牛膝甾酮干预SD乳鼠成骨细胞的增殖与分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2645

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (23): 3636-3642.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2645

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牛膝甾酮干预SD乳鼠成骨细胞的增殖与分化

姜涛^1，2，3，邵敏³，陈庆真^1，3，凌翠敏⁴，申震^1，2，王刚^1，2，霍少川⁵，林燕平^1，2，3，刘海全³，汪钦生³，曾振明³

¹广州中医药大学，广东省广州市 510405；²广州中医药大学岭南医学研究中心骨伤科实验室，广东省广州市 510405；³广州中医药大学第三附属医院，广东省广州市 510240；⁴广东省第二中医院，广东省广州市 510095；⁵南方医科大学，广东省广州市 510515

收稿日期:2019-08-08 修回日期:2019-08-10 接受日期:2019-09-19 出版日期:2020-08-18 发布日期:2020-04-25
通讯作者: 陈庆真，博士，副主任医师，广州中医药大学，广东省广州市 510405；广州中医药大学第三附属医院，广东省广州市 510240
作者简介:姜涛，男，1989年生，湖南省长沙市人，汉族，博士，医师，主要从事骨质疏松与骨关节疾病方面的研究。
基金资助:
广州市科技计划项目(201707010463)；国家自然科学基金面上项目(81373654)；广东省自然科学基金项目(2015A030313351)；广东省科技计划项目(2014A020221052)；广东省中医药局项目(20164010)

Inokosterone effects on proliferation and differentiation of osteoblasts from neonatal Sprague-Dawley rats

Jiang Tao^{1, 2, 3}, Shao Min³, Chen Qingzhen^{1, 3}, Ling Cuimin⁴, Shen Zhen^{1, 2}, Wang Gang^{1, 2}, Huo Shaochuan⁵, Lin Yanping^{1, 2, 3}, Liu Haiquan³, Wang Qinsheng³, Zeng Zhenming³

¹Guangzhou University of Chinese Medicine; ²Laboratory of Orthopedics and Traumatology of Lingnan Medical Research Center, Guangzhou University of Chinese Medicine; ³The Third Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine; ⁴Guangdong Second Traditional Chinese Medicine Hospital; ⁵Southern Medical University

Received:2019-08-08 Revised:2019-08-10 Accepted:2019-09-19 Online:2020-08-18 Published:2020-04-25
Contact: Chen Qingzhen, MD, Associate chief physician, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; The Third Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510240, Guangdong Province, China
About author:Jiang Tao, MD, Physician, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
Supported by:
Science and Technology Planning Project of Guangzhou City of China, No. 201707010463; National Natural Science Foundation of China, No. 81373654; Natural Science Foundation of Guangdong Province of China, No. 2015A030313351; Science and Technology Planning Project of Guangdong Province of China, No. 2014A020221052; Project of Administration of Traditional Chinese Medicine of Guangdong Province of China, No. 20164010

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

牛膝甾酮：牛膝为苋科植物牛膝的干燥根，主要含有甾酮类、皂苷类及多糖类成分，具有调节糖代谢、抗炎、镇痛、降血糖、免疫调节等作用，牛膝甾酮是其活性成分之一，目前尚无文献报道其对成骨细胞的生物学效应。

成骨细胞：由间充质干细胞分化而来，直接参与骨形成，其增殖、分化缺陷是骨质疏松症发病的重要原因，研究表明改善成骨细胞功能可有效治疗骨质疏松症。

背景：促进成骨细胞的增殖以及分化是治疗骨质疏松症的有效手段之一，但关于牛膝甾酮对成骨细胞增殖、分化的影响却没有报道。

目的：研究牛膝甾酮对SD乳鼠成骨细胞增殖、分化的影响及其潜在的分子机制。

方法：通过酶消化法获得SD乳鼠成骨细胞，体外诱导培养并鉴定；采用CCK8法检测不同质量浓度牛膝甾酮(1，5，10 mg/L)对成骨细胞活力的影响；采用碱性磷酸酶染色及碱性磷酸酶活性试剂盒评价成骨细胞的早期分化能力；采用茜素红染色观察钙结节的形成数量，评估成骨细胞的矿化能力；采用实时荧光定量PCR法检测成骨分化标志物的表达水平；采用MDC染色检测自噬小体数量。

结果与结论：①相对于不加药对照组，牛膝甾酮在一定程度上抑制成骨细胞的增殖(P < 0.05)，但却能够显著促进碱性磷酸酶活性及矿化结节的形成(P < 0.05)，同时上调成骨分化标志物CollagenⅠ、OPG、OPN、OCN的表达水平，此外牛膝甾酮还能够促进自噬小体的形成；②结果提示，牛膝甾酮能够通过上调成骨分化相关基因及刺激自噬体的形成而促进成骨细胞的分化。

ORCID: 0000-0002-2837-6347(姜涛)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 牛膝甾酮, SD乳鼠, 成骨细胞, 成骨分化, 自噬, 骨质疏松

Abstract:

BACKGROUND: It is an effective strategy for the treatment of osteoporosis to promote the proliferation and differentiation of osteoblasts, but the influence of inokosterone on osteoblast proliferation and differentiation is rarely reported.

