及比较容易反磁化特性引起的^[35-36]。Lee等^[8]在相同的条件下检测了MnFe₂O₄、Fe₃O₄、亚铁酸钴(CoFe₂O₄)和亚铁酸镍(NiFe₂O₄)的饱和磁化强度。结果显示：在单位原子质量下的四者的饱和磁化强度值分别为110 emu/PMA、101 emu/PMA、99 emu/PMA和85 emu/PMA。MnFe₂O₄磁化强度值明显高于其他铁酸盐。Huh等^[37]分别采用结合了肿瘤表皮生长因子受体2的MnFe₂O₄和Fe₃O₄纳米粒对HER2表达水平不同的细胞系进行标记，标记细胞的磁共振成像显示：采用MnFe₂O₄时，即使在表达肿瘤表皮生长因子受体2水平很低的Bx-PC-3细胞系就能观察到信号改变，而采用Fe₃O₄时，只是在肿瘤表皮生长因子受体2的表达水平高出上千倍的NIH3T6.7细胞系才观察到信号变化。

综上所述，通过PEG-PCL两嵌段聚合物自组装构建PEG-PCL-MnFe₂O₄纳米粒粒径适中、单分散性好，在相同条件下较PEG-PCL-Fe₃O₄弛豫性能高，是较敏感的T2WI对比剂，可作为一种高度磁敏感的纳米微粒用于磁共振分子影像领域。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

MnFe₂O₄纳米胶束合成及其应用于磁共振分子影像的可行性

Synthesis of MnFe₂O₄ nanomicelles and its application in magnetic resonance molecular imaging

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