姜黄素抑制大鼠创伤性骨关节炎模型中软骨细胞核因子κB P65核转位的实验研究

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.15.005

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (15): 2163-2170.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.15.005

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姜黄素抑制大鼠创伤性骨关节炎模型中软骨细胞核因子κB P65核转位的实验研究

王健，马捷，顾剑华，王富勇，尚修帅，王兆飞，王祥，陶海荣

上海交通大学医学院附属第九人民医院，上海市 201900

收稿日期:2016-02-04 出版日期:2016-04-08 发布日期:2016-04-08
通讯作者: 陶海荣，博士，副主任医师，硕士生导师，上海交通大学医学院附属第九人民医院骨科，上海市 201900 王祥，博士，副主任医师，上海交通大学医学院附属第九人民医院骨科，上海市 201900
作者简介:王健，男，1990年生，安徽省安庆市人，汉族，上海交通大学医学院在读硕士，主要从事骨关节炎的基础研究。
基金资助:
上海市宝山区科学技术发展基金项目(13-E-5)；上海交通大学“医工交叉”合作基金(YG2014MS23)

Curcumin inhibits nuclear translocation of nuclear factor-kappa B P65 in a rat model of traumatic osteoarthritis

Wang Jian, Ma Jie, Gu Jian-hua, Wang Fu-yong, Shang Xiu-shuai, Wang Zhao-fei, Wang Xiang, Tao Hai-rong

Department of Orthopedics, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 201900, China

Received:2016-02-04 Online:2016-04-08 Published:2016-04-08
Contact: Tao Hai-rong, M.D., Master’s supervisor, Associate chief physician, Department of Orthopedics, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 201900, China; Wang Xiang, M.D., Associate chief physician, Department of Orthopedics, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 201900, China
About author:Wang Jian, Studying for master’s degree, Department of Orthopedics, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 201900, China
Supported by:
the Science and Technology of Development Program of Baoshan District, Shanghai, China, No, 13-E-5; the Medical-Engineering Cross Foundation of Shanghai Jiao Tong University, China, No. YG2014MS23

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

姜黄素：是从姜科、天南星科中的一些植物根茎中提取的一种化学成分，分子式为C₂₁H₂₀O₆，为二酮类化合物。

核因子κBp65的核转位：核因子κB是一种在细胞浆中广泛表达的转录因子，p65-p50二聚体是其主要的存在形式。当细胞处于静息状态时，核因子κB通过与抑制性蛋白IκBα结合，从而以无活性的形式存在于细胞质中。在多种外界因素刺激下，其活性可以被多种因子激活，这些因子产生的第2信使信号导致IκBα的磷酸化和泛素化，继而被降解，核因子κB 脱离了IκBα的阻滞，可转位至细胞核，p65的核转位是核因子κB信号转导通路活化的重要标志。

背景：骨关节炎软骨细胞的退化是由于一系列的机械因素、炎性递质、生化因素，尤其是基质金属蛋白酶和活性氧等共同作用导致的。姜黄素在体外已被证明是一种有效地活性氧清除剂和活性氮提供剂，但保护关节软骨抑制骨关节炎作用和机制尚不明确。

目的：分析姜黄素防止骨关节炎中软骨损伤的作用机制。

方法：SD大鼠 30 只随机分为假手术组15只和模型组15只。模型组建立大鼠创伤性骨关节炎模型(阳性对照组)，分离软骨细胞进行体外培养，使用姜黄素(姜黄素组)和特异性的核因子κB抑制剂(PDTC组)共培养软骨细胞 24 h，Western Blotting和免疫荧光检测核因子κB P65核内外表达情况。RT-qPCR 检测细胞Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶13的表达。

结果与结论：Western Blotting检测显示阳性对照组P65主要在细胞核中表达，细胞浆中表达较少；姜黄素组P65主要在细胞浆中表达，细胞核中表达较少。免疫荧光观察阳性对照组核因子κB 均有不同程度的核转位，核转位细胞的核因子κB P65荧光标记主要浓集于核区；阴性对照组、姜黄素组和PDTC组核转位细胞的核因子κB P65荧光标记主要浓集于胞质区。实时荧光定量RT-qPCR检测显示姜黄素组基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶13的表达显著低于阳性对照组，而Ⅱ型胶原的表达显著高于阳性对照组。结果说明，姜黄素能够通过抑制骨关节炎模型中软骨细胞核因子κB信号通路活化，抑制核因子κB P65核转位，抑制软骨细胞释放基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶13的表达，增加Ⅱ型胶原的含量，保护软骨细胞，延缓软骨退变。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID:0000-0002-4264-8337(王健)

