1.4.7  PCR检测基质金属蛋白酶3/13 mRNA的表达水平  Trizol法提取各组软骨细胞中总RNA，Nano Drop 2000测定RNA纯度和浓度。按照反转录试剂盒说明反转录cDNA,反应体系：纯水10 μL，1×Buffer缓冲液10 μL，dNTP Mix 1 mL，上游引物50 pmol，下游引物50 pmol(序列见表1)，25 mmol/L MgSO₄ 2 μL，AMV Reverse Transcriptase   1 μL，Tfl DNA Polymerase 1 μL。95 ℃ Tag酶活化2 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火，循环40次。2^-??Ct法计算基质金属蛋白酶3和13的mRNA相对表达量。

2.1  软骨细胞甲苯胺蓝染色结果  可见细胞内有蓝紫色异染颗粒，确认细胞为软骨细胞。见图1。

2.2  各组滑膜细胞培养基炎性因子的水平  脂多糖干预24 h和富血小板血浆处理48 h后，ELISA法检测显示，脂多糖组培养基中白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α水平显著高于对照组和脂多糖+富血小板血浆组(P < 0.01)；脂多糖+富血小板血浆组培养基中白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α水平显著高于空白对照组(P < 0.05)。见图2。

2.3  各组软骨细胞中Ⅰ型和Ⅱ型胶原蛋白的表达  Western blot检测结果显示，脂多糖+富血小板血浆组软骨细胞中Ⅰ型和Ⅱ型胶原蛋白水平显著高于空白对照组和脂多糖组(P < 0.01)；脂多糖组培养基中Ⅰ型和Ⅱ型胶原蛋白水平显著低于对照组(P < 0.05)。见图3。

2.4  各组软骨细胞中基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13蛋白的表达  Western blot检测结果显示，脂多糖组基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13蛋白水平显著高于空白对照组和脂多糖+富血小板血浆组(P < 0.01)；脂多糖+富血小板血浆组软骨细胞中基质金属蛋白酶3，13蛋白表达与空白对照组差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4。

2.5  各组软骨细胞中基质金属蛋白酶3，13的mRNA表达  荧光定量PCR检测结果显示，脂多糖组软骨细胞中基质金属蛋白酶3，13 mRNA水平显著高于空白对照组和脂多糖+富血小板血浆组(P < 0.01)；脂多糖+富血小板血浆组软骨细胞中基质金属蛋白酶3，13 mRNA水平与空白对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图5。

骨性关节炎是一组涉及关节软骨和软骨下骨退变性疾病^[1]，其中膝骨关节炎是最常见的关节炎形式，也是全世界疼痛和残疾的主要原因^[2-3]。关节面软骨是一种为人体提供低摩擦关节面的特定承重组织^[4]，研究表明关节软骨细胞独特的生物力学特性取决于其细胞外基质中的胶原蛋白和蛋白聚糖2种主要的超分子成分，嵌入了不同类型网状结构胶原纤维的聚蛋白聚糖和蛋白聚糖将水吸入组织并产生渗透膨胀压力，该压力与紧张的网状结构胶原纤维收缩力平衡，从而，胶原蛋白和蛋白聚糖形成一种抵抗载荷的水和组织^[5-6]。正常关节软骨中的软骨细胞通过滑膜分泌的滑液和软骨下骨的脉管系统扩散而获取营养物质，处于无血管的细胞外基质中以静止状态存在。由于软骨的这种营养特殊性，其再生能力受到限制，生物力学、新陈代谢和生物学变化均可导致组织稳态丧失，加速关节面软骨的损伤，最终导致终末期关节炎^[7-8]。研究证实，滑膜炎分泌的炎症因子如促炎细胞因子(如白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α)通过加速关节软骨的分解代谢而成为骨性关节炎发展的主要原因^[9-10]。临床研究报告富含血小板的血浆能够有效改善骨性关节炎患者的疼痛和其他临床症状^[11]，但其具体作用机制尚未阐明。研究旨在通过大肠杆菌脂多糖刺激大鼠膝关节滑膜细胞构建滑膜炎模型，并分别用富血小板血浆处理和未处理滑膜细胞培养基干预该大鼠的软骨细胞，检测各组滑膜细胞中白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α及软骨细胞细胞基质中Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白和基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13的变化，以探究富血小板血浆治疗骨性关节炎的可能作用机制，为临床应用提供科学依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  细胞学实验观察。

