钛表面梯度生物活性涂层材料在颅骨修补中的生物性能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.12.015

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

钛网：颅骨修补所使用的钛是一种有一定硬度的平板金属，名为钛网片或钛网。修补之前，可即通过对患者头部进行螺旋CT扫描，将得到的颅骨三维数据转化为颅骨缺损部位三维加工格式数据，数控加工中心机床据此加工出修复体的样板，钛网成型压力机根据样板将钛材料制造成完全符合患者颅骨缺损部位要求的颅骨钛网补片。

常规钛网修复材料的不利因素：钛网修补颅骨缺损，可以达到很好的临床效果，修复外观也较为理想。但在利用钛网进行颅骨缺损修复时，常规钛网缺乏骨诱导能力，与骨组织之间处于机械性接触的状态，与骨之间的结合力较低，影响修复效果。

背景：钛网修补颅骨缺损具有良好的临床效果，但由于钛网缺乏骨诱导能力，与骨组织的结合力较差。

目的：观察钛表面梯度生物活性涂层材料在颅骨修补中的生物性能。

方法：将含梯度生物活性涂层钛网与纯钛网分别与成骨细胞共培养14 d，采用MTT法检测细胞增殖。纳入71例颅骨缺损患者，其中男43例，女28例，年龄15-60岁，分2组修复，观察组(n=33)采用含梯度生物活性涂层钛网进行修补，对照组(n=38)采用纯钛网进行修补。修补后随访12个月，观察修复效果及不良反应。

结果与结论：①体外实验结果：活性涂层钛网组培养8，10，12，14 d的细胞增殖活性显著高于纯钛网组(P < 0.05)。②体内修补试验结果：观察组术后住院天数、伤口愈合时间显著短于对照组(P < 0.05)，末次随访修复效果满意率显著高于对照组(P < 0.05)，两组钛网固定牢固，未出现浮动，未出现感染及修补材料外露。③结果表明，钛网表面的梯度生物活性涂层具有良好的生物相容性及促成骨性能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

ORCID: 0000-0001-9953-8019(黄俊红)

关键词: 生物材料, 材料相容性, 钛金属, 颅骨缺损, 颅骨修补材料, 梯度涂层, 羟基磷灰石, 生物相容性, 生物性能

Abstract:

BACKGROUND: Titanium mesh has good clinical effect in repairing skull defects, but due to the lack of bone induction ability, the titanium mesh has a poor integration with the bone tissue.
OBJECTIVE: To observe the biological properties of the gradient bioactive coating materials on the titanium surface in the skull repair.
METHODS: Osteoblasts were co-cultured with the titanium mesh with or without gradient bioactive coatings for 14 days, and then cell proliferation was detected using MTT method. Seventy-one patients with skull defects were enrolled, including 43 males and 28 females, aged 15-60 years, and were subjected to skull repair using the titanium mesh with (observation group, n=3) or without (control group, n=38) gradient bioactive coatings. During the postoperative follow-up of 12 months, the repairing effects and adverse reactions were observed in the two groups.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) In vitro cell culture: the cell proliferative ability was increased significantly in the observation group as compared with the control group at 8, 10, 12 and 14 days after cell culture. (2) In vivo repair: the hospital stay and wound healing time in the observation group were significantly lower than those in the control group (P < 0.05), and at the final follow-up, the postoperative recovery effect was significantly higher in the observation group than the control group (P < 0.05). The titanium meshes were fixed firmly in the two groups, with no floating, infection and exposure. These results show that the titanium mesh with gradient bioactive coating has good biocompatibility and osteoinduction capacity.

