骨髓干细胞输注联合低剂量他克莫司在肾移植中诱导嵌合体的形成

doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.53.011

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨髓细胞嵌合体通过有效的免疫耐受机制，使其成为临床用于移植免疫耐受的主要候选方法。
目的：探讨大鼠肾移植及活体肾移植中骨髓干细胞移植对免疫耐受的诱导作用及机制。
方法：①大鼠肾移植：40只Wistar大鼠(雌雄各半)随机分为实验组和对照组，进行肾移植手术，术前经门静脉分别注射骨髓干细胞及生理盐水，30 d后观察肉眼和光镜下排斥反应及检测嵌合体的形成。②活体肾移植：实验组为夫妻或亲属共5对，供者均为男性，受者为女性。术前应用他克莫司口服，供者皮下注射生白细胞药物，采集白细胞悬浊液，以流式细胞仪测定CD34细胞比例，0.7%以上为骨髓干细胞含量合格，并通过外周静脉输注至受者体内，10 d后同法再输注1次，1周内行移植手术，术后复查肾功，于半年后采用荧光原位杂交的方法检测Y基因片段。对照组为正常活体肾移植手术，未行骨髓干细胞移植。
结果与结论：动物实验组大体和光镜下排斥反应均较轻微，嵌合体检测均为阳性，活体实验组嵌合体检测4例为阳性，而对照组仅1例为阳性。提示应用他克莫司并输注供者骨髓干细胞，可诱导一定的免疫耐受。移植前输注供者骨髓干细胞形成的嵌合体与免疫耐受有关。

关键词: 他克莫司, 骨髓移植, 免疫耐受, 嵌合体, 肾移植

Abstract:

BACKGROUND: The bone marrow cells are candidate approaches for inducing immunological tolerance.
OBJECTIVE: To explore effects of bone marrow cell transplantation on immunological tolerance in rat kidney transplantation.
METHODS: ①Forty Wistar rats, half males and half females, were randomly assigned into the control group (n=20) and experimental group (n=20). The female animals were injected bone marrow cell and normal salty in portal vein. After 30 days, the chimerism formation and rejection were observed by gross and under a light microscope. ②Living-related kidney transplantation comprised 5 pairs of living kidney transplantations (couples or relatives). Males served as donors and females were recipients. Tacrolimus was taken orally before operation. The donors were subcutaneous injected drugs to stimulate leukocyte growth. The leukocyte suspension liquid was collected, determined by flow cytometry and infused into recipients via peripheral vein. The procedure was repeated once after 10 days, and the transplantation was performed within 1 week. The renal function was examined after operation. Y gene fragment was determined after half years by fluorescence in situ hybridization. The control group received normal living-related kidney transplantation without bone marrow cells transplantation.
RESULTS AND CONCLUSION: The rejection was slightly in the animal experimental group, with positive chimerism. Four cases showed chimerism-positive in the living transplantation group, but only 1 chimerism-positive in the control group. It is suggested that bone marrow cell injection can induce immunological tolerance, which relates to the chimerism formation of donor bone marrow cells injection before the transplantation.

中图分类号:

R617

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参考文献

引言

嵌合体是指受体中存在供受体双方来源的细胞，主要指造血细胞。Owen等在1945年观察到，共用一个胎盘循环的异卵孪生牛双胞胎，在出生很久后体内存在两种显著不同类型的红细胞。1953年Billingham等证明，这些嵌合孪生牛对相互间的皮肤移植物产生耐受。1992年Starzl等利用原位杂交及PCR技术发现，9例接受男性肝移植并已存活10~19年的女性患者体内多种组织中可检出供者来源的白细胞，他称这种现象为微嵌合。微嵌合是自发形成的，究竟是耐受的原因还是结果还存在很大争议^[1-4] 。
随着研究和认识的不断深入，宏嵌合现象引起更大的关注，并使获得长期移植免疫耐受的前景更加光明。它是通过一定的途径(如经静脉)，以一定的形式(如骨髓细胞)将供者的造血干细胞成分植入经过预处理的受者体内，从而诱导受者免疫系统接受异基因的器官、组织或细胞移植物的状态，分为完全嵌合和混合嵌合^[5-12] 。混合嵌合对于受者的毒性损害较小，产生的免疫能力较强，且不易诱发移植物抗宿主病(graftversushostdisease, GVHD)，更适合于实体器官移植。通过动物实验和临床研究，了解器官移植后受者经干细胞输注所诱导产生的微嵌合及宏嵌合现象，进而研究干细胞输注的时间、剂量和方式对移植器官的长期存活和受者免疫功能抑制之间的相互关系，既可为减小免疫抑制剂用量，减少不良反应提出可行的小剂量免疫抑制剂安全应用范围，又可为骨髓细胞输注后器官移植受者的长期存活情况、移植器官维持正常功能的存活时间，以及免疫耐受发生的分子生物学变化、免疫状态的监测做出重要的指导。
实验大鼠采用门静脉注射骨髓细胞及应用他克莫司灌胃的方法，人采用外周血输注造血干细胞及术前服用他克莫司的方法来探讨输注骨髓造血干细胞对免疫耐受的诱导作用。

