左旋聚乳酸羟基磷灰石材料上人牙周膜细胞的生长

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.34.011

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
牙周膜细胞：牙周组织中的牙周膜也称牙周韧带，是致密的结缔组织，位于牙根和牙槽骨之间，由细胞、基质和纤维构成。牙周膜细胞是十分重要的细胞之一，具有一定的分化潜能，且生物学性能稳定，因此被广泛大的应用于牙周组织工程之中，成为一种重要的种子细胞。
左旋聚乳酸：聚乳酸是一种应用十分广泛的支架材料，具有良好的组织相容性好。在进入体内之后，可以随着时间的推移逐渐发生降解，分解为乳酸，并经过人体的代谢排出体外。聚乳酸由乳酸单体聚合而成，其中左旋聚乳酸是一种重要的类型，属于半结晶体，具备一定的机械强度。

背景：在体外构建组织工程化牙周组织过程中，种子细胞与支架材料的有效结合是提高组织工程化牙周组织质量的关键。其中人牙周膜细胞是常用的种子细胞。
目的：观察左旋聚乳酸羟基磷灰石材料上人牙周膜细胞生长情况。
方法：体外环境下分离与培养人牙周膜细胞，取第3代细胞，分为2组，设为对照组和实验组，分别予以单纯人牙周膜细胞培养与人牙周膜细胞+左旋聚乳酸羟基磷灰石材料复合培养。培养1，2，3 d，检测2组的碱性磷酸酶活性与Ⅲ型胶原表达情况；利用MTT法描绘细胞生长曲线。
结果与结论：①经免疫组化染色，培养所得细胞波形蛋白、碱性磷酸酶染色均呈阳性表达，抗角蛋白染色呈阴性，表明所得细胞为实验所需人牙周膜细胞；②经MTT法检测，不同时间点2组细胞毒性的吸光度(A)值经比较差异均无显著性意义(P > 0.05)；2组人牙周膜细胞的生长曲线形态基本一致；③共培养1，2，3 d，2组碱性磷酸酶活性经比较差异均无显著性意义(P > 0.05)；④2组Ⅲ型胶原A值经比较差异均无显著性意义(P > 0.05)；⑤结果提示，人牙周膜细胞可以在左旋聚乳酸羟基磷灰石材料上正常生长与增殖，未出现细胞毒性等不良反应。

ORCID: 0000-0001-6584-4958(高永志)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 口腔生物材料, 牙周膜细胞, 左旋聚乳酸, 羟基磷灰石, 细胞生长, 细胞毒性

Abstract:

BACKGROUND: In constructing tissue-engineered periodontium in vitto, the effective combination of seed cells with scaffold materials is the key to promote the quality of tissue-engineered periodontium, in which human periodontal ligament cells are commonly used.
OBJECTIVE: To explore the growth of human periodontal ligament cells on the poly-L-lactic acid hydroxyapatite.
METHODS: Human periodontal ligament cells were isolated and cultured in vitro, and passage 3 cells were chosen to be randomly divided into two groups: cells cultured alone as control group, and cultured with poly-L-lactic acid hydroxyapatite as experimental group. After 1, 2 and 3 days, alkaline phosphatase activity and expression of type III collagen in the two groups were detected, and the cell growth curve was depicted using MTT method.
RESULTS AND CONCLUSION: By immunohistochemical staining, cultured cells were positive for vimentin and alkaline phosphatase staining and negative for anti-keratin staining, indicating that the cells were identified as human periodontal ligament cells. By MTT method, there was no significant difference in the absorbance value of two groups at different time points (P > 0.05). And after 1, 2 and 3-day co-culture, the alkaline phosphatase activity levels showed no significant difference between two groups (P > 0.05). Besides, no significant difference in the absorbance value of type III collagen was found in the two groups (P > 0.05). To conclude, the human periodontal ligament cells can grow and proliferate well on the poly-L-lactic acid hydroxyapatite scaffold with no cytotoxicity.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Periodontal Ligament, Hydroxyapatites, Biocompatible Materials, Cytotoxicity, Immunologic, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

高永志，殷志远. 左旋聚乳酸羟基磷灰石材料上人牙周膜细胞的生长[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(34): 5082-5088.

Gao Yong-zhi, Yin Zhi-yuan. Growth of human periodontal ligament cells on the poly-L-lactic acid hydroxyapatite[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(34): 5082-5088.