1.2  时间及地点  实验于2018年11月至2019年7月在广州中医药大学附属医院骨科重点实验室完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  健康雄性SD大鼠12只，体质量 (250±25) g，10周龄。动物由南方医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(粤)2015-0001，动物在广州中医药大学附属医院实验室饲养，温度(22.0±1)℃，湿度：(55.0±1)%。实验动物有关所有操作经广州中医药大学动物伦理委员会批准。

1.3.2  实验仪器  光学显微镜(德国，卡尔•蔡司，Axio Imager M2M)，高速冷冻离心机(德国，Eppendorf，5920 R)，电泳仪，PCR扩增仪，酶标仪(美国，Thermo FC)病理切片机，石蜡包埋机，病理刀片。

1.3.3  实验试剂  白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α ELISA Kit(中国武汉，武汉华美生物工程有限公司)，Anti-Collagen I抗体 (美国，abcam), Anti-Collagen II 抗体(美国，abcam)， Anti-MMP3抗体(中国，武汉纯度生物科技有限公司)，Anti-MMP13 抗体(中国，武汉纯度生物科技有限公司)，基质金属蛋白酶3 mRNA和基质金属蛋白酶13 mRNA序列(中国，深圳欣博盛生物科技有限公司)，Ham’s F12完全培养基(中国，上海优予生物科技有限公司)，DMEM高糖培养基(美国，Gibco)。

1.4  实验方法

1.4.1  大鼠滑膜和软骨组织分离及培养  实验前大鼠适应性饲养7 d后，腹腔注射戊巴比妥钠(10 mL/kg)麻醉大鼠4只，无菌操作台解剖分离双侧膝关节，切取滑膜和软骨组织。用DMEM培养基冲洗分离的滑膜组织并称质量后，用无菌眼科剪将组织碎为1 mm×1 mm×1 mm大小，加入Ⅱ型胶原酶(10 mL/g)在37 ℃恒定水浴摇床中消化2 h。将制备好的消化物通过100 μm过滤器过滤，1 000×g离心10 min，弃上清液，冲洗细胞2次后用DMEM高糖培养基(DMEM，体积分数10%FBS，1%ITS，1%青霉素和1%链霉素)重悬。200目滤网过滤，并使用Cellometer Auto 2 000和ViaStain^TM AOPI Staining Solution测定活细胞并计数。调整细胞浓度为10×10⁹ L^-1接种于24孔板，调整细胞数目为3×10⁷ L^-1种于96孔板及细胞爬片，37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养。

将分离的软骨组织在Ham’s F12培养基漂洗、称质量后，用无菌眼科剪剪碎为1 mm×1 mm×1 mm大小，加入Ⅱ型胶原酶(0.75 g/L)在37 ℃恒温水浴摇床种消化16 h。将得到的消化物通过100 μm滤器过滤，1 000×g离心    10 min。细胞冲洗2次后再用Ham’s F12完全培养基      (1 802 mg/L D-葡萄糖，146 mg/L L-谷氨酰胺，110 mg/L丙酮酸钠，1 176 mg/L碳酸氢钠，1.2 mg/L酚红，pH值7.6-7.9)重悬。并使用Cellometer Auto 2000和ViaStain^TM AOPI Staining Solution测定活细胞并计数。调整细胞浓度为3×10⁷ L^-1种于96孔板及细胞爬片，37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养。软骨细胞鉴定，细胞传代  24 h后，取生长状态良好的细胞进行爬片，待细胞融合率达到70%以上时，取出盖玻片，PBS冲洗细胞3次，40 g/L的多聚甲醛4 ℃固定过夜。纯水漂洗3次，用1%甲苯胺蓝染色20-30 min，纯水洗去剩余染液，无水乙醇脱水处理，树胶封固，光学显微镜下观察并确认细胞为软骨细胞。

