雌二醇和孕酮对去势模型小鼠子宫内膜巨噬细胞及相关因子表达的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.49.022

摘要/Abstract

摘要：

背景：有研究表明，巨噬细胞功能及巨噬细胞集落刺激因子的表达可能受雌、孕激素直接或间接调控，但具体影响尚未深入研究。
目的：观察雌二醇和孕酮对双侧卵巢切除小鼠子宫内膜巨噬细胞及巨噬细胞集落刺激因子表达的影响。
方法：将双侧卵巢切除的小鼠随机分为雌激素组、孕激素组和对照组，分析各组小鼠子宫内膜巨噬细胞的数量和巨噬细胞集落刺激因子的表达强度。
结果与结论：免疫组织化学染色结果显示，与对照组相比，雌激素组与孕激素组小鼠子宫内膜巨噬细胞数量、干预6，24 h后巨噬细胞集落刺激因子的表达明显高于对照组(P < 0.05)。结果证实，雌二醇和孕酮都对子宫内膜巨噬细胞有趋化作用，并可以诱导巨噬细胞集落刺激因子的表达。

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关键词: 实验动物模型, 细胞损伤与修复模型, 雌二醇, 孕酮, 巨噬细胞, 巨噬细胞集落刺激因子, 卵巢切除, 子宫内膜

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that macrophage function and macrophage colony-stimulating factor expression may be directly or indirectly affected by regulation of estrogen and progestational hormone, but the specific impact has not been studied in depth.
OBJECTIVE: To observe the effect of estradiol and progesterone on the number of macrophages and the expression of macrophage colony-stimulating factor in the endometrium of bilaterally ovariectomized mice.
METHODS: The bilaterally ovariectomized mice were randomly divided into estrogen, progestational hormone, and control groups. The number of macrophages and the expression of macrophage colony-stimulating factor in the endometrium of mice in each group were analyzed.
RESULTS AND CONCLUSION: Immunohistochemical staining results showed that after 6 and 24 hours of intervention, the number of macrophages and the expression of macrophage colony-stimulating factor in the mouse endometrium in the estrogen and progestational hormone groups were significantly higher than those in the control group (P < 0.05). These results confirm that both estradiol and progesterone can increase the number of macrophages, and can increase the expression of macrophage colony-stimulating factors in the endometrium of bilaterally ovariectomized mice.

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中图分类号:

R318

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图/表（结果） 3

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引言

巨噬细胞是免疫细胞的一种，在子宫常驻并参与子宫内的免疫效应、局部免疫应答和免疫调节等，在哺乳动物妊娠建立与维持期间发挥重要作用^[1]。巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)是一种多肽造血生长因子，可以促进单核-吞噬细胞的存活、分化和增殖，通过自分泌与旁分泌形式来调节胎盘的发育与功能^[2]。雌激素可促进卵泡成熟及子宫发育，使子宫内膜增生等，在月经产生的过程中发挥着重要作用。雌二醇和孕酮是妊娠期发挥重要作用的两种激素，其中雌二醇可以增加子宫内膜厚度，提高子宫对植入物的敏感度，为胚胎着床创造条件；孕酮可以将子宫内膜从增生期转化为分泌期，提供受精卵着床与生存的适宜环境。子宫内膜达到容受状态是成功妊娠的关键因素之一，此时子宫内膜结构、细胞组成及基因的表达等在雌孕激素的调节下均发生改变并且在时间和空间上达到高度的协调一致。
目前，大量临床研究报道在体外受精-胚胎移植周期(IVF-ET)中过高的雌激素水平及孕激素水平对子宫内膜容受性产生影响，降低临床妊娠率。而围着床期子宫巨噬细胞数量和分布有着高度的时间和空间特异性，对子宫内膜容受性有着重要影响，围着床期巨噬细胞数量、活性及表型异常均可降低子宫内膜容受性。国内外针对妊娠期子宫内巨噬细胞分布、激活、分化等方面的研究显示^[3]，巨噬细胞功能及巨噬细胞集落刺激因子的表达可能受雌、孕激素直接或间接调控，但具体影响尚未深入研究。巨噬细胞在功能和调节表达正常时，能够清除已凋亡的滋养细胞，降低自身前炎症因子分泌，促进抗炎症因子释放，减少死亡细胞渗漏和蓄积，有效避免针对胎儿抗原的免疫攻击，帮助构建胚胎着床的合适免疫微环境。巨噬细胞集落刺激因子是一种由二硫键连接的同源双体糖蛋白，其表达形式有3种：膜结合型、细胞外基质结合型和可溶型。人和小鼠的大部分器官都能够表达巨噬细胞集落刺激因子，不过表达量较少，只有在子宫中出现高度表达，胎盘及子宫内膜组织中都可见巨噬细胞集落刺激因子表达。
为进一步分析雌二醇和孕酮对双侧卵巢切除小鼠子宫内膜巨噬细胞及巨噬细胞集落刺激因子表达的影响，从而为进一步了解巨噬细胞在生殖生理学、生殖免疫学的作用，为解决生殖医学临床上迫切需要解决的着床障碍、器官移植提供新思路，为寻找和开发主动干预的免疫学新途径提供动物实验理论依据。本次实验观察雌二醇和孕酮对双侧卵巢切除小鼠子宫内膜巨噬细胞及巨噬细胞集落刺激因子表达的影响。