图/表（结果） 9

参考文献

[1] 王琳,冯海兰,梅芳,等.人牙周膜细胞在左旋聚乳酸/羟基磷灰石生物材料上的生长观察[J].解剖学报, 2008,39(4): 573-577.
[2] 王琳,邓旭亮,梅芳,等.电纺左旋聚乳酸和左旋聚乳酸羟基磷灰石纳米纤维细胞相容性的比较研究[J].口腔颌面修复学杂志,2007,8(2):83-86.
[3] 鲁红,吴织芬,田宇,等.应用细胞-支架构建方式的组织工程方法促进牙周组织再生的实验研究[J].牙体牙髓牙周病学杂志,2005,15(1):14-18.
[4] 鲁红,吴织芬,田宇,等.狗牙周膜细胞三维立体培养的体外实验研究[J].实用口腔医学杂志,2003,19(4):304-307.
[5] 闫福华,郑碧琼,林敏魁,等.组织工程用于修复慢性牙周组织缺损的动物实验研究[J].口腔医学研究, 2005,21(6): 593-597.
[6] 王烟岚,王萧萧,陈天宇,等.牙周膜干细胞与牙周膜细胞甲状旁腺激素受体表达的比较[J].中国组织工程研究, 2015, 19(10):1562-1569.
[7] 唐倩,孙文娟,黄南楠,等.新型壳聚糖-胶原支架与牙周膜细胞的生物相容性[J].中国组织工程研究, 2013,17(38): 6766-6772.
[8] Wu C, Zhou Y, Lin C, et al. Strontium-containing mesoporous bioactive glass scaffolds with improved osteogenic/cementogenic differentiation of periodontal ligament cells for periodontal tissue engineering.Acta Biomaterialia. 2012;8(10):3805-3815.
[9] 王方,谢诚,吴国锋,等.组织工程牙周膜细胞片的体内实验研究[J].实用口腔医学杂志,2011,27(2):177-180.
[10] 鲁红,吴织芬,田宇,等.异体脱矿松质骨基质和纳米羟基磷灰石材料应用于牙周组织工程中的可行性探讨[J].中国临床康复,2002,6(17):2538-2539.
[11] Zheng L, Huang Y, Song W, et al. Fluid shear stress regulates metalloproteinase-1 and 2 in human periodontal ligament cells: Involvement of extracellular signal-regulated kinase (ERK) and P38 signaling pathways. J Biomech. 2012;45(14):2368-2375.
[12] Moshaverinia A, Xu X, Chen C, et al. Application of stem cells derived from the periodontal ligament orgingival tissue sources for tendon tissue regeneration.Biomaterials. 2014;35(9):2642-2650.
[13] 崔菊萍,王新,邹建明,等.丝蛋白应用于牙周组织工程的可行性[J].中国组织工程研究与临床康复, 2011,15(42): 7835-7838.
[14] Han P, Wu C, Chang J, et al. The cementogenic differentiation of periodontal ligament cells via the activation of Wnt/β-catenin signalling pathway by Li + ions released from bioactive scaffolds.Biomaterials. 2012;33(27):6370-6379.
[15] 鲁红,吴织芬,田宇,等.一种新型纳米羟基磷灰石材料应用于牙周组织工程的可行性研究[J].牙体牙髓牙周病学杂志, 2005,15(1):6-9.
[16] Yang Z, Ren L, Deng F, et al. Low-intensity pulsed ultrasound induces osteogenic differentiation of human periodontal ligament cells through activation of bone morphogenetic protein-smad signaling. J Ultras Med. 2014;33(5):865-873.
[17] 程远,曾照芳,朱俊,等.碱性成纤维细胞生长因子对牙周膜细胞内核心蛋白多糖基因表达的影响[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(11):2068-2071.
[18] 马宁,张莉,边立新,等.牙周膜细胞与壳聚糖-聚磷酸三钙复合材料生物相容性研究[J].中国实验诊断学, 2007,11 (10):1313-1316.
[19] Kim YT, Park JC, Choi SH, et al. The dynamic healing profile of human periodontal ligament stem cells: Histological and immunohistochemical analysis using an ectopic transplantation model. J Periodontal Res. 2012;47(4):514-524.