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图/表（结果） 6

2.1 体外实验结果

两组试件表面成骨细胞的生长情况：培养14 d，涂层钛网组细胞增殖速度快，出现大量增殖，纯钛试件组细胞增殖速度较慢，细胞增殖数量较少，见图1。

分别在培养1，2，4 ，6，8 ，10，12，14 d取试件进行MTT检测，记录吸光度值，并绘制细胞增殖曲线，见图2。通过对两组曲线的分析可以发现，两组试件表面成骨细胞生长趋势基本相同，随着时间的推移，均呈现出吸光度值不断上升的情况，在不同时间点对两组吸光度值进行比较，可得涂层钛网组接种后期(8 d以后的)细胞增殖情况显著优于纯钛试件组(P < 0.05)，见表1。

2.2 体内试验结果

2.2.1 参与者数量分析经意向性分析处理，入组的71例患者均完成12个月随访，进入最终的结果分析。

2.2.2 试验流程见图3。

2.2.3 两组基线资料比较两组性别分布、年龄、颅骨缺损时间、缺损部位等比较差异无显著性意义，具有可比性，见表2。

2.2.4 两组修复时间、术后住院时间及修复效果满意度的比较观察组术后住院天数和伤口愈合时间显著短于对照组(P < 0.05)，末次随访修复效果满意率显著高于对照组(P < 0.05)，见表3。

2.2.5 不良反应发生情况观察组患者术后均未出现感染现象，钛网固定牢固，未出现浮动，经CT复查修复颅骨形状与对侧正常颅骨形状一致，其中1例患者出现皮下积液，但数量较少，未予以特殊处理，术后7 d自行吸收；对照组1例钛网边缘翘起，4例出现皮下积液，予以抽吸、加压包扎治疗，均在14 d内自行吸收，无感染及修补材料外露。

2.2.6 典型病例分析 35岁男性车祸致颅骨缺损患者，缺损面积120 cm²。征得患者及其家属知情同意，采用表面梯度生物活性涂层钛网予以颅骨修补治疗，术后7 d拆线，切口甲级愈合，修复外观基本对称，患者及其家属均对修复效果表示满意(图4)。

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引言

材料方法

1.1 设计回顾性病例分析。

1.2 时间及地点试验于2013年7月至2014年7月在漯河医学高等专科学校第一附属医院实验室完成。

1.3 对象纳入颅脑缺损患者71例，其中男43例，女28例；年龄15-60岁，平均(41.15±11.37)岁；50例为颅脑外伤，11例为自发性脑出血术后，10例为颅骨骨瘤及颅内肿瘤术后；31例为额颞部缺损，22例为颞顶部缺损，18例为枕顶部缺损；颅骨缺损面积85-155 cm²，平均(126.5±60.35)cm²；颅骨缺损时间3-10个月，平均(6.56±1.55)个月。

纳入标准：颅骨缺损导致不良反应，且有碍美观者；身体一般情况良好者；对手术相关情况知情且签署同意书者。

排除标准：颅骨缺损创口处存在感染者；同时参加其他临床研究者；身体一般情况差，有重大内科疾病或脏器功能衰竭并长期卧床者。

71例患者均接受颅骨修补治疗，按照使用的修复材料分为对照组(n=38)和观察组(n=33)，分别予以常规钛网修复和表面梯度生物活性涂层钛网修复治疗。

1.4 材料此次研究中使用的颅骨修补钛网，由深圳市普天阳医疗器械有限公司提供，产品由符合GB/T13810标准中规定的TA2纯钛材料制成，非灭菌包装，产品注册号食药监械(进)字2011第3464068号。经过测试，产品无无细胞毒性，具有良好的血液及组织相容性。

1.5 方法

梯度生物活性涂层钛网的制备：利用复合氧化法和水热沉淀法在钛网表面制备梯度生物活性涂层^[8-9]。自行研制阳极氧化装置，对纯钛试件进行预阳极氧化处理。首先利用1 200号金相砂纸对纯钛试件表面进行打磨，然后用去离子水和丙酮溶液清洗试件，去除表面油类污染物。处理完毕后放入体积比为3∶1的硝酸和氢氟酸溶液中进行酸洗，去除氧化物，最后放入去离子水中清洗，备用。利用去离子水配比草酸溶液0.05 mol/L对纯钛表面进行预氧化，预氧化过程中，将纯钛试样作为阳极，不锈钢作为阴极。预氧化完毕后将纯钛试件放入去离子水中进行清洗，清洗完毕立即放入装有磷酸盐和钙盐溶液(摩尔比1.67%)的烧杯中，然后放入高压釜中进行水热沉积，进行2 h的加热处理，获得梯度生物活性涂层钛网。

