异种抗原瘤内注射对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用

doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.18.021

摘要/Abstract

摘要：

背景：异种抗原的免疫原性比较强，容易引起较强的免疫应答。如果将异种抗原直接引入肿瘤内部，在肿瘤内部引发一系列免疫反应，有可能逆转肿瘤微环境的免疫抑制状态，达到抗肿瘤的目的。
目的：评价人红细胞膜抗原瘤内注射对荷S180肉瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用。
方法：复制昆明小鼠S180肉瘤皮下瘤模型，瘤内注射质量浓度为5 g/L的人红细胞膜抗原或生理盐水，连续注射5 d，记录注射前及注射第3，7，14天肿瘤体积变化。同时设肿瘤细胞与人红细胞膜抗原同时接种组、免疫后瘤内注射人红细胞膜抗原组、免疫后瘤内注射生理盐水组。另取60只小鼠复制S180肉瘤皮下瘤模型，免疫及瘤内注射人红细胞膜抗原或生理盐水同前。注射第14天每组处死6只小鼠，肿瘤称质量，行病理学分析，每组剩余小鼠继续观察生存情况。
结果与结论：各组小鼠肿瘤体积逐渐增大，第14天人红细胞膜抗原与肿瘤细胞同时接种组、免疫后人红细胞膜抗原瘤内注射组、人红细胞膜抗原瘤内注射组肿瘤体积均小于瘤内注射生理盐水组。瘤内注射人红细胞膜抗原可显著降低肿瘤质量。瘤内注射人红细胞膜抗原后镜下可见肿瘤细胞坏死、淋巴细胞等炎症细胞浸润。未观察到各组小鼠生存期有明显差别。结果表明异种红细胞膜抗原瘤内注射可以抑制小鼠S180肉瘤肿瘤生长。

关键词: 人红细胞膜, S180肉瘤, 瘤内注射, 异种抗原, 器官移植

Abstract:

BACKGROUND: Herterologous antigen has strong immunogenicity and easily induces immunological response. Introduction of herterologous antigen into tumor may induce a serial of immunological reactions in the tumor and may reverse the immunosuppression of tumor microenvironment to treat tumor.
OBJECTIVE: To evaluate the antitumor efficacy of intratumoral injection of human erythrocyte membrane antigens in mice bearing S180 sarcoma.
METHODS: Kunming mice bearing S180 sarcoma model were established and treated with 5 g/L human erythrocyte membrane antigens suspension or normal saline for five days. Tumor volume was calculated before the first injection and 3, 7, and 14 days after the first injection. In addition, the tumor cells in combination with human erythrocyte membrane antigens group, the injection of saline group (the control group), and the injection of human erythrocyte membrane antigens or saline group (pre-immunized by suspension of human erythrocyte of blood group type A). Another 60 mice bearing S180 sarcoma were established and subjected to the above pre-immunization and injection of saline or human erythrocyte membrane antigens. Six mice selected from each group were sacrificed 14 days after the first injection, and tumors were weighed, followed by histological examination. Survival of remainders in each group was observed.
RESULTS AND CONCLUSION: Tumor volumes in each group increased gradually. Tumor volumes in the human erythrocyte membrane antigens injection group, the tumor cells in combination with human erythrocyte membrane antigens group, and the human erythrocyte membrane antigens injection group (immunized) were smaller than the control group, Intratumoral injection of human erythrocyte membrane antigens significantly reduced tumor weights. Tumor necrosis, infiltration of inflammatory cells such as lymphocytes were observed in tumor tissues section examination following the intratumoral injection of human erythrocyte membrane antigens. The mouse survival time showed no statistical difference among different groups. Intratumoral injection of heterologous erythrocyte membrane antigens can inhibit tumor growth of S180 sarcoma bearing mice.