关键词: 组织构建, 软骨组织工程, 姜黄素, 骨关节炎, NF-κB, 基质金属蛋白酶, Ⅱ型胶原

Abstract:

BACKGROUND: Mechanical, inflammatory, and biochemical factors, particularly matrix metalloproteinases and reactive oxygen lead to chondrocyte degeneration in osteoarthritis. Curcumin has been shown to be a potent antioxidant; however, its protective effects against chondrocyte degeneration in osteoarthritis remain unclear.
OBJECTIVE: To investigate the potential molecular mechanisms underlying the protective effects of curcumin on articular cartilage of osteoarthritis in rats.
METHODS: A total of 30 Sprague-Dawley rats were used and randomly divided into model group (positive control, n=15) and normal group (negative control, n=15). Rat models of traumatic osteoarthritis were established, and then cartilage cells were isolated from articular cartilage and cultured in vitro. Chondrocytes were treated with curcumin (curcumin group) or PDTC (an inhibitor of nuclear factor-kappa B) for 24 hours. The expression level of nuclear factor-kappa B P65 in nucleus and cytoplasm in chondrocytes were determined by western blot assay and immunofluorescence. Moreover, mRNA expressions of type II collagen, matrix metalloproteinase-1 and -13 were analyzed using RT-qPCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Nuclear factor-kappa B P65 protein was mainly expressed in nucleus, but few in cytoplasm in positive control group; the reversed results were found in the curcumin group. Nuclear translocation of nuclear factor-kappa B P65 was observed mainly in nucleus in the positive control group; however, that was observed mainly in cytoplasm in the negative control, curcumin, and PDTC groups. Matrix metalloproteinase-1 and -13 mRNA expressions were significantly decreased, while type II collagen mRNA expression was significantly increased in the curcumin group compared with the positive control group. These findings indicated that curcumin protect chondrocytes against degeneration through inhibiting the activation of nuclear factor-kappa B signaling pathway, suppressing nuclear translocation of nuclear factor-kappa B P65 and inhibiting the expressions of matrix metalloproteinase-1 and -13, which are responsible for upregulation of type II collagen expression.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Curcumin, Osteoarthritis, NF-kappa B, Matrix Metalloproteinases, Collagen Type II, Tissue Engineering

王健，马捷，顾剑华，王富勇，尚修帅，王兆飞，王祥，陶海荣. 姜黄素抑制大鼠创伤性骨关节炎模型中软骨细胞核因子κB P65核转位的实验研究[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(15): 2163-2170.

Wang Jian, Ma Jie, Gu Jian-hua, Wang Fu-yong, Shang Xiu-shuai, Wang Zhao-fei, Wang Xiang, Tao Hai-rong. Curcumin inhibits nuclear translocation of nuclear factor-kappa B P65 in a rat model of traumatic osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(15): 2163-2170.

图/表（结果） 5

2.1 骨关节炎模型鉴定经番红-固绿染色处理以后，大鼠膝关节的透明软骨和钙化软骨区呈红色，系软骨细胞外基质被番红O深染所致；软骨下骨区呈蓝色，系骨细胞外基质被固绿染色所致；因此，软骨下骨与钙化软骨层之间界线明显，呈凸凹不平的梳齿状结构，透明软骨区可见淡染的软骨细胞陷窝，软骨下骨区可见散乱分布的骨细胞。正常膝关节组钙化软骨和软骨细胞外基质均多于模型组(图1)。

2.2 软骨细胞鉴定 Ⅱ型胶原免疫组织构建染色时。

软骨细胞胞浆被染成棕黄色，胞核不着色，甲苯胺蓝染色可见软骨细胞内呈紫红色异染颗粒，细胞周围有少量异染颗粒出现(图2)。

2.3 姜黄素对骨关节炎软骨细胞核因子κB P65 核转位的影响 Western Blotting分析表明，在阳性对照组，核因子κB P65主要要胞核内表达，胞浆中表达少；而在阴性对照组、姜黄素组和PDTC组，核因子κB P65主要要胞胞浆表达，胞核中表达少(图3)。免疫荧光分析发现，阳性对照组核因子κB 均有不同程度的核转位，核转位细胞的核因子κB P65荧光标记主要浓集于核区，胞质区减少；阴性对照组、姜黄素组和PDTC组核转位细胞的核因子κB P65荧光标记主要浓集于胞质区，核区减少(图4)。