1.4.2  富血小板血浆的制备  富血小板血浆制备参照文献[12]中的方法，将其余8只大鼠按上述麻醉方法麻醉后，腹主动脉取血5 mL，装入含有柠檬酸葡萄糖的抗凝管中静置30 min，使红细胞沉降，然后将含有白细胞、血小板和血浆的红细胞上方层转移至EP管中，并以250×g离心   15 min。从每个EP管中收集白细胞沉淀上方含有血小板和血浆的上清液，再以1 500×g离心15 min，除去含有贫血血小板，分离上清液和沉淀，并将血小板沉淀重悬于1 mL血小板血浆中以产生约10倍于全血浓度的富含血小板的血浆，最后在计数板上分别滴加20 μL全血和制备的富血小板血浆等比例稀释后进行血小板计数，以证实富血小板血浆制备成功。完成后-80 ℃冷冻保存备用。

1.4.3  滑膜细胞刺激制备滑膜炎模型  滑膜炎细胞模型制备参照文献中的方法实施^[13]，将正常培养的滑膜细胞在更换培养基前使细胞融合，并用大肠杆菌脂多糖(血清型O55：B5)10 ng/L刺激细胞造成滑膜炎细胞；未刺激的空白对照孔仅进行了培养基交换。刺激24 h后，2组细胞中随机各取1孔，离心后检测培养基中炎性细胞因子水平，确定模型成功。其余各孔除去培养基，PBS洗涤细胞2次，将刺激后的细胞分为未处理组和富血小板血浆处理组，富血小板血浆处理组加入25%富血小板血浆处理^[14]。富血小板血浆处理48 h后，分别收集空白对照组、未处理组和处理组细胞培养基，以2 000×g离心15 min，并分成等分试样用于细胞因子分析和软骨细胞处理。细胞因子分析试样-80 ℃保存备检，软骨细胞处理试样用于处理软骨细胞。

1.4.4  滑膜细胞条件培养基干预软骨细胞  将细胞调整浓度为3×10⁷ L^-1，取4 mL接种到细胞培养皿中，在采用条件培养基处理软骨细胞48 h前使细胞融合，然后分别用等体积的空白对照组培养基、未处理组(脂多糖组)培养基和富血小板血浆处理组(脂多糖+富血小板血浆组)培养基处理软骨细胞48 h，收集软骨细胞，裂解后检测软骨细胞数目、Ⅰ/Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13蛋白、基质金属蛋白酶3 mRNA和基质金属蛋白酶13 mRNA的变化。

1.4.5  ELISA检测各组培养基中细胞因子的水平  取待测标本于常温下解冻30 min。各组试样中白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的水平检测时，严格按照ELISA试剂盒说明书中操作步骤实施检测。检测完成后采用Origin 16.0软件进行标准曲线拟合，绘制标准曲线并确定拟合方程，最后计算样本各指标浓度值进行统计分析。    

1.4.6  Western blot检测Ⅰ/Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶3/13蛋白表达水平  在收集到软骨细胞中加入适量蛋白酶抑制剂和RIPA裂解液，冰上裂解组织30 min，12 000 r/min 4 ℃离心15 min，取上清、分装。BCA法测定样品蛋白浓度，加入1/4蛋白体积的Buffer缓冲液混匀，100 ℃加热10 min，-20 ℃保存。每个泳道加入等量的蛋白样品进行SDS凝胶电泳，用PVDF膜转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加入相应一抗anti-Col I(1∶1 000)，anti-Col II(1∶1 000)，anti-MMP-3(1∶1 000)和anti-MMP-13(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜；TBST清洗3次，加入相应二抗(1∶5 000)室温孵育1 h，ECL化学发光试剂盒显影。使用Amersham Imager 600采集图像，Image Lab V 5.10软件分析，以样品蛋白与GAPDH灰度值比为样品待测蛋白相对表达量。

1.4.7  PCR检测基质金属蛋白酶3/13 mRNA的表达水平  Trizol法提取各组软骨细胞中总RNA，Nano Drop 2000测定RNA纯度和浓度。按照反转录试剂盒说明反转录cDNA,反应体系：纯水10 μL，1×Buffer缓冲液10 μL，dNTP Mix 1 mL，上游引物50 pmol，下游引物50 pmol(序列见表1)，25 mmol/L MgSO₄ 2 μL，AMV Reverse Transcriptase   1 μL，Tfl DNA Polymerase 1 μL。95 ℃ Tag酶活化2 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火，循环40次。2^-∆∆Ct法计算基质金属蛋白酶3和13的mRNA相对表达量。

