脱细胞羊膜与医用膜修复腱鞘缺损防治肌腱粘连的比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.21.011

摘要/Abstract

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文题释义：
脱细胞羊膜：是经处理后的羊膜，去除上皮细胞层，仅有基底膜，因其组织相容性好，抗原性低，无毒副作用，在体内可被降解，在烧伤、眼科、妇产等领域等到了广泛应用。如 Gris等报道了冻干羊膜在眼科疾病治疗方面的作用，患者在随访中无不良反应；董丽霞等成功完成羊膜移植阴道成形37例，术后35例获随访，效果均满意。
理想的腱鞘修补材料：①可被吸收，在体内不残留任何异物。②获取容易，组织相容性好，无局部及全身无不良反应。③具有良好的通透性，在阻断肌腱外源性愈合的同时不影响肌腱愈合质量。④最好含有促进细胞黏附、生长、增殖和分化的因子。

背景：实验证实生物膜可用于腱鞘缺损的重建，抑制肌腱外源性愈合，为肌腱滑动提供良好的基床，减轻肌腱粘连。
目的：比较脱细胞羊膜与医用膜修复腱鞘缺损中防治肌腱粘连的作用。
方法：于66只来亨鸡双足第Ⅲ趾制备肌腱损伤、腱鞘缺损模型，随机分为3 组，每组22只，羊膜组采用脱细胞羊膜修复腱鞘缺损，医用膜组采用可吸收医用膜修复腱鞘缺损，对照组不修复腱鞘。术后2，4，8，12周取各组标本，进行大体、组织学及生物力学检测。
结果与结论：①大体观察：术后12周，羊膜组、医用膜组腱鞘完整，肌腱愈合良好，无粘连；对照组肌腱粘连严重。②组织学：术后8周，羊膜组假鞘中滑膜细胞数最多，基质内粗面内质网高度扩张，分泌旺盛，医用膜组次之，对照组滑膜细胞数最少，分布杂乱，基质内扩张空泡较前两组弱。术后12
周羊膜组、医用膜组成纤维细胞层状整齐排列，结构致密；对照组腱鞘组织结构疏松，成纤维细胞分布絮乱。③生物力学：羊膜组、医用膜组肌腱滑动距离、总屈趾角度均大于对照组(P < 0.05)，前两组间比较差异无显著性意义。术后12周，3组间最大拉伸断裂强度比较差异无显著性意义。④结果表明，脱细胞羊膜与医用膜重建腱鞘缺损均能明显屏障肌腱外源性愈合，防治肌腱粘连。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

ORCID: 0000-0002-9024-1654(田德虎)

关键词: 生物材料, 材料相容性, 脱细胞羊膜, 医用膜, 肌腱粘连, 肌腱愈合

Abstract:

BACKGROUND: Experiments have demonstrated that biological membranes can be used to reconstruct the tendon sheath and inhibit exogenous healing of the tendon. Therefore, these membranes provide a good bed for tendon gliding and reduce tendon adhesion.

OBJECTIVE: To compare the effects of acellular amniotic membrane and medical membrane against tendon adhesion during the repair of tendon sheath defects.

METHODS: Toes III from the bipeds of 66 leghorns were chosen to prepare tendon injury and tendon sheath defect models, which were randomly divided into three groups (n=22 per group). Amnion group were repaired with acellular amniotic membrane, medical membrane group with absorbable membrane, and control group had no treatment on tendon sheath defects. Gross, histological and biomechanical tests of each group were performed at 2, 4, 8, 12 weeks after surgery.

RESULTS AND CONCLUSION: At 12 weeks after surgery, in the amniotic membrane and medical membrane groups, the tendon sheath formed completely, and the tendon healed well, with no adhesion, but in the control group, there was serious tendon adhesion. At 8 weeks after surgery, the number of synovial cells in the false sheath was highest in the amniotic membrane group sequentially followed by the medical membrane group and control group. In the amniotic membrane group, the rough endoplasmic reticulum expanded highly and secreted exuberantly in the matrix, while in the control group, the synovial cells presented with messy arrangement, and expanded vacuoles in the matrix were weaker than those in the other two groups. At 12 weeks after surgery, fibroblasts were arrayed tidily in layer with dense structure in the medical membrane and amniotic membrane groups; but in the control group, fibroblasts were distributed disorderly with loose structure. Tendon sliding distance and total flexor toe angle in the amniotic membrane and medical film groups were significantly larger than those in the control group (P < 0.05), but there was no significant difference between the medical membrane and amniotic membrane groups. Additionally, the maximum tensile fracture strength had no significant difference among three groups at 12 weeks after surgery. These results indicate that both amniotic membrane and medical membrane can markedly protect the tendon from exogenous healing and adhesion.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Amnion, Tissue Adhesions, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

刘国立，于昆仑，白江博，马韬，杨彦涛，田德虎. 脱细胞羊膜与医用膜修复腱鞘缺损防治肌腱粘连的比较[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(21): 3117-3123.