2.4 姜黄素对骨关节炎软骨细胞Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶13表达的影响 RT-qPCR分析发现，阳性对照组基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶13表达增高，而Ⅱ型胶原较少；相反的，在阴性对照组、姜黄素组和PDTC组，基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶13表达受到抑制，而Ⅱ型胶原表达增高(图5)。

参考文献

[1] Shi D,Dai J,Xu Z,et al.Update on basic and clinical aspects of osteoarthritis. Ann Transl Med. 2015;3(10):142.

[2] Abeles AM, Pillinger MH.The role of the synovial fibroblast in rheumatoid arthritis: cartilage destruction and the regulation of matrix metalloproteinases. Bull NYU Hosp Jt Dis. 2006;64(1-2):20-24.

[3] Tchetverikov I,Lohmander LS,Verzijl N,et al. MMP protein and activity levels in synovial fluid from patients with joint injury, inflammatory arthritis, and osteoarthritis. Ann Rheum Dis. 2005;64(5):694-698.

[4] Aigner T,Soder S,Gebhard PM,et al.Mechanisms of disease: role of chondrocytes in the pathogenesis of osteoarthritis--structure, chaos and senescence. Nat Clin Pract Rheumatol. 2007;3(7):391-399.

[5] Pardo A,Selman M.MMP-1: the elder of the family. Int J Biochem Cell Biol.2005; 37(2):283-288.

[6] Tardif G,Reboul P, Pelletier JP, et al.Ten years in the life of an enzyme: the story of the human MMP-13 (collagenase-3).Mod Rheumatol. 2004;14(3):197-204.

[7] Bharti AC, Aggarwal BB.Nuclear factor-kappa B and cancer: its role in prevention and therapy. Biochemical pharmacology.2002;64(5-6):883-888.

[8] Mukhopadhyay A, Bueso-Ramos C, Chatterjee D,et al. Curcumin downregulates cell survival mechanisms in human prostate cancer cell lines.Oncogene.2001; 20(52):7597-7609.

[9] Bharti AC,Donato N,Singh S,et al.Curcumin (diferuloylmethane) down-regulates the constitutive activation of nuclear factor-kappa B and IkappaBalpha kinase in human multiple myeloma cells, leading to suppression of proliferation and induction of apoptosis. Blood.2003;101(3):1053-1062.

[10] Wan XH,Li YW,Luo XP. Curcumin attenuated the lipid peroxidation and apoptotic liver injury in copper-overloaded rats. Zhonghua Er Ke Za Zhi. 2007;45(8):604-608.

[11] Shen SQ,Zhang Y,Xiang JJ,et al.Protective effect of curcumin against liver warm ischemia/reperfusion injury in rat model is associated with regulation of heat shock protein and antioxidant enzymes. World J Gastroenterol. 2007;13(13):1953-1961.

[12] Chen Q,Wang Y,Xu K,et al.Curcumin induces apoptosis in human lung adenocarcinoma A549 cells through a reactive oxygen species-dependent mitochondrial signaling pathway. Oncology reports.2010;23(2):397-403.

[13] Zhang XH, Xu XX, Xu T.Ginsenoside Ro suppresses interleukin-1beta-induced apoptosis and inflammation in rat chondrocytes by inhibiting NF-kappaB. Chin J Nat Med.2015;13(4):283-289.

[14] Lee WT,Lee TH,Cheng CH,et al.Antroquinonol from Antrodia Camphorata suppresses breast tumor migration/invasion through inhibiting ERK-AP-1- and AKT-NF-kappaB-dependent MMP-9 and epithelial-mesenchymal transition expressions. Food Chem Toxicol. 2015;78:33-7841.

[15] Wang JJ, Huan SK, Hsieh KH, et al. Inhibitory effect of midazolam on MMP-9, MMP-1 and MMP-13 expression in PMA-stimulated human chondrocytes via recovery of NF-kappaB signaling. Arch Med Sci. 2013;9(2):332-339.

[16] Liacini A,Sylvester J,Li WQ,et al.Induction of matrix metalloproteinase-13 gene expression by TNF-alpha is mediated by MAP kinases, AP-1, and NF-kappaB transcription factors in articular chondrocytes.Exp Cell Res. 2003;288(1):208-217.