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材料方法

1.1 造模动物及材料性发育成熟的9至10周龄SD雌鼠60只，体质量(200±20) g，由从大连医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK(辽)2008-0002。

1.2 造模方法实验于2013年1月至2014年1月在齐齐哈尔医学院中心实验室完成。
构建去势小鼠模型[3]：小鼠腹腔注射0.3 mL的体积分数1%戊巴比妥钠麻醉，5 min后将完全麻醉小鼠一侧朝向，取侧部剃毛，体积分数75%乙醇消毒后擦干。剪刀在右侧部的皮肤取约1 cm切口，并在右侧卵巢脂肪垫上的皮肤做切口，摄子夹住脂肪垫，将输卵管和卵巢拉出腹腔。撕开输卵管和卵巢周围包裹的囊膜，暴露卵巢。在卵巢与输卵管之间用缝线结扎，剪刀剪去卵巢，用镊子把子宫角送回腹腔，再关闭腹腔。左侧卵巢的切除步骤同上。继续喂养去势小鼠17 d，待其体内雌孕激素完全代谢后进行其他研究处理。去势小鼠从术后1周开始每天进行阴道脱落细胞涂片，将同批次的正常性成熟雌鼠当做阳性对照组，并同时进行阴道脱落细胞涂片。观察两组涂片细胞的变化特点，一共观察10 d。
将60只去势小鼠分为雌激素组、孕激素组和对照组，每组各20只。雌激素组每只皮下注射100 ng雌二醇 (0.1 mL)，芝麻油0.1 mL，6 h后通过颈椎脱臼法处死10只，24 h后处死剩余10只，取其子宫待检。孕激素组每只皮下注射2 mg孕酮(0.1 mL)，芝麻油0.1 mL，6 h后通过颈椎脱臼法处死10只，24 h后处死剩余10只，取其子宫待检。对照组皮下注射芝麻油0.1 mL及0.1 mL生理盐水，不进行其他处理。
1.3 建模成功的标准
免疫组织化学染色：采用免疫组织化学染色法研究不同时间点小鼠子宫内膜巨噬细胞的数量和巨噬细胞集落刺激因子的表达强度[4]：①取材：取子宫标本固定、包埋、切片。②脱蜡：经二甲苯、无水乙醇、乙醇脱蜡处理。③冲洗：流动水冲洗10 min。④处理：使用内源性抗过氧化物酶抑制剂来处理切片，并再次清洗、甩干。⑤抗原修复：切片置入枸橼酸盐配制成的缓冲液中，反复加热一两次，冷却后用PBS洗涤。⑥孵育：依次滴加兔血清、大鼠抗小鼠F4/80抗体、室温孵育2 h，兔抗大鼠IgG和SABC试剂、室温孵育30 min，每次操作后在室温下孵育一段时间。⑦显色：使用DAB显色试剂盒，A，B，C试剂与蒸馏水混匀加至切片，室温下显色。⑧蓝化：苏木精复染，在盐酸
乙醇中分色后再用自来水冲洗，等待切片呈蓝色。⑨脱水：依次经过乙醇、无水乙醇脱水，经二甲苯透明处理。⑩封固：用中性树脂封固，将切片放入烘箱中过夜。处理后的标本切片，在显微镜镜下观察阳性巨噬细胞的数量和巨噬细胞集落刺激因子积分吸光度值。巨噬细胞和巨噬细胞集落刺激因子阳性部位呈现棕褐色或棕黄色，阳性颗粒分别位于细胞膜质和细胞浆中，和背景色对比显著[5]。
1.4 主要观察指标各组阳性巨噬细胞数量和巨噬细胞集落刺激因子积分吸光度值。
1.5 统计学分析计量资料用x(_)±s表示，采用SPSS 13.0软件进行数据处理，使用单因素方差分析对比，组间数据差异的比较采用t 检验，P < 0.05为差异具有显著性意义。
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讨论