Liu Guo-li, Yu Kun-lun, Bai Jiang-bo, Ma Tao, Yang Yan-tao, Tian De-hu. Acellular amniotic membrane versus medical membrane to prevent tendon adhesion in tendon sheath repair[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(21): 3117-3123.

图/表（结果） 9

2.1 实验动物数量分析实验动物基本情况良好，无死亡，手术切口无感染，无炎性坏死组织，66只来亨鸡均进入结果分析。

2.2 大体观察结果

术后2周：3组腱鞘缺损区均形成近似腱鞘样结构，肌腱损伤区可见炎性反应、组织充血水肿；羊膜组脱细胞羊膜模煳，仍可辨认，重建腱鞘内表面较光滑，透亮，可见明显滑液，肌腱断端有纤维组织链接，与重建腱鞘及周围组织无粘连；医用膜组假鞘内表面光滑，可见明显滑液，腱周无粘连，难以区分医用膜原有形态，外面与周围组织粘连，难以分开；对照组腱鞘内表面粗糙，未见明显滑液，有较多纤维结缔组织长入肌腱吻合口，较易剥离。

术后4周：各组标本肌腱吻合区炎性反应消失、组织水肿明显减轻；羊膜组重建腱鞘完整，鞘管内较多透明滑液，腱周未见粘连，羊膜难以辨认，肌腱吻合口愈合良好；医用膜组重建腱鞘完整，鞘管内较多透明滑液，肌腱滑动良好，医用膜已无法辨认，腱周无粘连，肌腱吻合口愈合良好；对照组无完整腱鞘，腱周组织与肌腱吻合口有较多纤维结缔组织相连，较牢固，剥离困难，肌腱吻合口愈合差，见图1。

术后8周与12周：各组重建腱鞘类似，羊膜组腱鞘完整，肌腱愈合良好，肌腱无粘连；医用膜组腱鞘完整，肌腱愈合区与腱鞘无粘连，肌腱愈合良好；对照组腱周结缔组织与肌腱愈合区粘连严重，肌腱难以形成有功能的滑动。

2.3 组织学观察结果

术后2周：3组标本组织学观察均有出血、水肿、炎性浸润，羊膜组出血、炎性细胞浸润较轻；医用膜组中度炎性细胞浸润，水肿明显；对照组可见大量炎性细胞浸润，伴出血、水肿，见图2。

术后4周：3组标本炎性细胞较之前均明显减少，羊膜组、医用膜组假鞘内表面可见成纤维样细胞成层状分布，羊膜组较医用莫组细胞更密集，靠近周围组织侧较多成纤维细胞分布；对照组内可见大量成纤维细胞较杂乱无章分布，靠近内表面侧稍密集。

术后8周与12周：各组腱鞘组织学观察结果类似，羊膜组、医用膜组成纤维细胞层状整齐排列，结构致密；对照组腱鞘组织结构疏松，成纤维细胞分布紊乱，见图3。

2.4 透射电镜观察结果

术后4周：羊膜组透射电镜下可见大量滑膜细胞，B型细胞明显多于A型细胞，且B型细胞扩张明显，基质内可见大量扩张的粗面内质网，内质网腔内充满分泌物；医用膜组电镜结果与羊膜相似，但滑膜细胞数较羊膜组低；对照组滑膜细胞含量明显低于前两组，且B型滑膜细胞基质内粗面内质网含量低、扩张度不明显，见图4。

术后8周：羊膜组和医用膜组透射电镜下分别可见较多B型滑膜细胞，少见A型滑膜细胞，B型滑膜细胞基质内粗面内质网高度扩张，腔内充满分泌物；对照组也可见较多B型滑膜细胞，内质网扩张程度不如前两组，见图5。

2.5 免疫组织化学结果

术后4周：羊膜组腱鞘靠近肌腱侧多数细胞的细胞膜、浆内见棕色明显高于背景色，为阳性细胞，即血管内皮细胞黏附分子1阳性；医用膜组阳性细胞较羊膜组少，但同样主要分布在一侧；对照组血管内皮细胞黏附分子1阳性反应细胞散乱分布在全视野，无明显集中区域，见图6A-C。

术后8周：羊膜组、医用膜组可见较多包膜呈棕色反应细胞，对照组较前两组稀少，见图6D-F。

2.6 生物力学检测结果

肌腱滑动距离：羊膜组与医用膜组术后不同时间点的肌腱滑动距离比较差异均无显著性意义，但均高于对照组(P < 0.05)，见表1。

足趾总屈曲角度：羊膜组与医用膜组术后不同时间点的肌腱滑动距离比较差异均无显著性意义，但均高于对照组(P < 0.05)，见表2。

肌腱最大拉伸断裂强度：术后2，12周，3组间肌腱最大拉伸断裂强度比较差异无显著性意义(P > 0.05)；术后4，8周，羊膜组、医用膜组最大拉伸断裂强度高于对照组(P < 0.05)，且羊膜组高于医用膜组(P < 0.05)，见表3。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2015年5至7月在河北医科大学第三医院动物实验中心完成。