[17] Chen C,Ma C,Zhang Y,et al.Pioglitazone inhibits advanced glycation end product-induced TNF-alpha and MMP-13 expression via the antagonism of NF-kappaB activation in chondrocytes. Pharmacology. 2014;94(5-6):265-272.

[18] Cheng CC, Chen YH, Chang WL,et al.Phytoestrogen bavachin mediates anti-inflammation targeting Ikappa B kinase-I kappaB alpha-NF-kappaB signaling pathway in chondrocytes in vitro. Eur J Pharmacol. 2010;636(1-3):181-188.

[19] Caterson B,Flannery CR,Hughes CE,et al. Mechanisms involved in cartilage proteoglycan catabolism. Matrix biology: Matrix Biol. 2000;19(4):333-344.

[20] Yoshihara Y,Nakamura H,Obata K,et al.Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in synovial fluids from patients with rheumatoid arthritis or osteoarthritis. Ann Rheum Dis. 2000;59(6):455-461.

[21] Westermarck J,Kahari VM.Regulation of matrix metalloproteinase expression in tumor invasion. FASEB J.1999;13(8):781-792.

[22] Mort JS, Billington CJ.Articular cartilage and changes in arthritis: matrix degradation. Arthritis Res.2001;3(6): 337-341.

[23] Goldring SR,Goldring MB.The role of cytokines in cartilage matrix degeneration in osteoarthritis. Clin Orthop Relat Res. 2004;(427 Suppl):S27-36.

[24] Shakibaei M,John T,Schulze-Tanzil G,et al.Suppression of NF-kappaB activation by curcumin leads to inhibition of expression of cyclo-oxygenase-2 and matrix metalloproteinase-9 in human articular chondrocytes: Implications for the treatment of osteoarthritis.Biochem Pharmacol. 2007;73(9):1434-1445.

引言

骨关节炎是中老年人劳动力丧失的原因之一，其主要病理变化包括关节软骨逐渐丧失，骨赘形成，以关节疼痛、畸形和关节功能丧失为特征，最终会导致患者生活质量的下降。根据最新人口统计数据，在中国的膝关节骨性关节炎的患病率为1.3%-11.1%，而对于在60岁或以上的人群，症状性膝骨关节炎的患病率为19.4%[1]。骨关节炎发生发展的实质为在不恰当的生物力学因素的作用下，关节软骨细胞、细胞外基质和软骨下骨的生理平衡失调，关节软骨的分解代谢明显大于合成代谢。
关节发生骨关节炎时，各种基质金属蛋白酶表达和含量增高，这种改变在退变的早期首先见于关节面或关节面周围，是介导骨关节炎软骨破坏的重要因子[2-3]。其中基质金属蛋白酶13能直接切断软骨的Ⅱ形胶原，是裂解Ⅱ型胶原作用最强的酶。基质金属蛋白酶13裂解Ⅱ型胶原使得软骨间质的分解增加，而软骨间质分子的降解产物自身又可促进进一步地降解，从而形成持续性的恶性循环，Ⅱ型胶原是软骨胶原网的主要成分，它与蛋白黏多糖一起赋予软骨弹性及形变能力[4-6]。如果胶原网被破坏，则不但能明显削弱软骨抵抗外界应力的能力，而且还会使软骨细胞暴露于众多炎性因子的攻击之下，使软骨基质成分游离出软骨，导致软骨破坏。
姜黄素是从姜科、天南星科中的一些植物的根茎中提取的一种化学成分，具有降血脂、抗肿瘤、抗炎、利胆、抗氧化等作用。姜黄素作为天然的治疗癌症药物能够通过抑制核因子κB的活性来降低肿瘤细胞存活扩散及引起的继发性炎症[7-9]。正因为姜黄素有效的抗氧化，清除氧自由基和抗肿瘤作用，现在已经进入临床试验[9]。在骨关节炎的病理和进展中，主要的活性氧物质为一氧化氮、过氧硝酸盐、超氧化物阴离子。这些因素不仅是参与软骨细胞凋亡的有毒物质，而且是细胞代谢重要的信号分子。姜黄素通过增加机体多种抗氧化酶如谷肤甘肤还原酶(glutathione reductase，GSR)，铜/锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn superoxide dismutase，SOD)和过氧化氢酶(catalase，CAT)等的活性，抑制氧化作用的酶，清除自由基，螯合金属离子，完成抗氧化作用[10-12]。姜黄素的苯丙酞基是其抗炎的活性基团，能有效地使炎症介质产生减少。虽然姜黄素是一种特效的核因子κB抑制剂，在细胞或分子水平对关节软骨细胞的影响还没有研究。本研究通过姜黄素作用于骨关节炎软骨细胞和正常软骨细胞，检测姜黄素对软骨细胞核因子κB信号通路、细胞因子释放的影响，探讨姜黄素对骨关节炎的治疗作用机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计分组对照细胞学实验。