[20] Liu W, Konermann A, Guo T, et al. Canonical Wnt signaling differently modulates osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells derived from bone marrow and from periodontal ligament under inflammatory conditions. Biochimicaet Biophysica Acta. 2014;1840(3):1125-1134.
[21] Jung IH, Park J, Kim JC, et al. Novel application of human periodontal ligament stem cells and water-soluble chitin for collagen tissue regeneration: In vitro and in vivo investigations.Tissue Eng. 2012;18 (5/6): 643-653.
[22] Capretto L, Mazzitelli S, Colombo G, et al.Production of polymeric micelles by microfluidic technology for combined drug delivery: Application to osteogenic differentiation of human periodontal ligament mesenchymal stem cells (hPDLSCs). Int J Pharm. 2013;440(2):195-206.
[23] 张彦聪,顾相伶,刘洪玲,等.人牙周膜细胞在透明质酸钠/纳米羟磷灰石支架上的黏附与生长[J].山东医药, 2013, 53(38):15-17.
[24] Ji K, Liu Y, Lu W, et al. Periodontal tissue engineering with stem cells from the periodontal ligament of human retained deciduous teeth. J Periodontal Res. 2013; 48(1):105-116.
[25] 鲁红,吴织芬.纳米羟基磷灰石材料复合碱性成纤维细胞因子促进牙周组织再生的实验研究[C].//2011第九次全国牙周病学学术会议论文集,2011:124-124.
[26] Benatti BB, Silvério KG, Casati MZ, et al.Physiological Features of Periodontal Regeneration and Approaches for Periodontal Tissue Engineering Utilizing Periodontal Ligament Cells. J Biosci Bioeng. 2007;103(1):1-6.
[27] 刘泉,莫安春.钇-羟基磷灰石纳米微粒对人牙周膜细胞生物学行为的影响[J].牙体牙髓牙周病学杂志, 2008,18(3):139-143.
[28] 张清彬,张兆强,郑日成,等.Leptin对人牙周膜细胞骨向分化作用的实验研究[J].北京口腔医学,2012,20(2):77-79.
[29] 孙卫斌.纳米羟基磷灰石诱导人牙周膜细胞骨化分化的研究[D].四川大学,2005.
[30] 石铁,王泓杰,高秀秋,等.纳米羟基磷灰石及其复合材料对牙周膜细胞的影响[J].中国组织工程研究与临床康复, 2009,13(3):553-556.
[31] Yang Z,Jin F,Zhang X, et al.Tissue engineering of cementum/periodontal-ligament complex using a novel three-dimensional pellet cultivation system for human periodontal ligament stem cells. Tissue Eng Part C Methods. 2009;15(4):571-581.
[32] 孙卫斌,吴亚菲,丁一,等.纳米羟基磷灰石对人牙周膜细胞增殖活性的影响[J].东南大学学报(自然科学版), 2004, 34(6):802-805.
[33] 毛钊,毛曦,储成林,等.人牙周膜细胞接种于纳米-羟基磷灰石上的形态学研究[J].东南国防医药, 2008,10(3):161-163.
[34] 鲁红,吴织芬,田宇,等.人牙周膜细胞体外三维立体培养模型的建立[J].牙体牙髓牙周病学杂志, 2002,12(3):132-134.
[35] 吴晓楠,苗雷英,刘玉,等.电纺聚己内酯/Ⅰ型胶原蛋白/纳米羟基磷灰石复合材料的制备及其生物相容性研究[J].口腔医学,2015,(4):245-249.
[36] Yang H, Gao LN, An Y, et al. Comparison of mesenchymal stem cells derived from gingival tissue and periodontal ligament in different incubation conditions. Biomaterials. 2013;34(29):7033-7047.
[37] Wen Y,Lan J,Huang H,et al.Application of eGFP to label human periodontal ligament stem cells in periodontal tissue engineering. Arch Oral Biol. 2012;57(9):1241-1250.
[38] 孙卫斌,刘天佳,吴亚菲,等.纳米羟基磷灰石诱导人牙周膜细胞骨化分化的研究[C].//四川省口腔医学会成立大会暨第八次四川省口腔医学学术会议论文集,2005:35-38.
[39] 孙卫斌,吴亚菲,丁一,等.纳米羟基磷灰石诱导人牙周膜细胞碱性磷酸酶表达的研究[J].中华口腔医学杂志, 2006, 41(6):348-349.

