两种免疫法联合肾功能指标测定他克莫司血药浓度的比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.05.014

摘要/Abstract

摘要：

背景：不同免疫法测定的他克莫司血药浓度，对免疫抑制作用及毒性反应的预测能力是否有差异，在肾功能异常时是否能够更加敏感的反映患者血药浓度，是值得研究的问题。

目的：联合肾功能指标，分析酶联免疫吸附技术和酶增强免疫技术测定他克莫司血药浓度的相关性。

方法：收集133例应用他克莫司治疗的肾移植患者血样，分别用酶联免疫吸附技术、酶增强免疫技术测定血药浓度。分析两种方法测定的相同浓度范围内肾功能异常的发生率；分析不同浓度范围内，两种方法测定结果的相关性。

结果与结论：在肾功能异常时，比较两种方法测定的浓度，酶联免疫吸附法测定结果均值较高，且波动较大。酶联免疫吸附法测定他克莫司血药浓度5-20 μg/L范围内，肾功能异常发生率较酶增强免疫法少，分析显示两种方法测定结果总体差异无显著性意义(r=0.904 5，P > 0.05)。以酶联免疫吸附法为标准，在他克莫司血药浓度< 2.0 μg/L时，酶增强免疫法测定结果明显较高(P < 0.01)。在血药浓度为≥2.0 μg/L时，两种方法测定结果差异无显著性意义(P > 0.05)。说明酶增强免疫法与酶联免疫吸附法相关性较好，均适合于临床常规测定他克莫司的血药浓度，建议结合肾功能指标，细化区分两种测定方法的参考范围。同时，在患者血药浓度极低(< 2.0 μg/L)时，不建议采用酶增强免疫法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 组织构建, 肾移植, 器官移植, 他克莫司, 酶联免疫吸附技术, 酶增强免疫技术

Abstract:

BACKGROUND: Whether determination of tacrolimus blood concentration by different immunoassay methods can influence predictive ability to immunosuppressive effects and toxicity, and whether it can be more sensitive to reflect blood concentration in patients with renal dysfunction are worthy of studying.

OBJECTIVE: To analyze the correlation of tacrolimus (FK506) concentrations determined by enzyme-multiplied immunoassay technique (EMIT) and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) in combination with renal function parameters.

METHODS: 133 clinical blood samples were collected. EMIT and ELISA techniques were used to determine the FK506 concentration. The correlation of two determination methods were analyzed, combined with renal function.

RESULTS AND CONCLUSION: In patients with renal dysfunction, the mean results and standard deviation mensurated by ELISA were higher than those by EMIT. For blood concentration in 5-20 μg/L by ELISA, the incidence of renal dysfunction occurred less than by EMIT. The overall mean results of blood concentration for two methods appeared no significant difference (r=0.904 5, P > 0.05). When the concentration was less than

2.0 μg/L, the concentration results by EMIT were higher than those by ELISA (P < 0.01). When the concentration was more than 2.0 μg/L, there was no significant difference between two determination methods (P > 0.05). These findings indicate that EMIT and ELISA has good correlation, which are both suitable for clinical routine determination of plasma concentration. It is not recommended for applying EMIT method to determine low blood concentrations (< 2.0 μg/L). The reference range of concentration should be compartmentalized depending on combination of determination methods and renal function.

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Key words: kidney transplantation, tacrolimus, enzyme-linked immunosorbent assay

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 3

2.1 参与者数量分析 实验纳入患者133例，均接受测试，全部进入结果分析。

2.2 患者肾功能指标及他克莫司全血浓度测定结果 正常参考范围血尿素氮为2.5-8.1 mmol/L，血清肌酐为42- 133 μmol/L，胱抑素为0-1.03 mg/L。他克莫司全血浓度：5-20 μg/L。