1.3 材料可吸收医用膜(成都迪康中科生物医学材料有限公司)；ElectroForce 3520 生物力学测试(BOSE公司，美国)。

实验动物：6月龄雄性来亨鸡66只，体质量(2.25±0.06) kg，由河北医科大学动物中心提供，合格证编号：1505070。将66只来亨鸡随机分成3 组，羊膜组、医用膜组、对照组，每组22只。

羊膜：由河北医科大学第三医院妇产科提供，经产妇同意且产妇血清学检查HBV、HCV、HIV及梅毒、淋病均呈阴性。脱细胞羊膜按照罗静聪等^[5]提供的方法制备：将新鲜人羊膜经SPS溶液漂洗后用戊二醛交联，0.5%SDS震摇24 h，胰蛋白酶消化4 h，彻底漂洗，冷冻干燥，分装，环氧乙烷消毒，裁减成1.5 cm×2.0 cm大小备用。

1.4 实验方法选取来亨鸡双足第3趾制备肌腱损伤、腱鞘缺损模型。

实验动物肌肉注射氯胺酮25 mg/kg麻醉后，于第三趾跖侧面约近位趾间关节处行长约2 cm纵形切口，分离皮下组织，暴露腱鞘、屈趾肌腱，切除约1.0 cm× 0.5 cm大小腱鞘及部分趾浅屈肌腱，横行切断趾深屈肌腱1/2，切口用5-0无创缝合线“8”字吻合。羊膜组取适当大小脱细胞羊膜平铺于腱鞘缺损处，边缘缝合固定；医用膜组取适当大小医用膜平铺于腱鞘缺损处，边缘缝合固定；对照组双足腱鞘缺损不做修复。术后手术切口无菌敷料包扎，第三足趾屈曲位石膏固定，1周后去除石膏。

1.5 主要观察指标

大体观察：术后定期观察实验动物基本情况，于术后2，4，8，12周各组处死5只实验动物，取第Ⅲ趾，于一侧掀起皮肤及皮下组织，观察重建腱鞘光滑度、有无滑液、腱周组织粘连程度及肌腱愈合程度等。

组织学观察：于大体观察后从足趾中随机取2趾，以肌腱吻合口为中心切除0.5 cm×0.5 cm大小重建腱鞘组织，常规固定、包埋、切片、苏木精-伊红染色，光镜下行组织学观察。

透射电镜观察：术后4，8周在每组标本中快速切取新形成的假鞘1 mm×1 mm×1 mm组织块，3%戊二醛固定，环氧树脂包埋，切片，行透射电镜观察。

免疫组织化学观察：将腱鞘组织经40 g/L多聚甲醛固定，常规脱水、透明、石蜡包埋，参照HIGH-SABC免疫组化试剂盒说明的方法进行 VCAM-1免疫组化染色，苏木精复染，对腱鞘中滑膜细胞类型进行鉴定。

生物力学检测：术后2，4，8，12周在各组处死动物中分别选取5趾，离断掌趾关节，保留部分趾深屈肌腱，于生物力学实验机上测定肌腱滑动距离、总屈趾角度、肌腱最大拉伸断裂强度。

肌腱滑动距离：将足趾近节趾骨固定在实验机上，用1 N力牵引保留的部分趾深屈肌腱，逐渐增加牵引力到10 N。

标记、测量肌腱被拉出腱鞘的长度，并且用量角器测量各趾间关节的屈曲角度(提示肌腱粘连程度)，并计算总屈曲角度(总屈曲角度为3个趾间关节屈曲度之和)每个标本测3次，取平均值。

之后游离深屈肌腱周围组织，保留远节趾骨，分别将趾深屈肌腱两端固定在生物力学试验机上，调整好张力，以20 mm/N速度移动，至肌腱断裂，同步记录肌腱最大拉伸断裂强度，反映肌腱愈合质量。

1.6 统计学分析数据通过SPSS 22.0软件进行统计处理。数据以x(_)±s表示，组间两两比较采用SNK法检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