1.2 时间及地点实验于2015年2至8月在上海交通大学医学院附属第九人民医院北部完成。

1.3 材料 Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶、透明质酸酶为Sigma公司产品。DMEM培养液、Ham F-12 培养液为 Gibco 公司产品。姜黄素、PDTC(核因子κB抑制剂)购于MCE中国公司。新生小牛血清(FBS)系杭州四季青生物工程材料研究所生产。多克隆兔抗NF-κB p65、山羊抗兔二抗购自 abcam公司。细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒、Western Blotting相关试剂、实时荧光定量RT-qPCR相关试剂购于碧云天公司。

常用药物的配制、贮存及使用方法：①称取药物PDTC 82 mg，用1 mL溶剂DMSO溶解成浓度为 50 mmol/L的母液待用。②称取药物姜黄素3.7 mg，用 1 mL 溶剂二甲基亚砜溶解成浓度为10 mmol/L的母液待用。避光4 ℃保存。

1.4 方法

1.4.1 动物模型建立使用Hulth法制作大鼠骨关节炎模型，30只雄性SD大鼠购买于上海斯莱克实验动物有限责任公司，体质量150-200 g。体积分数10% 水合氯醛(300 mg/kg)腹腔麻醉后，随机选取15只，仰卧于手术台，取单侧膝关节剃毛、消毒铺巾后，取膝关节内侧纵切口长约2 cm，显露膝关节，然后切断前后交叉韧带及内侧副韧带，完整切除内侧半月板，保留关节软骨面。生理盐水冲洗切口，使用3-0缝线逐层关闭切口。另外15只做假手术对照，只切开关节腔，不破坏交叉韧带和半月板。同时使用头孢拉定500 mg 腹腔注射，1次/d，连续3 d。所有大鼠不固定伤肢，造模后7 d驱赶动物，30 min/d，分2次驱赶，驱赶动物4周后即可获得明显的骨关节炎模型。番红O-固绿组织染色验证骨关节炎模型。

1.4.2 软骨细胞分离培养实验在上海交通大学医学院附属第九人民医院(北院)中心实验室完成。取造模后6-8周的大鼠，颈椎脱臼法处死大鼠，截取大鼠膝关节，用 15 号解剖刀削下胫骨平台、股骨髁关节表面软骨，把适量软骨标本放入10无菌玻璃平皿中，倒入Gey平衡盐溶液(GBSS pH 7.0)淹盖标本为止。用解剖刀将软骨切成1 mm×1 mm×1 mm的小块，移入第2个玻璃培养皿，并用GBSS淹盖。收集全部切碎的软骨，除去GBSS，加入4 mL透明质酸酶，室温下作用5 min。除去透明质酸酶，另外加入8 mL新鲜透明质酸酶室温下作用10 min。

除去透明质酸酶，用5 mL GBSS洗组织碎块2次，然后移入25 mL螺口试管中。去除GBSS，用胰蛋白酶洗组织碎块2遍，每次用2 mL。去除用过的胰酶，再加新鲜胰酶4 mL，37 ℃，搅拌状态下培养30 min。去除胰酶，用GBSS清洗2遍，每次用5 mL。用0.2%胶原酶2 mL清洗5 min，去除清洗液。加入4 mL胶原酶，37 ℃培养30 min，去除上清液。加入4 mL胶原酶，37 ℃，培养90 min。将上清液收集，600×g离心8 min，获得细胞团。把细胞悬浮于8 mLF12培养液中(含体积分数20%胎牛血清)，180×g，离心1 min以去除未消化的软骨基质。将上清液移入另一管，600×g离心10 min，收集细胞。把细胞悬浮于8 mL F12培养液中(含体积分数12%胎牛血清)在75 cm²培养瓶中培养，添加培养液到12 mL。Ⅱ型胶原免疫组织构建和甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞。