1.5  主要观察指标  ①滑膜细胞培养基中炎性因子白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的水平；②软骨细胞中Ⅰ/Ⅱ型胶原蛋白的水平；③软骨细胞中基质金属蛋白酶3，13的蛋白及mRNA表达水平。

1.6  统计学分析  应用IBM公司SPSS 24.0软件进行统计分析，所有数据用x(_)±s表示。采用levene法进行方差齐性检验，方差齐时，不同组间各指标比较采用单因素方差分析；方差不齐时，进行变量变换或采用Kruskal-Wills H 检验。组间比较采用SNK-q 法，方差不齐时，采用Welch法进行近似方差分析，组间比较采用Dunnett’s T3和Dunnett’s C法比较；P < 0.05表示差异有显著性意义(α= 0.05)。

骨性关节炎是最常见的关节炎，也是老年人群致残的重要原因，因此，骨性关节炎对个体患者和公共健康造成重大影响^[13]。流行病学研究显示，骨性关节炎患者全球超过2.5亿人，近2%的国民生产总值用于治疗骨性关节炎^[14-15]。随着人口不断老龄化，预计膝骨关节炎患者将迅速增加，至2030年膝骨关节炎患者手术数量将增加6倍^[16]。但骨性关节炎的发病机制仍未完全阐明，最近的观点认为骨关节炎是整个器官的疾病涉及多种关节组织，关节软骨退化、滑膜炎症和软骨下骨的改变是膝关节骨关节炎的主要特征^[17]。实验研究表明，软骨损伤是软骨下骨损伤的影响因素之一，但软骨下骨损伤先于软骨^[18]。此外，研究证实，骨性关节炎患者的滑膜呈现慢性炎症状态，这种变化甚至先于放射学软骨的变化而存在，患有滑膜炎的患者后期发生软骨损失的风险更高^[19-20]。研究还证实，滑膜炎的发生导致炎性细胞因子交替，可能是加重软骨病变病促进骨赘形成的主要原因^[21]。临床抗炎药物治疗骨性关节炎的有效性进一步证实滑膜炎与骨性关节炎之间存在联系。近年来，临床报告显示，富血小板血浆注射治疗膝骨关节炎有较好的临床疗效^[22]。有研究显示，富血小板血浆可抑制炎症并刺激软骨再生而使膝骨关节炎患者免于关节置换^[11]，但其机制仍未明确。此次研究旨在通过脂多糖刺激大鼠滑膜细胞构建滑膜炎模型，通过滑膜炎型环境干预软骨细胞，检测该过程中炎性因子白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α及软骨细胞细胞基质中Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白和基质金属蛋白酶3，13的变化，探究富血小板血浆治疗膝骨关节炎的可能机制，为临床用于奠定理论基础。

白细胞介素1β是一种组要的促炎细胞因子，参与引发炎症，导致疼痛并介导自身免疫^[23]。同时研究证实，白细胞介素1β是骨关节炎滑膜产生的最相关的促炎因子^[24]。促炎因子白细胞介素1β能够抑制软骨细胞中聚糖蛋白和胶原的表达，促进炎症反应和滑膜成纤维细胞增殖^[25-26]。白细胞介素6是参与多个病理过程的多效性促炎因子，临床研究表明，在骨性关节炎的早期阶段，在关节滑液、滑膜及周围组织中均可检测到高水平的白细胞介素6^[27-28]。研究证实，滑膜中细胞白细胞介素6增加诱导基质金属蛋白酶1，13表达增加，从而导致软骨的损伤^[29]。研究表明，除白细胞介素1β和白细胞介素6外，另一种促炎因子肿瘤坏死因子α也广泛涉及增殖性滑膜炎和软骨的在吸收过程^[30]。实验结果表明，脂多糖刺激后滑膜细胞培养基中白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α浓度增加，富血小板血浆处理24 h组白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α和白细胞介素6浓度降低，各组间比较差异有统计学意义(P < 0.05)；上述结表明，富血小板血浆处理能够降低滑膜细胞中促炎因子白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的水平。