作为胚胎及胎儿生长和发育的部位，子宫在哺乳动物繁衍中发挥重要作用。子宫内的主要白细胞亚型包括中性粒细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞^[6]。巨噬细胞来源于血液，属于单核细胞，是子宫内常驻免疫细胞的一种，参与子宫免疫调节、应答和免疫效应等环节，对机体生殖能力，特别是妊娠建立与维持有重要影响。巨噬细胞分布在子宫内膜功能层和基底层，它是围着床期与早孕期细胞因子重要来源，可以产生白细胞介素1、干扰素α、前列腺素2、CSF-1等多种细胞因子^[6]，上述因子在妊娠期作用于胚胎和其他免疫活性细胞，诱导母体接受胚胎；它还可以产生蛋白酶，如帮助胚胎生长组织重建的弹性蛋白酶和胶原酶。
巨噬细胞在功能和调节表达正常时，能够清除已凋亡的滋养细胞，降低自身前炎症因子分泌，促进抗炎症因子释放，减少死亡细胞渗漏和蓄积，有效避免针对胎儿抗原的免疫攻击，帮助构建胚胎着床的合适免疫微环境^[7]。巨噬细胞集落刺激因子是一种由二硫键连接的同源双体糖蛋白，其表达形式有3种：膜结合型、细胞外基质结合型和可溶型。人和小鼠的大部分器官都能够表达巨噬细胞集落刺激因子，不过表达量较少，只有在子宫中出现高度表达，胎盘及子宫内膜组织中都可见巨噬细胞集落刺激因子表达。成熟巨噬细胞集落刺激因子分子在靠近N端的150氨基酸在和巨噬细胞集落刺激因子受体结合过程中发挥关键作用，人与小鼠的巨噬细胞集落刺激因子分子在这个区域的结构高度保守，同源性高达80%^[8]，人巨噬细胞集落刺激因子可作用于小鼠，但是小鼠的巨噬细胞集落刺激因子具有其种属特异性。机体的多种细胞可以产生巨噬细胞集落刺激因子，如纤维细胞、骨髓基质细胞、脑星状细胞、激活的巨噬细胞、T细胞、B细胞与内皮细胞等；另外淋巴母细胞性白血病、乳腺癌、卵巢癌和肺腺癌等多种肿瘤细胞也可以产生巨噬细胞集落刺激因子。巨噬细胞集落刺激因子由c-fms原癌基因所编码，通过和c-fms结合来促进单核-吞噬细胞的存活、分化和增殖^[9]。胎盘和子宫内膜组织都有c-fms的表达，这说明巨噬细胞集落刺激因子对胎盘和子宫内膜都会产生重要影响。妊娠女性尿检巨噬细胞集落刺激因子水平显著提高，这可能和体内胎盘形成相关。巨噬细胞集落刺激因子帮助促进巨噬细胞的前体细胞成熟和增殖，对巨噬细胞及巨噬细胞前体细胞都有有趋化作用。小鼠双侧卵巢切除后，体内子宫巨噬细胞的数量减少，注射巨噬细胞集落刺激因子后数量再次增加，注射巨噬细胞集落刺激因子浓度越高，巨噬细胞数量越多，这说明巨噬细胞集落刺激因子对子宫巨噬细胞有趋化作用，并存在浓度依赖性；巨噬细胞数量和巨噬细胞集落刺激因子表达水平的变化一致^[10]。