1.4.3 实验分组 ①阴性对照组：正常的关节软骨细胞。②阳性对照组：成功造模后的关节软骨细胞。③姜黄素组：骨关节炎软骨细胞加入姜黄素(50 μmol/L)。④PDTC组：骨关节炎软骨细胞加入PDTC(10 μmol/L)。每组软骨细胞全部是经过鉴定的原代软骨细胞。每组设 3 个复孔，每组均重复3次。作用时间为24 h。

1.4.4 Western Blotting实验按照细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒说明书分别提取胞核蛋白和胞浆蛋白，采用BCA试剂盒定量，计算样品蛋白浓度。取30 μg细胞胞浆蛋白和核胞蛋白进行聚丙烯酞胺凝胶电泳，按湿转法将电泳产物转移到PVDF膜，5%脱脂奶粉4 ℃封闭2 h，滴加核因子κB P65一抗(1∶2 000) 4 ℃过夜，TTBS洗膜10 min×4次，滴加二抗(1∶4 000) 37 ℃孵育2 h，TTBS洗膜10 min×4次，TBS洗膜10 min，按ECL试剂盒说明进行显色，Ge1Doc凝胶成像仪采集图像，Bandscan分析软件分析条带灰度，进行半定量比较分析，并且均采用自身灰度值校正，以目的基因的条带密度与管家基因GAPDH或Lamin B1的密度比值表示蛋白的表达水平。

1.4.5 免疫荧光法实验在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，3 min/次；用40 g/L多聚甲醛固定爬片15 min，PBS浸洗玻片3次，3 min/次；0.5%Triton X-100( PBS配制 )室温通透20 min；PBS浸洗玻片3次，3 min/次，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30 min；吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗(1∶50)并放入湿盒，4 ℃孵育过夜；加荧光二抗(1∶100)：PBST 浸洗爬片3次，3 min/次，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37 ℃孵育1 h，PBST浸洗切片3次，3 min/次；复染核：滴加DAPI避光孵育5 min，对标本进行染核，PBST 5 min×4次洗去多余的DAPI；用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封固，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

1.4.6 实时荧光定量RT-qPCR实验药物处理目的细胞，从药物处理后的细胞中抽提总RNA，紫外分析测定所抽提RNA的浓度。RNA反转录成cDNA，根据目的基因序列信息设计并合成qPCR检测引物，序列见表1。RT-PCR预实验，以反转录的cDNA为模板，反应体系见表2。

用目的基因特异性引物和内参引物扩增待检测的目的基因片段和看家基因，摸索适合qPCR上机的最佳引物退火温度和模板量，若有杂带应重新调整PCR过程中的退火温度，直至杂带消失。在RT-PCR预实验摸索出最佳的引物退火温度和模板量的前提下，使用2×SYBR Green Mix配制PCR Mix，根据需要上机的样品数和重复数，计算并配制PCR Mix(2*SYBR Green

Mix 10 μL；引物Mix1 μL；模板1 μL)，将上述样品放入Eppendorf Realplex荧光定量PCR仪，SYBR Green法荧光定量PCR以分析各基因的表达，最后用??Ct法进行各基因表达的相对定量的数据分析。

1.5 主要观察指标 ①骨关节炎模型鉴定。②软骨细胞鉴定。③姜黄素对骨关节炎软骨细胞核因子κB P65 核转位的影响。④姜黄素对骨关节炎软骨细胞Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶13表达的影响。