2.3 比较肾功能正常及异常时两种方法测定的他克莫司血药浓度结果 结果显示，肾功能指标异常组的他克莫司血药浓度均较正常组高，个体差异也明显增大，酶联免疫吸附法测定结果尤为明显。相同肾功能水平，比较两种浓度测定方法，酶联免疫吸附法测定的数据个体差异均大于酶增强免疫法，且数据较酶增强免疫法高，两种方法测定结果差异不具有显著性(表1-3)。

由表1可见，结合肌酐水平，比较两种测定方法，血肌酐正常水平下，酶增强免疫法测定的患者浓度较酶联免疫法的范围更窄。酶增强免疫法测定的数据与目前临床用药安全范围(5-20 μg/L)更接近。同时，无论肌酐水平正常或异常，酶联免疫法更能体现患者药物浓度的个体差异。

由表2可见，结合尿素氮水平，比较两种测定方法，血尿素氮正常水平下，酶增强免疫法测定的患者浓度较酶联免疫法浓度范围宽，酶增强免疫法测定的浓度数据较酶联免疫法的数据高。但尿素氮异常时，酶联免疫吸附法测定的浓度数据较高。同时，酶增强免疫法测定的数据与目前临床用药安全范围(5-20 μg/L)更接近。无论尿素水平正常或异常，酶联免疫法更能体现患者药物浓度的个体差异。

由表3可见，结合胱抑素水平，比较两种测定方法，血胱抑素水平正常时，酶增强免疫法测定的患者浓度较酶联免疫法浓度范围窄，且浓度范围较血清肌酐、尿素氮正常时的范围更小。酶增强免疫法测定的浓度数据较酶联免疫法的数据低。同时，浓度数据的范围表明，酶增强免疫法测定的数据与目前临床用药安全范围(5- 20 μg/L)更接近。但是，酶联免疫法测定的数据更能体现患者药物浓度的个体差异。

2.4 比较不同他克莫司血药浓度范围内的肾功能指标异常发生率 在血药浓度<10 μg/L时酶增强免疫法肾功能异常发生比率更少，当血药浓度在10-20 μg/L酶联免疫吸附法肾功能异常情况发生率更少。

而当血药浓度> 20 μg/L时，两种方法肾功能指标异常率均大于50%(表4)。

酶增强免疫法测定结果：

他克莫司血药浓度<5 μg/L时，肾功能指标异常29例。

他克莫司血药浓度5-10 μg/L时，肾功能指标异常61例。

他克莫司血药浓度>10-20 μg/L 时，肾功能指标异常30例。

他克莫司血药浓度>20 μg/L时，肾功能指标异常13例。

酶联免疫吸附法测定结果：

他克莫司血药浓度<5 μg/L时，肾功能指标异常21例。

他克莫司血药浓度5-10 μg/L时，肾功能指标异常65例。

他克莫司血药浓度>10-20 μg/L时，肾功能指标异常34例。

他克莫司血药浓度>20 μg/L时，肾功能指标异常13例。

由表4可见，参考目前临床用药参考范围(5-20 μg/L)，当药物浓度小于5 μg/L时，酶联免疫吸附法的测定数据，在此范围内的患者肾功能异常发生率较酶增强免疫法高；而两种方法测定的数据在5-10 μg/L时，肾功能异常的发生率相当；当药物浓度数据在10-20 μg/L内，酶增强免疫法的测定数据在此范围内时相对应的肾功能水平异常发生率较高。说明两种方法测定的药物浓度在5-10 μg/L时，对用药安全性和疗效的提示作用是一致的。当他克莫司血药浓度大于10 μg/L时，两种方法测定数据对应的肾功能指标异常发生率不同，应结合临床指标，对不同方法的药物浓度参考范围进行调整。