关节软骨由2%的软骨细胞和丰富的细胞外基质构成，细胞外基质主要成分为水、胶原蛋白和细胞成分，分别占70%、20%及10%^[31]。Ⅱ型胶原是软骨细胞基质中的主要胶原类型，但也包含其他类型的胶原，如Ⅰ，Ⅵ，Ⅸ，Ⅹ等^[32]。研究证实，胶原的合成障碍导致最新形成的纤维网络的机械强度降低，从而影响软骨的强度^[33]。实验结果显示，富血小板血浆组Ⅰ/Ⅱ型胶原表达水平显著高于未处理组和空白对照组(P < 0.05)；空白对照组Ⅰ/Ⅱ型胶原表达水平高于未处理组(P < 0.05)，MAYER等^[31]研究表明，白细胞介素1β和白细胞介素6等炎性因子可通过刺激miR-29b的表达而抑制胶原蛋白的合成，这与此次实验结果相一致。上述结果表明，富血小板血浆处理能够促进Ⅰ/Ⅱ型胶原蛋白的表达，有助于关节软骨的分化。

基质金属蛋白酶被认为在胚胎发育，形态发生和组织重塑过程细胞外基质退化中发挥重要作用^[34]。基质金属蛋白酶也称为“胶原酶”，是一类靶向Ⅱ型胶原的降解酶，Ⅱ型胶原是关节软骨细胞外基质的主要结构成分，其中基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13在骨性关节炎中起关键作用^[35]。AMĂLINEI等^[36]研究证实，在Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型胶原中，基质金属蛋白酶13对Ⅱ型胶原降解最有效。实验结果显示，富血小板血浆处理组基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13表达水平显著低于未处理组(P < 0.05)；富血小板血浆组基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13表达水平与空白对照组见无明显差异；空白对照组基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13表达水平显著低于未处理组(P < 0.05)。研究表明，肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和白细胞介素6等可诱导基质金属蛋白酶高表达和细胞外基质(胶原蛋白和聚集蛋白聚糖)的降解^[36]，这与作者上述结果一致。上述表明，富血小板血浆处理能够降低关节软骨细胞中基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13的表达水平，从而抑制软骨细胞细胞外基质的降解。

结论：综上所述，富血小板血浆能够降低滑膜细胞中促炎因子白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的水平，降低软骨细胞中基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13的表达水平，从而增加软骨细胞细胞外基质中Ⅰ/Ⅱ型胶原蛋白的表达水平，促进软骨细胞的分化。富血小板血浆通过抑制滑膜炎症而发挥关节软骨的保护作用。

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文题释义：

富血小板血浆：是自体生长因子的来源，通过自体全血梯度离心得到。富血小板血浆于1993年Hood等首先提出这一概念，并发现富血小板血浆中含有正常血浆3倍以上的血小板和丰富的生长因子，如血小板衍生生长因子、胰岛素样生长因子、表皮生长因子和血管内皮生长因子等。

基质金属蛋白酶：是一类分解细胞外基质组分的锌蛋白酶。它们在有机体生长发育中的细胞外基质逆转与重塑以及疾病中的病理损害起着极为重要的作用。基质金属蛋白酶的表达和活性在不同细胞水平受到严密调控，如细胞因子、生长因子以及激素的调节，基质金属蛋白酶以酶原形式分泌，随后被其他蛋白酶如胞浆素或非蛋白酶类化学物质如有机汞所激活。

临床报告显示，富血小板血浆注射治疗膝骨关节炎有较好的临床疗效。有研究显示，富血小板血浆可抑制炎症并刺激软骨再生而使膝骨关节炎患者免于关节置换。但其机制仍未明确。此次研究旨在通过脂多糖刺激大鼠滑膜细胞构建滑膜炎模型，通过滑膜炎型环境干预软骨细胞，检测该过程中炎性因子白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α及软骨细胞细胞基质中I、II型胶原蛋白和基质金属蛋白酶3，13的变化，探究富血小板血浆治疗膝骨关节炎的可能机制，为临床用于奠定理论基础。

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