材料方法

讨论

实验已经应用于临床并取得良好效果，可以指导临床应用骨髓干细胞输注诱导器官移植患者产生免疫耐受，从而达到降低排斥反应的发生、减少免疫抑制剂的应用剂量，从而能够减轻器官移植患者及其家属的经济负担，让更多器官功能衰竭的患者，得到移植的机会。
他克莫司是临床常用且安全的免疫抑制剂，本文动物实验部分采用短期小剂量他克莫司使受体处于一定深度的免疫抑制状态后，植入常规剂量的骨髓来诱导宏嵌合，再以小剂量他克莫司做短期维持，观察移植肾存活情况，发现移植物均存活，均在4周以上，嵌合体检测实验组均为阳性，而对照组仅有两个检出阳性(P < 0.05)。临床试验部分采用术前受者应用他克莫司口服 (2 mg 2次/d)，供者造血干细胞动员后采集外周血白细胞并通过外周静脉输注至受者体内来诱导宏嵌合，观察嵌合体的形成，发现实验组与对照组差异有显著性意义(P < 0.05)。
他克莫司免疫抑制效应的理解集中在其对淋巴细胞的负性调节作用，即抑制淋巴细胞的增殖和免疫效应因子等的分泌。最近有研究表明FK506也能够影响淋巴细胞的成熟和功能，在免疫应答早期既抗原提呈过程中发挥作用^{[4, 13-20]} 。骨髓细胞嵌合体通过有效的免疫耐受机制，即供者特异反应性的免疫细胞克隆清除，诱导形成持久，稳定的供者特异免疫耐受，使他成为临床用于移植免疫耐受的主要候选方法。与单纯的免疫抑制药物相比，骨髓干细胞嵌合体诱导的供者特异性免疫耐受有两个主要优点：①有效耐受超急性排斥反应、急性排斥反应和慢性排斥反应。②仅对自身和供者抗原耐受，对其他抗原可正常免疫应答，因此不会有免疫功能低下导致继发感染和恶性肿瘤的风险^{[8-11, 21-28]} 。
本文动物实验采用经门静脉注射骨髓细胞及应用他克莫司灌胃的方法来诱导肾脏移植的免疫耐受，耐受指标为外周血细胞中检测出嵌合体(SRY基因序列)，即含供者骨髓干细胞基因片段，形成了骨髓干细胞嵌合体。
实验结果显示接受骨髓干细胞移植的大鼠外周血细胞中均能检测出SRY序列，移植肾排斥反应均较对照组轻微，而临床实验组中5例有4例检测出特异的SRY基因序列，而对照组4例中仅1例检测出特异的SRY基因序列。由此所得出的结论是，以大鼠作为动物实验模型，可实现通过骨髓移植来诱导同种异体移植免疫耐受，为同种组织器官移植排斥反应的预防提供理论依据，而临床实验组中有4例检测出嵌合体，与对照组差异有显著性意义(P < 0.05)也证明通过骨髓干细胞移植可诱导同种异体肾移植术后的免疫耐受。已有资料表明骨髓细胞嵌合体在人类能诱导受者特异性免疫耐受，一组因血液系统疾病接受同种异基因移植的患者，此后因肾衰再植入同一供者的肾脏，不用免疫抑制药物，也未发生排斥反应^{[4-5, 27-30]} ，这种耐受甚至能跨越MHC(组织相容性复合体)屏障，由此骨髓嵌合体诱导受者特异性免疫耐受，必将开辟器官移植的新天地。
实验成功建立了大鼠嵌合体的动物模型及临床骨髓干细胞输注诱导免疫耐受，通过动物实验和临床研究，了解器官移植后受者经骨髓干细胞输注所诱导产生的微嵌合及宏嵌合现象，以及骨髓干细胞输注的时间、剂量和方式对移植器官的长期存活和受者免疫功能抑制之间的相互关系，既可为减小免疫抑制剂用量，减少不良反应提出可行的小剂量免疫抑制剂安全应用范围，又可为骨髓细胞输注后器官移植受者的长期存活情况、移植器官维持正常功能的存活时间，以及免疫耐受发生的分子生物学变化、免疫状态的监测做出重要的指导。并且对特异性供者产生了一定的免疫耐受，使用了临床更常用、更安全的免疫抑制剂，以诱导嵌合和耐受，证实其安全可靠，并使移植肾的存活时间延长，为嵌合体的形成应用于诱导临床器官移植耐受作了有意义的探索。

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