中图分类号:

R617

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参考文献

引言

材料方法

讨论

异种移植排斥反应比同种移植排斥反应更为强烈^[5-6] 。如果一个受者预先以另外供者物质进行免疫，则来至相同供者的第二个移植物的排斥反应被加速^[7-8] 。天然抗体介导的超急性排斥反应是临床开展异种移植的最大障碍。天然自身抗体是指在没有任何抗原主动免疫的情况下，正常机体内天然产生并存在的免疫球蛋白^[9] 。灵长类动物血清存在多种天然抗体^[10] ，主要针对异种动物细胞表面的糖链成分^[11] 。如灵长类动物血清中存在针对猪血管内皮细胞表面α-半乳糖成分(galactose α1-3 galactose，gal α1-3 gal)的天然抗体^[12-13] 。因此异种器官移植后可出现由天然抗体介导的、补体依赖的细胞毒效应，导致超急性排斥反应的发生。利用体内存在的天然抗体促进免疫反应进而产生抗肿瘤效应的方法已经在动物体内得到证实^[14] 。
Galili等^[15]在α1，3GT基因敲除小鼠体内进行了实验，这种小鼠与人类似，不表达α-Gal表位，但具有产生anti-Gal抗体的能力，引用B16小鼠黑色素瘤为肿瘤模型，通过瘤内直接注射具有α-Gal表位的糖脂，小鼠的肿瘤内部发生抗体与抗原结合导致补体激活的炎症反应，肿瘤出现明显坏死及缩小，大量炎症细胞浸润，树突状细胞的抗原呈递功能增强，CD8⁺CTL细胞激活并足以克服抑制性调节性T细胞的抑制作用，而且可以抑制远处转移病灶的生长。有其他研究者利用基因转染、病毒载体转导等方法使肿瘤细胞表面表达α-Gal表位，可增加肿瘤相关抗原的免疫原性达到抗肿瘤的目的。
比较人类的ABO血型抗原与α-Gal抗原的结构发现，人ABO血型多糖抗原系统与α-Gal多糖抗原相似，以B抗原最为相似^[16-17] 。既然人体内存在有抗血型的天然抗体^[18-19] ，可以考虑利用这种天然抗体进行人类肿瘤的免疫治疗。
为了初步了解这种治疗方法对恶性肿瘤的治疗作用，首先在小鼠体内进行了疗效实验，评价对肿瘤生长的抑制作用及了解肿瘤内部的反应。人的红细胞膜抗原直接瘤内注射小鼠S180肉瘤皮下瘤内部，由于人的红细胞膜抗原对于小鼠来说属于异种抗原，可以在肿瘤内部引发局部抗原抗体介导的免疫反应，同时设立A型人红细胞腹腔免疫小鼠后再应用A型人红细胞膜抗原瘤内注射组了解这种情况下与人红细胞膜抗原直接瘤内注射的疗效差异。
应用人红细胞免疫小鼠后可使小鼠体内产生诱导抗体，由于人的红细胞膜抗原相对于小鼠来所是异种抗原，且人红细胞膜抗原上存在众多抗原表位，小鼠血清内可能存在有针对人红细胞膜抗原表位的天然抗体，即使小鼠体内不存在或存在低水平的天然抗体，仍可能通过产生诱导抗体或刺激小鼠细胞免疫等方式对人红细胞膜抗原产生免疫反应。因此小鼠免疫或不免疫瘤内注射人红细胞膜抗原都可以在肿瘤内部引起炎症细胞的浸润、肿瘤细胞的坏死。通过肿瘤体积和肿瘤质量的比较及组织切片病理观察，发现免疫后再瘤内注射人红细胞膜抗原后肿瘤内部发生的免疫反应更强烈一些，平均瘤质量轻，平均肿瘤体积相对小，但差异无显著性意义。单纯应用人红细胞免疫小鼠也可轻度抑制肿瘤的生长，不同时间点测量肿瘤体积的实验中，应用人红细胞免疫小鼠第14天与对照组比较虽肿瘤体积有所减小，但差异无显著性意义，而在同样的处理情况下第14天瘤质量的比较中免疫因素也可抑制肿瘤的生长，差异有显著性意义。比较两次实验在开始治疗时的肿瘤大小是有差异的，肿瘤大小分别是1 cm左右及0.5 cm左右。根据实验结果说明在肿瘤体积较小时，免疫因素抑制肿瘤的生长是有效的，但是肿瘤相对较大时，单纯免疫是不能抑制肿瘤生长的。