引言

材料方法

1.1 设计体外观察性实验。

1.2 时间及地点实验于2015年10至12月在齐齐哈尔医学院附属第一医院实验室完成。

1.3 材料收集12颗正常恒牙，均来自于齐齐哈尔医学院附属第一医院口腔外科门诊，患者均因正畸拔除恒牙。患者年龄18-31岁，均知情并签署同意书，实验相关情况均经本院医学伦理部门审核通过。恒牙拔出后即刻置于PBS(4 ℃)中进行浸泡，并迅速送往本院实验室。实验过程中使用的左旋聚乳酸羟基磷灰石生物材料由四川大学生物材料工程研究中心提供。

1.4 实验方法

人牙周膜细胞分离培养与鉴定^[9-12]：对恒牙标本进行PBS洗涤，无菌环境下，刮取牙周膜组织，并用眼科剪剪碎，置DMEM培养液(含胎牛血清、链霉素、青霉素)中，置于CO₂培养箱中进行培养。观察细胞生长情况，收集第3代对数期细胞，接种于6孔板中，多聚甲醛固定后利用抗兔/鼠通用型免疫组化检测试剂盒，严格按照说明书，按照二步法进行波形丝蛋白、角蛋白染色。并利用碱性磷酸酶染色试剂盒进行碱性磷酸酶染色，于光镜下对胞质着色情况进行观察。

分组处理^[13]：将左旋聚乳酸羟基磷灰石材料培养板单孔大小，置于孔中，消毒后添加DMEM培养液。胰酶消化第3人牙周膜细胞后，制备单细胞悬液，细胞浓度 5×10⁹ L^-1，均匀接种在左旋聚乳酸羟基磷灰石生物材料上，接种浓度100 μL/块，设为观察组。并以单纯添加相同人牙周膜细胞为对照组，进行相同的培养。

细胞毒性检测^[14-15]：利用MTT法进行细胞毒性检测，每天收集两组细胞，利用酶标仪对各组在490 nm波长的平均吸光度(A)进行检测，并记录检测结果。连续观察10 d，每天进行数据记录，并描绘细胞生长曲线。

碱性磷酸酶活性检测^[16-18]：培养后1，2，3 d，去掉细胞上清，利用碱性磷酸酶试剂盒，严格按照试剂盒说明书进行操作，利用酶联免疫检测仪对2组在490 nm波长下的A值进行检测，并记录检测结果。

Ⅲ型胶原表达情况检测^[19-20]：收集培养1，2，3 d的2组细胞培养上清液，利用抗人Ⅲ型胶原抗体检测试剂盒，严格按照说明书进行操作，使用酶联免疫检测仪对待测样品的A值进行检测。并对2组细胞进行免疫荧光染色检测，常规细胞爬片之后进行PBS洗涤，添加鼠抗人Ⅲ型胶原单克隆抗体工作液，置于冰箱中。1 d后取出，PBS洗涤后添加样抗鼠荧光素FITC标记抗体，蒸馏水洗涤后利用甘油进行封固。PBS代替一抗作为阴性对照，利用荧光显微镜观察染色结果。

1.5 主要观察指标检测2组的碱性磷酸酶活性与Ⅲ型胶原表达情况；利用MTT法进行细胞毒性检测，并描绘细胞生长曲线。

1.6 统计学分析使用SPSS 18.0软件进行统计学分析，采用配对t 检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

牙周组织工程学中，种子细胞和支架材料是必要的元素^[21]。种子细胞的培养是组织工程的基本要素，细胞主要来源于自体、同种异体、异种组织细胞等。自体组织细胞应为首选,由于组织工程细胞培养多需要高浓度的细胞接种，自体组织细胞存在着数量上的局限性及长期传代后细胞功能老化的问题。牙周组织中的牙周膜也称牙周韧带，是致密的结缔组织，位于牙根和牙槽骨之间，由细胞、基质和纤维构成。

牙周膜细胞是十分重要的细胞之一，具有一定的分化潜能，且生物学性能稳定，因此被广泛的应用于牙周组织工程之中，成为一种重要的种子细胞^[22-25]。此次实验中，即选择于体外环境下进行人牙周膜细胞分离与培养，并作为种子细胞进行实验分析。牙周组织主要包含来源于外胚层的上皮组织和来源于中胚层的结缔组织，牙周成纤维细胞是牙周组织中的主要功能细胞，在牙周组织再生和修复中发挥着重要功能，故牙周膜细胞一般指来源于中胚层的成纤维细胞。研究过程中，需要对细胞进行鉴定，目前，波形蛋白和丝蛋白的常用的牙周膜细胞标志物^[26]。此次实验结果显示，经免疫组化染色，十分培养所得细胞波形蛋白、碱性磷酸酶染色均呈阳性表达，抗角蛋白染色呈阴性，表明所得细胞为实验所需人牙周膜细胞。组织工程的核心就是建立细胞与生物材料的三维空间复合体，即具有生命力的活体组织，用以对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代。共基本原理和方法是将体外培养扩增的正常组织细胞，吸附于一种生物相容性良好并可被机体吸收的生物材料上形成复合物，将细胞-生物材料复合物植入机体组织、器官的病损病分，细胞在生物材料逐渐被机体降解吸收的过程中形成新的在形态和功能方面与相应器官、组织相一致的组织，而达到修复创伤和重建功能的目的。在组织工程支架方面，相应的支架属于能与组织活体细胞结合并能植入生物体的材料。