2.5 两种方法测定他克莫司血药浓度结果相关性的比较 酶联免疫吸附法测定他克莫司全血浓度结果均值及标准偏差均较酶增强免疫法测定结果高[(10.680 9±6.895 9)，(10.082 6±5.130 8) μg/L]，且变化幅度大、个体差异大，但两种方法测定结果差异不具有显著性(P > 0.05，表5)。数据进行线性回归分析，结果具有较好的相关性，酶增强免疫(y)与酶联免疫吸附法(x)的回归方程分别为：y=0.669 4x+ 3.253 7，r=0.905 4。在设定的药物浓度范围内，比较两种测定方法，从而比较同一样本或患者更换不同测定方法后的药物浓度变化。比较不同他克莫司血药浓度范围内两种测定方法的数据相关性，在酶联免疫吸附法测定血药浓度< 2.0 μg/L时，两种方法测定结果差异有显著性意义(P < 0.01)，酶增强免疫法测定结果明显较高。在血药浓度为2.0-8.0 μg/L时，测定结果差异不具有显著性(P > 0.05)，酶增强免疫法测定结果稍高。在血药浓度>8.0 μg/L时，酶联免疫吸附法测定数据较酶增强免疫法高，且测定结果差异不具有显著性意义(P > 0.05，表5)。

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引言

他克莫司是从筑波链霉菌中发酵、纯化分离出来的大环内酯类抗生素，是一种新型免疫抑制剂^[1]。他克莫司对T细胞有选择性的抑制作用，主要是通过抑制T细胞释放白细胞介素2、白细胞介素3、γ干扰素而发挥强大的免疫抑制作用^[2]。他克莫司广泛用于预防移植后的急、慢性排斥反应，提高移植后肾存活率，其临床疗效及不良反应明显优于环孢素A^[3-4]。他克莫司具有治疗范围窄、口服吸收生物利用度及药物动力学个体差异明显等特点。因此，肾移植后需要对使用他克莫司患者的血药浓度和生化指标进行定期监测、及时调整用药，从而有效地抑制排斥反应、同时减少他克莫司对肾脏的损伤^[5]。

临床常结合肾功能指标与他克莫司的血药浓度进行用药调整，患者的肾功能异常多发生于排斥反应或药物毒性反应时，这与患者的药物浓度异常密切相关。同时，各种免疫法的专属性不同，对他克莫司及其代谢产物的结合水平不同，而他克莫司的代谢产物约有15种，其中有部分有免疫活性兼具毒性反应。因此，不同免疫法测定的血药浓度由于代谢产物结合水平不同，造成浓度的差异。不同免疫法测定的浓度，对免疫抑制作用及毒性反应的预测能力是否有差异，在肾功能异常时是否能够更加敏感的反映患者浓度情况，是值得研究的问题。

目前，常规测定血药浓度的方法主要涉及色谱法、质谱法和免疫法等。临床需要快速、敏感的测定方法，解放军沈阳军区总医院测定他克莫司的方法有酶联免疫吸附技术(ELISA)、酶增强免疫技术(EMIT)等，文章旨在结合肾功能检测指标血清肌酐、血尿素氮、胱抑素，比较不同肾功能情况下，两种方法测定的结果，分析两种方法不同血药浓度范围内患者的肾功指标异常发生率，探讨两种免疫法的浓度范围。同时，分析不同浓度范围内两种免疫测定方法的相关性。

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材料方法

设计：两种方法对比分析。

时间及地点：实验于2012年9月至2013年5月在解放军沈阳军区总医院完成。

对象：选取解放军沈阳军区总医院2012年9月至2013年5月133例次测定他克莫司血药浓度的肾移植患者血样。其中男性99例次，平均体质量(68.8±12.6)kg，年龄14-77岁，平均(44.1±15.8)岁；女性34例次，平均体质量(60.4± 10.8) kg，年龄23-74岁，平均(42.4±14.3)岁。