1.6 统计学分析采用 SPSS 13.0统计软件进行统计分析，数据以x(_)±s表示，进行t 检验和方差分析(LSD 法)，显著性检验水平为P < 0.05。

讨论

核因子κB是一种在细胞浆中广泛表达的转录因子，p65-p50二聚体是其主要的存在形式。当细胞处于静息状态时，核因子κB通过与抑制性蛋白IκBα结合，从而以无活性的形式存在于细胞质中[13]。在多种外界因素刺激下，其活性可以被多种因子激活，这些因子产生的第二信使信号导致IκBα的磷酸化和泛素化，继而被降解[14]，核因子κB脱离了IκBα阻滞，而转位至细胞核，p65的核转位是核因子κB信号转导通路活化的重要标志。活化的核因子κBP65进入细胞核与其靶基因调控区域的特异性DNA序列接合[15]，靶基因转录被激活，导致多种趋化因子及细胞因子如白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、P-sel、ICAM-1等的表达，核因子κB通过调控细胞因子、生长因子、黏附分子、趋化因子以及多种酶的基因表达，从而在炎症、免疫反应、细胞凋亡、及肿瘤形成中扮演了重要角色[16]。
有研究证实，骨关节炎的炎症反应过程中涉及的众多细胞因子的基因表达，皆由核因子κB信号转导通路所激活，核因子κBP65一旦被激活，由它介导细胞所产生各种炎症分子、细胞因子以及一些酶类，导致软骨细胞肥大、凋亡及功能异常等[17]。故目前认为，核因子κB信号转导通路的激活可能是骨关节炎发生发展的重要机制之一，同时核因子κB是第一个被证实能直接对氧化应激起反应的转录因子，氧化应激可以诱导核因子κB胞质核转位，而抗氧化剂如NAC，PDTC等能抑制IκBα激酶的活性，阻止其被磷酸化和最终降解，抑制核因子κB的转位[18]。因此，氧化应激NF-KB的关键环节可能是通过信号转导的级联反应而引起的IκBα的磷酸化和最终降解[19]。目前，国内外均有研究证实，姜黄素对于由炎症因子介导的关节退变中，有抑制关节软骨降解的作用，姜黄素通过直接抑制IκBα的磷酸化，而抑制核因子κB的活化，使其无法进入细胞核内有特定靶基因序列DNA结合[20]。但姜黄素对软骨细胞保护作用的确切机制目前尚有待进一步阐明。在本研究中，通过建立大鼠创伤性骨关节炎模型，提取原代软骨细胞进行体外实验，免疫荧光分析发现，姜黄素及PDTC处理组，软骨细胞核内核因子κB P65的荧光强度明显低于阳性对照组(P < 0.05)，Western Blotting分析也表明，与阳性对照组相比，姜黄素及PDTC处理组细胞核的NF-κB P65蛋白的表达显著降低(P < 0.05)，以上结果表明，姜黄素对于骨关节炎的治疗可能主要通过抑制NF-κB 信号通路的激活。
基质金属蛋白酶通过裂解细胞外基质，从而介导软骨基质的破坏和骨性关节炎进展过程中重塑[20]，关节软骨通过产生基质金属蛋白酶促使软骨细胞病理性激活，进而导致局部关节组织的分解[19]。而在众多的基质金属蛋白酶蛋白家族分子中，基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶9和基质金属蛋白酶13作为诱导软骨损伤的分解因子，在骨性关节炎的炎症进展中起着尤为重要的作用[20]。在骨关节炎中，基质金属蛋白酶的上调被认为是降解细胞外基质的关键分子事件，因此，针对基质金属蛋白酶的治疗有望成为骨性关节炎重要靶向治疗方法之一。
研究发现，在基质金属蛋白酶1，基质金属蛋白酶9以及基质金属蛋白酶13的基因启动子部位，含有一个核因子κB的结合位点，核因子κB的激活对于基质金属蛋白酶表达的上调是必需的[20]。另有研究提示，在骨关节炎中，与正常对照组相比，核因子κB的表达、活化水明显增高，基质金属蛋白酶9和白细胞介素1的转录水平也显著高于正常对照组，且和核因子κB的活化水平呈正相关[21]。
Ⅱ型胶原是软骨基质的主要和重要组成部分，在关节炎的发病机制中，由Ⅱ型胶原所组成的关节软骨细胞外基质的降解是导致关节破坏的主要原因[21]。体外实验证实，软骨细胞是非增殖性的，且特征性的表达Ⅱ型胶原。基质金属蛋白酶通过裂解细胞外基质，从而介导软骨基质的破坏和重塑[22]。尤其是基质金属蛋白酶1，通过特征性地降解关节软骨促进骨关节炎的进展[23]。当基质金属蛋白酶1 在特定位点切割而产生3/4N末端和1/4 C末端片段，Ⅱ型胶原即被降解[3]。
以往研究表明，多条信号通路涉及到对于基质金属蛋白酶表达的调控，包括ip38，ERK，JNK，AP-1和核因子κB信号通路[19]。Shakibaei等[24]的研究表明姜黄素可以显著降低由白细胞介素1β诱导的人软骨细胞环氧化酶2和基质金属蛋白酶9的表达，其机制与抑制核因子κB的活性有关。本研究中进一步RT-qPCR分析发现，与阳性对照组相比，姜黄素及PDTC处理组基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶13表达明显降低(P < 0.05)，而Ⅱ型胶原表达显著上调(P < 0.05)，综合免疫荧光及Western Blotting结果，作者推测姜黄素对基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶13表达的抑制，及对Ⅱ型胶原表达的上调是通过抑制核因子κB P65的核转位实现的。
在骨关节炎的治疗中，维持正常的软骨基质代谢，降低软骨的降解是非常重要的。一种理想的骨关节炎的治疗方法，不仅需要阻断炎症因子所介导的软骨破坏，还要提高软骨基质的稳定性。本研究的结果表明，姜黄素对于软骨细胞的保护作用可能主要通过抑制核因子κB P65的核转位，从而抑制核因子κB信号通路，进而抑制基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶13的表达，及上调Ⅱ型胶原的表达，最终实现对软骨细胞的保护作用，延缓关节的退化。姜黄素作为一种代表性的植物来源药物，因其所具有的明显抗炎、抗氧化作用，几乎无胃肠道等不良反应的特点，其应用越来越受到重视。对于姜黄素在骨关节炎治疗中的应用，其有效性仍然需要长期大样本的临床前瞻性研究来支持。实验在一定程度上为姜黄素防治由骨关节炎引起的软骨退变提供了可靠的实验依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