理想的支架材料可以为细胞提供获取营养、气体交换、排泄废物和生长发育的场所，也是形成新的具有形态和功能的组织、器官的物质基础。组织工程的关键是构建细胞和生物材料的三维空间复合体，该结构是细胞获取营养、气体交换、废物排泄和生长代谢的场所，是新的具有形态和功能的组织、器官的基础。生物材料在组织工程中起着替代细胞外基质或组织、器官基质的作用。羟基磷灰石是一种常用的支架材料，具有良好的生物活性，被广泛应用于不同类型骨缺损的修复治疗之中^[27-30]。但是，羟基磷灰石材料质地较脆，机械性能较差，在塑型方面存在一定的限制，且降解速度较慢。聚乳酸也是一种应用十分广泛的支架材料，具有良好的组织相容性好^[31]。在进入体内之后，可以随着时间的推移逐渐发生降解，分解为乳酸，并经过人体的代谢排出体外。聚乳酸材料本身具有一定的缺陷，其机械强度较低，且降解产物呈酸性，易引起体内炎症反应。而在左旋聚乳酸中引入羟基磷灰石可以改变其性能，提供良好的细胞黏附生长环境。聚乳酸由乳酸单体聚合而成，其中，左旋聚乳酸是一种重要的类型，属于半结晶体，具备一定的机械强度^[32]。因此，通过对羟基磷灰石与左旋聚乳酸进行复合，可以很好的改善羟基磷灰石的性能，获得更加理想的支架材料^[33]。本次实验过程中，即选择以羟基磷灰石与左旋聚乳酸复合材料为支架材料，人牙周膜细胞为种子细胞，进行牙周组织工程构建。在对材料对细胞增殖影响情况进行检测的时候，选择进行MTT法检测。检测结果显示，不同时间2组细胞的A值经比较差异均无显著性意义(P均>0.05)。描绘2组人牙周膜细胞的生长曲线，形态基本一致。上述结果表明，与牙周膜细胞进行复合培养之后不为会对细胞活性产生影响，左旋聚乳酸羟基磷灰石生物材料具有良好的生物相容性。实验过程中，还选择将人牙周膜细胞和相应的生物支架材料进行直接接触复合培养。在人体牙齿等硬组织的形成和再生过程中，碱性磷酸酶是一种重要酶，是前体细胞向骨化亚群细胞以及骨组织进行转化的前提^[34-37]。如果在一定的条件下，刺激成骨细胞碱性磷酸酶的活性，会抑制细胞增殖，促进牙槽骨的吸收。复合材料还具有良好的可降解性，生物降解指的是在生物体内的体验、酶和细胞等多种因素的综合作用下，分子量变小的过程。材料的降解率应与组织细胞生长率相适应,降解时间应能根据组织生长特性进行人为调控或自我调整。牙周组织的愈合趋向于牙周各种细胞成分的竞争性生长，只有牙周膜细胞首先占据牙根面，才能形成真正意义的牙周组织再生。而以复合材料为支架，可以为牙周膜细胞提供良好的生长和增殖环境，增强其竞争力，更好的促进组织再生。目前认为，碱性磷酸酶是牙齿和骨等硬组织形成、代谢、再生过程中的重要矿化酶。同时碱性磷酸酶又是细胞分化成熟和成骨能力的重要标志酶，是前体细胞向骨化亚群细胞分化和向骨组织转化的前提。将牙周膜细胞与材料直接接触培养有助于评价其诱导骨化分化的能力。聚乳酸是具有光学活性的有规立构聚合物, 熔融或溶液中均可结晶、结晶度可达60%左右。牙周膜细胞可分泌碱性磷酸酶，其碱性磷酸酶活性与牙骨质细胞分化之间存在十分密切的联系。通过对细胞碱性磷酸酶活性的检测，也可以较好的了解到所使用生物支架材料的骨诱导能力^[38]。实验结果显示，共培养1，2，3 d，2组碱性磷酸酶活性经比较差异均无显著性意义(P均>0.05)。即提示左旋聚乳酸羟基磷灰石材料具有良好的骨诱导能力，可以促进细胞碱性磷酸酶活性的上升。在牙周膜中，胶原是一种重要的成分，可以分为不同的类型，Ⅲ型胶原是一种重要的类型，在牙周改建中发挥着重要的作用^[39]。此次研究中，培养1，2，3 d，2组Ⅲ型胶原A值经比较差异均无显著性意义(P均>0.05)。经免疫荧光染色检测，2组均呈现出明显的荧光染色。

上述结果表明，人牙周膜细胞可以在左旋聚乳酸羟基磷灰石材料上正常生长与增殖，未出现细胞毒性等不良反应。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程