梯度生物活性涂层的细胞毒性检测：取5 cm×5 cm梯度生物活性涂层钛网与常规无涂层钛网，分别置于培养板中。取成骨细胞株(上海拜沃生物科技有限公司)，利用胰蛋白酶(石家庄科兴新技术产品有限公司)进行消化，添加含胎牛血清(以色列BioInd公司)的RPMI1604 培养液(上海宝曼生物科技有限公司)制备细胞悬液，细胞浓度为2×10⁷ L^-1，分别接种于含有不同钛网试件的培养板中，将培养板置于二氧化碳培养箱中培养。连续培养14 d后取出，向培养板不同孔中添加MTT溶液，每孔20 μL，置于孵育箱中孵育，4 h后终止培养，去掉孔内上清，向各孔中添加DMSO(北京雅安达生物技术有限公司)，每孔150 μL，振荡1 min，充分溶解结晶物。利用酶联免疫检测仪(北京绿源大德生物科技有限公司)检测各孔的吸光度值(570 nm波长)。

颅骨修补：据患者颅骨缺损范围、部位、缺损对侧部位，采用数字化个体钛网成形技术预先塑形。在缺损骨窗边缘切开骨膜，显露距骨窗2-10 mm的骨床，用自攻钛钉固定于缺损边缘，逐层切开头皮，在帽状健膜下或额颗肌下仔细分离硬脑膜，避免损伤硬脑膜。将修补材料对准方向后置入缺损区域，根据术前设计预定部位放置修复材料，保证修复体与骨缺损边缘贴合。所有患者皮瓣下置1根引流管，复位软组织后再次冲洗手术区域，分两层缝合伤口，头皮下放置负压引流，加压包扎固定5-7 d，防止头皮下积液。

1.6 主要观察指标 ①两组试件表面成骨细胞的增殖情况。②两组患者术后住院时间、伤口愈合时间。③随访统计患者满意度。如果修复部位曲度及边缘与缺损处吻合良好，两侧对称，生理解剖形态成型，头颅外观良好，患者对修复效果满意。④两组患者术后及随访不良反应发生情况。

1.7 统计学分析使用SPSS 19.0软件，成骨细胞生长情况和两组患者修复时间、术后住院时间等计量资料均予以t 检验，两组患者修复效果满意度等计数资料均予以χ²检验，计算P 值，P < 0.05表示差异有显著性意义。

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讨论

颅颌面骨包括颅骨、眼眶、颧骨、颌骨、下巴骨等，受到疾病和外伤等因素的影响，容易出现骨缺损^[10-12]。颅骨缺损会导致患者的额部和颞部一侧颅骨凹陷或突起，给患者带来沉重的心理负担，影响其日常生活，甚至导致各种并发症的出现^[13-14]。

通过修复可以对颅骨缺损导致的局部塌陷问题予以有效解决，维持稳定的颅内压生理平衡状态^[15-16]，对提高预后效果，改善患者的生活质量等都有十分重要的现实意义^[17-20]。Winkler等^[21]通过研究发现，对存在颅骨缺损的患者实施颅骨修补治疗，可有效改善患者的脑糖代谢功能及脑脊液、脑血流储备功能，促进受损神经功能的恢复。Sakamoto等^[22]通过对接受颅骨修补的患者进行术后CT灌注检测发现，修补治疗后缺损区的血流情况得到显著改善，相应的正常区也可得到一定的改善。Kuo等^[23]对13例存在颅骨缺损的患者进行颅骨修补治疗，术后复查发现，较之术前，患者的上肢肌力及巴塞尔指数、脑血流量等指标均得到显著改善。国内学者王守臣等^[24]也通过对56例患者实施颅骨修补并进行随访发现，实施颅骨修复可以恢复颅腔的密闭性，术后患侧血流速度得到显著改善，基本恢复至正常水平。Yoshida等^[25]认为在脑水肿现象消失之后即可实施颅骨修补。