纳入标准：①肾移植患者。②肾移植后使用他克莫司者。③患者对治疗均知情同意。

排除标准：①肾移植后不适用该免疫抑制方案的患者。②联合用药及饮食影响药物浓度的患者。

材料：

方法：

血样采集：采集时间为患者服药后12 h，取上肢静脉血3 mL于EDTA-K2抗凝管中，当日测定患者血尿素氮、血清肌酐和胱抑素肾功能各指标。采用酶增强免疫法、酶联免疫吸附法测定患者他克莫司全血浓度。

他克莫司血药浓度测定：严格按照每种方法的试剂说明书及标准操作规范对质控品和临床样本进行前处理和测定。

酶联免疫吸附法：取0，0.3，1.0，3.0，10 μg/L以及30.0 μg/L 6个他克莫司标准浓度绘制标准曲线。同时随行低、高两个浓度的他克莫司质控样品(2.0 μg/L，16.1 μg/L)。平均回收率(102.4±7.4)%，日内及日间测定相对标准偏差(RSD)< 15%。

酶增强免疫法：分别取0，2.5，5.0，10.0，20.0以及30.0 μg/L 6个他克莫司标准浓度绘制标准曲线。同时随行低、中、高3个浓度的他克莫司质控样品(5.0 μg/L，9.8 μg/L，19.0 μg/L)。平均回收率(99.5±5.7)%，日内及日间测定相对标准偏差(RSD)<15%。

数据分析：患者肾功能主要检测血清肌酐、血尿素氮、血胱抑素3项指标，其中有1项指标异常视为肾功能异常，3项指标均正常为肾功能正常。根据肾功能指标测量结果，将患者分为肾功能正常组和肾功能异常组，肾功能异常又分为血清肌酐异常、血尿素氮异常、胱抑素异常。结合肾功能指标，比较分析两种方法对肾功能正常组和异常组他克莫司浓度测定结果。分析两种测定方法相同浓度范围内的肾功能异常的发生率。同时，将酶增强免疫法测定结果按<2.0 μg/L，2.0-8.0 μg/L，8.0-14.0 μg/L，14.0-20.0 μg/L，>20.0 μg/L进行范围划分，比较分析两种方法测定结果在不同范围内的相关性。

主要观察指标：①他克莫司血药浓度。②血清肌酐。③血尿素氮。④血胱抑素。

统计学分析：采用SPSS 17.0软件对两种方法测定他克莫司血药浓度进行线性回归分析。数据均用x(_)±s表示，组间显著性采用方差检验。

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讨论

目前，国内外测定他克莫司浓度的方法较多，如色谱法^[6-8]、质谱法^[9-10]、免疫法等^[11-13]。国内医院多采用免疫法进行常规的浓度测定。应用较多有酶联免疫吸附法、酶增强免疫分析法(EMIT)、微粒子酶联免疫分析法(MEIA)^[14-17]。其中，酶增强免疫法是中国临床常规血药浓度测定的分析方法^[18]。药物浓度的各种测定方法比较分析已屡见不鲜^[19-21]，然而，对酶联免疫吸附法和酶增强免疫法测定的比较分析较少。文章以解放军沈阳军区总医院133例次肾移植后患者为研究对象，比较两种方法的相关性。肾移植术后患者应综合考虑临床疗效及肾毒性^[22]，肾移植后患者在用药过程中常密切监测肾功能指标，结合他克莫司血药浓度进行剂量调整。比较肾功能指标异常时两种测定方法的浓度结果。

分析可知，肾功能异常组他克莫司血药浓度均值较正常组高，且异常组中个体差异均较正常组大、浓度波动幅度较大，酶联免疫吸附法测定结果尤为明显，但差异不具有显著性。原因可能是由于肾功能异常时，代谢清除率降低，血药浓度升高。同时，酶联免疫吸附法在肾功能异常时，血药浓度波动增大，或与方法之间的灵敏度不同有关。有研究表明，不同方法对代谢产物的敏感性和识别程度不同, 肾功能异常时，个体间代谢物也可能存在很大差异^[6]。