通过对小鼠生存期的观察，发现治疗使肿瘤缩小的两组小鼠经过一段时间的肿瘤生长抑制后肿瘤生长又开始加速并导致小鼠的死亡。致使4组小鼠的生存期差异并无显著性意义。因此这种治疗方法包括所有的免疫治疗方法应该是持续进行才能达到最大的效果。
在动物实验及临床上各种生物反应调节剂均有一定的抑制肿瘤生长的功能^[20-21] ，这些生物反应调节剂多是一些细菌性物质，如卡介苗、链球菌制剂、红色诺卡菌制剂、金黄色葡萄菌制剂、假单胞菌制剂、短小棒状菌制剂等^[22-23] ，这些物质对于动物及人体均为异种抗原，可使机体产生非特异性的免疫反应，从而抑制肿瘤生长^[24-25] 。因此人红细胞免疫小鼠后由于人红细胞存在大量的能激活小鼠细胞及体液免疫应答的表位，使小鼠体内产生非特异性免疫反应，使肿瘤生长受到一定的抑制。但是这种情况下对肿瘤生长的抑制作用不强，特别是肿瘤较大时，效果欠佳，与临床上免疫治疗应用于术后辅助治疗效果较好^[26-27] ，而对于肿瘤负荷较大时效果不佳类似^[28-29] 。异种红细胞膜抗原免疫引起的肿瘤生长抑制的机制与瘤内注射是不同的，人红细胞膜抗原瘤内注射在肿瘤内部引起明显的肿瘤坏死及炎症细胞浸润，而单纯免疫后在肿瘤内部无此种现象。
在动物体内进行的实验最终的目的是了解是否能应用于人类的肿瘤治疗。如果直接应用异种抗原进行瘤内注射理论上反应应该更强烈，对肿瘤细胞的摧毁作用也大，但是其强度如何控制以确保不发生全身严重反应是个重要的问题。而做为同种异体的健康人的红细胞膜抗原直接瘤内注射，利用患者体内预先存在的抗血型天然抗体在肿瘤内部引发一系列反应达到抗肿瘤的目的相对更安全。同时人的补体活性比小鼠的补体活性要高很多^[30-31] ，因此在人体内抗原抗体反应产生的炎症反应比小鼠体内应该更强烈，且人的实体瘤生长一般比小鼠动物模型的肿瘤生长缓慢，相对来讲瘤内注射人红细胞膜抗原的抗肿瘤效果应该比动物模型上要好。
本实验通过瘤内注射相对于小鼠为异种抗原的人红细胞膜抗原，利用小鼠对异种抗原产生的免疫反应产生抗肿瘤效应，肿瘤缩小，初步验证了这种治疗方法的有效性，为利用异种抗原进行肿瘤免疫治疗在动物体内探索可行性。这种治疗方法的优点是不需要考虑肿瘤的病理类型，因此只要在技术上能够进行瘤内局部注射，这种治疗方法适用于各种类型实体瘤。之所以选择红细胞膜抗原做为异种抗原是因为红细胞膜抗原制备简单，含有大量蛋白质、糖类抗原。但利用异种红细胞膜抗原瘤内注射治疗恶性肿瘤的免疫治疗方法的具体实施方式如瘤内注射红细胞膜抗原的浓度、连续注射的次数、间隔时间、重复次数等需进一步探索，以寻找最佳的治疗方式。肿瘤细胞具有在局部形成有利于其发生、发展的特有免疫模式的能力，因此多疗程连续给药应该是比较理想的方法。尚需在多种不同病理类型的肿瘤中验证这种免疫治疗方法的疗效。

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