在进行颅骨缺损修复时，目前有较多的方法进行修补，钛合金材料修补已是一个大的趋势^[26]。修补之前，结合不同患者缺损颅骨的大小和形状，采用数字化手段制备三维钛网，并利用钛网进行修复治疗^[27-28]。钛网颅骨修补所使用的钛是一种有一定硬度的平板金属，名为钛网片或钛网。通过对患者头部进行螺旋CT扫描，将得到的颅骨三维数据转化为颅骨缺损部位三维加工格式数据，数控加工中心机床据此加工出修复体的样板，钛网成型压力机根据样板将钛材料制造成完全符合患者颅骨缺损部位要求的颅骨钛网补片^[29-30]。修补结束之后，可以达到很好的临床效果，修复外观也较为理想。但在利用钛网进行颅骨缺损修复时，常规钛网缺乏骨诱导能力，与骨组织之间处于机械性接触的状态，与骨之间的结合力较低，影响修复效果^[31]。为此，可以尝试对钛网进行处理，在材料表面覆盖一层具有生物活性的涂层，以提高其生物性能。

本次实验过程中，首先利用复合氧化法对常规钛网进行处理，在钛表面形成一层均匀分布的致密氧化膜；然后，利用水热处理制备羟基磷灰石涂层。羟基磷灰石是一种新型的生物材料，具有良好的生物相容性^[32-33]。羟基磷灰石还具有多孔结构，覆盖在钛网表面之后，可对各种有害金属离子向体液的溶出过程发挥有效阻断，并为细胞的增殖及成骨反应等提供良好的条件^[34]，促进骨组织和植入体的黏附，加快骨组织生长速度，从而达到更好的骨缺损修补效果^[35]。

骨缺损修复材料需要具备良好的生物相容性，本次实验以人成骨细胞为例，对所梯度生物活性涂层的细胞毒性进行分析。实验过程中，对诱导分化的成骨细胞株进行14 d的连续培养，发现涂层钛网试件组细胞增殖速度快，出现大量增殖；纯钛试件组细胞增殖速度较慢，细胞增殖数量较少。分别在培养1，2，4，6，8，10，12，14 d取试件进行MTT检测，记录吸光度值，并绘制细胞增殖曲线。通过对两组曲线的分析可以发现，两组试件成骨细胞生长趋势基本相同，随着时间的推移，均呈现出吸光度值不断上升的情况。不同时间点对两组的吸光度值进行比较，可得生物活性涂层试件在接种后期(8 d以后)细胞增殖情况显著优于纯钛试件。利用含梯度生物活性涂层钛网对患者进行颅骨缺损修补治疗后也发现，患者术后均未出现感染现象，1例患者出现少量皮下积液，未予以特殊处理，自行吸收，钛网固定牢固，未出现浮动，经CT复查修复颅骨形状与对侧正常颅骨形状一致。上述结果表明，较之常规无涂层钛网，实验所制备的含梯度生物活性涂层钛网具有良好的生物相容性，不会对细胞产生毒性。

本次研究结果还显示，观察组术后住院天数和伤口愈合时间显著短于对照组，术后修复效果满意率则显著高于对照组，分析出现这一结果的原因，是因为无涂层钛网表面较为光滑，会呈现出一定的生物惰性，在置入人体之后，生物活性较低^[36-37]。含梯度生物活性涂层的钛网含有羟基磷灰石，其富含的钙、磷等元素均能够对组织、细胞的生长产生积极的促进作用，多孔结构及局部钙离子溶出还可以为细胞的黏附、生长提供所需条件^[38-40]。

综上所述，钛表面梯度生物活性涂层材料具有良好的生物相容性，利用其对颅骨缺损患者进行修补治疗可以获得理想的临床效果，且不良反应轻微，是一种安全有效的修复材料。

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