雌、孕激素在妊娠建立、维持过程中发挥重要作用。雌激素帮助促进子宫内膜的增生增厚，提高对植入的敏感程度，这是胚胎着床启动的前提条件。孕酮由黄体细胞在非妊娠期间分泌，妊娠12周后分泌量增加，在妊娠末期达到高峰，孕酮促进子宫内膜在增生期进一步增厚，减轻母体对胎儿排斥反应程度，降低子宫肌细胞膜的兴奋性和对催产素的敏感性，为受精卵生存与着床提供适宜环境。雌、孕激素通过和其特异性受体结合成受体复合物，以活化形式结合到染色质特定部位，使基因活化，启动转录，合成新mRNA，最终合成新的蛋白质^[11]。子宫内有大量雌激素、孕激素受体，有助于雌、孕激素的起效。子宫巨噬细胞的表面可以表达雌激素受体，不过无法表达孕激素受体；目前临床上普遍认为雌、孕激素主要通过促进子宫巨噬细胞趋化因子的表达来实现对巨噬细胞的趋化。妊娠成功的重要因素包括子宫内膜达到容受状态，即在雌、孕激素调节下，子宫内膜的细胞组成、结构和基因表达等出现改变，在时间、空间上达到高度一致。体外受精-胚胎移植周期雌、孕激素水平过高，影响子宫内膜的容受性，降低妊娠率。子宫巨噬细胞在围着床期具有特异性，会影响子宫内膜容受性^[12]，巨噬细胞异常会降低子宫内膜的容受性。研究报道称小鼠在动情周期子宫都可表达巨噬细胞集落刺激因子，并在动情期达到峰值^[13]，这说明雌激素可以提高子宫巨噬细胞集落刺激因子表达；体外研究发现单一的孕激素也可以诱导子宫内膜细胞分泌出巨噬细胞集落刺激因子，而且表达量会随着孕激素增加而上升。
随着分子免疫学和生物学技术的深入，生殖免疫学研究重点已经从系统免疫状态转入生殖道，尤其是子宫局部免疫状况方面^[14]。目前雌、孕激素对子宫巨噬细胞的相关研究有多项报道，不过研究结果多数存在争议^[15-30]，其主要原因是研究对象的本底条件各异，存在不同干扰因素，如胚胎在妊娠期对巨噬细胞的影响，雌、孕激素水平和比值等；离体条件下的研究无法反映在体条件下激素对巨噬细胞的影响。实验选用性成熟的小鼠为研究对象，在双侧卵巢切除条件下进行巨噬细胞研究，尽可能地消除生殖激素对实验的干扰，实现在体状态下单一剂量的雌、孕激素对巨噬细胞影响的研究。研究显示外源性补充雌二醇和孕酮后，去势小鼠子宫内膜巨噬细胞数量显著增加，巨噬细胞集落刺激因子的表达也显著增强，这说明单一剂量雌、孕激素可以促进巨噬细胞数量增加，诱导巨噬细胞集落刺激因子的表达，并且巨噬细胞数量和巨噬细胞集落刺激因子表达的变化一致，雌、孕激素可以通过对巨噬细胞趋化因子的表达，实现对巨噬细胞的间接调控。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程