手部肌腱损伤后粘连常导致严重功能障碍，Ⅱ区损伤时常伴腱鞘损伤，导致严重的粘连，如何减轻或避免肌腱粘连是当前研究的重点与难点之一。腱鞘缺失后，腱周组织中大量成纤维细胞及炎性细胞向肌腱损伤处移动导致的瘢痕性愈合，是导致肌腱粘连的主要原因，即外源性愈合^[6-7]。如何减少“外源性”愈合，促进“内源性”愈合，对于预防肌腱粘连具有重大意义。研究证实，缺损腱鞘的重建对屏障肌腱外源性愈合、避免肌腱粘连的具有重要的作用^[8-11]。因此寻找一种合适的腱鞘替代材料是当前面临的主要难题。

Hurwitz等^[12]认为理想的腱鞘修补材料应具备以下几点：①可被吸收，在体内不残留任何异物。②获取容易，组织相容性好，无局部及全身无不良反应。③具有良好的通透性，在阻断肌腱外源性愈合的同时不影响肌腱愈合质量。④最好含有促进细胞黏附、生长、增殖和分化的因子；为此研究者们做了很多尝试，如Kessler、 Strauch、鲍卫汉、汤锦波等^[13-16]使用自体筋膜或静脉作为腱鞘替代材料，避免了组织间的排异反应，在动物或人体上均获得了较好的实验效果或临床疗效，但因自体组织材料来源有限，同时造成副损伤，在临床推广受到了限制；有研究构建的滑膜细胞-APC支架作为腱鞘修复材料，开辟了组织工程化腱鞘的新思路，在动物体上获得了预期的效果，但在种子细胞的获取、诱导分化、大量增殖等方面的技术还不成熟，需要更深入的探索研究，短期内还不能应用到临床^[16]；1994年潘进社等^[17]用生物膜(羊肠衣)修复鸡腱鞘缺损模型，在动物实验中获得了理想的效果；邵新中等^[18]将羊肠衣生物膜修复重建手外伤导致屈肌腱Ⅱ区腱鞘缺损患者，总数80例110指，肌腱粘连程度分级，优良率占82%，证实生物膜可用于腱鞘缺损的重建，能够抑制肌腱外源性愈合，为肌腱滑动提供良好的基床，减轻肌腱粘连，而且不影响肌腱愈合质量，这也是目前国内临床上修复、重建腱鞘缺损预防肌腱粘连的重要手段之一。

脱细胞羊膜是经处理后的羊膜，去除上皮细胞层，仅有基底膜，因其组织相容性好，抗原性低，无毒副作用，在体内可被降解，在烧伤、眼科、妇产等领域等到了广泛应用^[5^，^19-20]。如 Gris等^[21]报道了冻干羊膜在眼科疾病治疗方面的作用，患者在随访中无不良反应；董丽霞^[22]成功完成羊膜移植阴道成形37例，术后35例获随访，效果均满意。此次实验通过羊膜与医用膜重建鸡趾区肌腱腱鞘缺损的对比研究，探索羊膜重建腱鞘缺损，预防肌腱粘连的作用机制，筛选腱鞘重建的理想材料。

根据实验结果，3组实验动物术后伤口愈合良好，均无明显组织坏死及排异反应，术后3组组织学观察炎性反应程度为羊膜组<医用膜组<对照组，分析原因可能与羊膜抑制炎症反应有密切关系，3组均有腱鞘形成、肌腱不同成度愈合，羊膜组、医用膜组重建腱鞘完整，鞘管内较多透明滑液，腱周未见粘连，肌腱吻合口愈合良好；对照组无完整腱鞘，腱周组织与肌腱吻合口有较多纤维结缔组织相连，较牢固，剥离困难，肌腱吻合口愈合差。生物力学实验结果提示，羊膜组、医用膜组肌腱滑移度及足趾总屈曲角度明显优于对照组，与大体观察结果相符，术后4，8周，羊膜组肌腱最大拉伸断裂强度优于其余两组，说明腱鞘重建后阻挡肌腱外源性愈合的同时促进了内源性愈合，优化了肌腱愈合强度，认为其机制为：肌腱的营养除了腱周组织及腱束血管提供的血液营养外，滑膜细胞分泌的滑液扩散是鞘内肌腱的重要营养途径，脱细胞羊膜起到屏障作用的同时为滑膜细胞提供了基床，促进了滑膜细胞的生长及滑液的分泌，从而促进肌腱的内源性愈合^[4^，^23-25]。免疫组织化学结果：脱细胞羊膜组B型滑膜细胞最多，空白组最少，透射电镜结果：脱细胞羊膜组 B型滑膜细胞基质中粗面内质网、高尔基体高度扩张，医用膜组稍弱，空白组最不明显，而B型滑膜细胞正是分泌滑液的主要细胞，与预期结果相符。

综上所述，脱细胞羊膜与医用膜重建腱鞘缺损均能明显屏障外援性愈合，防治肌腱粘连，脱细胞羊膜在促进内源性愈合方面优于医用膜，且免疫原性低，无不良反应及毒副作用，是一种较理想的重建腱鞘缺损生生物材料。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程