肾移植患者，目前他克莫司血药浓度常用的参考范围为5-20 μg/L。从文中表4数据可知，酶联免疫吸附法在血药浓度5-20 μg/L范围内，肾移植指标异常发生率较酶增强免疫法少，提示酶联免疫吸附法参考浓度范围在5- 20 μg/L内较合理。酶增强免疫法在浓度小于10 μg/L时，肾功能异常发生率较酶联免疫吸附法低，而在10-20 μg/L范围时，发生率较酶联免疫吸附法高，分析酶增强免疫法测定他克莫司血药浓度的参考范围应较5-20 μg/L低，才更适合临床联合肾功能指标调整用药剂量。同时，推测酶增强免疫法受内源性物质及代谢物等影响因素较小。

由两种方法测定结果可见，两种免疫法测定值总体相关性较好。但是，在他克莫司血药浓度<2.0 μg/L时，两种方法的测定结果差异有统计学意义，酶增强免疫法较酶联免疫吸附法高。分析原因，由酶增强免疫法的试剂说明书中提到，该法测定的灵敏度2.0 μg/L，因此对于少数患者浓度极低(<2.0 μg/L)时，不建议使用酶增强免疫法进行他克莫司浓度的测定。在他克莫司血药浓度>8.0 μg/L时，酶联免疫吸附法结果较高，原因可能是试剂的专属性不同，在中、高浓度范围时，更多表现出代谢产物或内源性物质的干扰。

另外，本文方法的回收率实验均用他克莫司标准品与人血配制，与患者用药后样本的处理仍有差异，两种测定方法预处理方式不同，可能造成中、高浓度范围患者全血处理后药物暴露量不同，造成灵敏性不同。

文爱东等^[23]研究，MEIA法与酶联免疫吸附法有良好的相关性，但微粒酶免疫法成本较高，却较酶联免疫吸附法省时，均适合在医院临床应用。

董新华等^[24]研究表明，在浓度< 9.489 6 μg/L的范围内酶联免疫吸附法的测定数值低于微粒酶免疫法，在 > 9.489 6 μg/L范围内，酶联免疫吸附法测定值高于微粒酶免疫法，同时，也有研究表明，当样本浓度<8.0 μg/L时，酶增强免疫测定结果均值较微粒酶免疫高，当样本浓度 > 8.0 μg/L时，酶增强免疫测定均值与微粒酶免疫相近^[25]。这两项研究与本文的研究结果基本相符。再有，酶联免疫吸附法较酶增强免疫法测定的浓度值标准偏差大，分析原因和酶联免疫吸附法操作步骤较多^[26]，易造成结果的偶然误差。

虽然酶增强免疫法与酶联免疫吸附法具有较高的灵敏性和准确性，但免疫法专属性不及液相质谱法，其都可能检测到具有免疫抑制活性的他克莫司代谢产物。国内外文献报道，液相质谱法有很高的专属性、灵敏性、准确性等优点，因此可用液相质谱法进行血药浓度的分析及药动学的研究^[27]，作为其他测定方法的参考标准^[28-29]。3种方法的相关性同时比较，有待进一步研究^[30-31]。

结论：两种方法测定结果，肾功能异常患者的他克莫司血药浓度均较正常肾功能患者高。虽然本文肾功能异常时，两种方法测定的总体均值差异没有统计学意义，但并未区分肾功能指标异常范围进行比较，有待进一步区分比较。因此，建议结合肾功能指标异常发生率，细化区分不同方法的血药浓度范围，以利于用药调整的合理、有效。酶增强免疫法与酶联免疫吸附法相关性较好，均适合于临床常规测定他克莫司的血药浓度^[32-39]，在患者他克莫司血药浓度极低(< 2.0 μg/L)时，不建议采用酶增强免疫法，在浓度> 8.0 μg/L时，酶联免疫吸附法测定的结果较酶增强免疫法高，差异不具有显著性。