姜黄素抑制大鼠创伤性骨关节炎模型中软骨细胞核因子κB P65核转位的实验研究

Curcumin inhibits nuclear translocation of nuclear factor-kappa B P65 in a rat model of traumatic osteoarthritis

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[1]	黄登承, 王志科, 曹学伟. 体外冲击波疗法治疗中老年膝骨关节炎短期疗效对比的荟萃分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1471-1476.
[2]	彭智浩, 冯宗权, 邹勇根, 牛国庆, 吴峰. 活动平台单髁置换后下肢力线与外侧间室骨关节炎进展的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1368-1374.
[3]	刘翔翔, 黄云梅, 陈文列, 林如辉, 卢小冬, 李钻芳, 许亚晔, 黄美雅, 李西海. 早期骨关节炎模型大鼠半月板白区细胞的超微结构变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1237-1242.
[4]	曹旭含, 白子兴, 孙承颐, 杨艳军, 孙卫东. “乳香-没药”治疗膝骨关节炎网络药理学分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 746-753.
[5]	黎永华, 冯强, 谭仁霆, 黄世福, 邱金龙, 尹恒. 杜仲活性成分抗膝骨关节炎滑膜炎病变分子机制的网络药理学阐述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 765-771.
[6]	宋珊, 胡方媛, 乔军, 王佳, 张升校, 李小峰. 基于生物信息学途径认识骨关节炎滑膜的生物学标志物[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 785-790.
[7]	邓桢翰, 黄勇, 肖璐璐, 陈昱霖, 朱伟民, 陆伟, 王大平. 骨形态发生蛋白在关节软骨再生过程中的作用与应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 798-806.
[8]	刘欣, 颜飞华, 洪坤豪. 调控水通道蛋白表达延缓膝骨关节炎模型大鼠软骨退变[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 668-673.
[9]	马泽涛, 曾晖, 王德利, 翁鉴, 冯松. 微小RNA-138-5p与软骨细胞增殖和自噬的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 674-678.
[10]	郑力, 李大地, 胡维帆, 唐金龙, 赵凤朝. 单侧全膝关节置换后对侧膝关节置换的风险评估[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 374-379.
[11]	罗安玉, 刘瀚霖, 谢小飞, 黄琛. 抗氧化合剂对膝骨关节炎模型大鼠结构性退变的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3625-3629.
[12]	刘金富, 曾平, 农焦, 范思奇, 冯程钦, 黄佳兴. 整合多组微阵列芯片分析骨关节炎患者滑膜中生物标志物和治疗靶点[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3690-3696.
[13]	陈锋, 章晓云, 陈跃平, 廖建钊, 李嘉骏, 宋世雷, 赖渝. 淫羊藿苷元治疗骨关节炎分子机制的网络药理学和生物信息学分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3704-3710.
[14]	杨威, 陈泽华, 易志勇, 黄旭东, 韩清民, 张荣华. 关节腔内注射透明质酸与安慰剂治疗早中期膝骨关节炎的疗效差异：基于随机、双盲、对照、临床试验的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3760-3766.
[15]	俞颖豪, 赵继军, 刘冬铖, 陈宇浩, 冯德宏. 数字图像术前规划辅助单髁置换对固定平台假体摆位的临床指导意义[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(21): 3324-3331.