OBJECTIVE: To investigate the effects of inokosterone on the proliferation and differentiation of primary osteoblasts and the underlying molecular mechanism.

METHODS: Primary osteoblasts from neonatal Sprague-Dawley rats were isolated via the second enzyme digestion, and the cells were then cultured in osteogenic induction medium and identified. Cell counting kit 8 assay was performed to evaluate the effect of different concentrations of inokosterone (1, 5, 10 mg/L) on cell viability of primary osteoblasts. Early differentiation ability of osteoblasts was evaluated by alkaline phosphatase staining and alkaline phosphatase activity assay. To evaluate the mineralization ability of osteoblasts, alizarin red staining was performed to observe the number of calcium nodules. The expression level of osteogenic genes was detected by RT-qPCR at different time points. Furthermore, MDC staining was also used to observe the number of autophagosomes.

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, inokosterone could inhibit the cell viability of primary osteoblast to some degree (P < 0.05) while significantly promoting alkaline phosphatase activity and mineralized nodules formation (P < 0.05). In addition, inokosterone upregulated the expression of osteogenic genes such as Collagen I, osteoprotegerin, osteopontin, osteocalcin and increased the number of autophagosomes. To conclude, inokosterone can promote osteogenic differentiation by upregulating osteogenic genes expression and activating autophagy of primary osteoblasts.

Key words: inokosterone, neonatal Sprague-Dawley rats, osteoblasts, osteogenic differentiation, autophagy, osteoporosis

中图分类号:

姜涛, 邵敏, 陈庆真, 凌翠敏, 申震, 王刚, 霍少川, 林燕平, 刘海全, 汪钦生, 曾振明. 牛膝甾酮干预SD乳鼠成骨细胞的增殖与分化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(23): 3636-3642.

Jiang Tao, Shao Min, Chen Qingzhen, Ling Cuimin, Shen Zhen, Wang Gang, Huo Shaochuan, Lin Yanping, Liu Haiquan, Wang Qinsheng, Zeng Zhenming. Inokosterone effects on proliferation and differentiation of osteoblasts from neonatal Sprague-Dawley rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(23): 3636-3642.

图/表（结果） 7

2.1 SD乳鼠成骨细胞的鉴定细胞培养48 h-7 d，经倒置相差显微镜观察发现细胞呈三角形、长梭形、多角形等等，细胞间借突起而彼此相连；成骨诱导7 d和21 d后分别行碱性磷酸酶染色和茜素红染色，显微镜下发现明显的蓝色碱性磷酸酶活性部位及深染的暗红色矿化结节，鉴定为成骨细胞，见图2。

2.2 牛膝甾酮对成骨细胞活力的影响经牛膝甾酮干预24 h后，各组细胞活力未见明显差异(P > 0.05)；经牛膝甾酮干预48 h后，相对于阴性对照组，1 mg/L牛膝甾酮组细胞活力未见明显变化，而5，10 mg/L牛膝甾酮组细胞活力明显降低，其中10 mg/L牛膝甾酮组活力降低更明显(P < 0.05)，随着时间的增加，牛膝甾酮在一定程度上能够抑制成骨细胞的活力，见图3。

2.3 牛膝甾酮对成骨细胞碱性磷酸酶染色的影响不同质量浓度的牛膝甾酮处理成骨细胞7 d后进行碱性磷酸酶染色，各组碱性磷酸酶染色逐渐加深，呈剂量依赖的方式，说明牛膝甾酮能够提高成骨细胞的碱性磷酸酶活性进而促进成骨分化，见图4。

2.4 牛膝甾酮对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响干预7，14 d后，与0 mg/L牛膝甾酮组比较，1 mg/L牛膝甾酮对碱性磷酸酶活性没有明显的影响(P > 0.05)，而5，10 mg/L牛膝甾酮能够显著增加成骨细胞的碱性磷酸酶活性(P < 0.05)，见图5。

2.5 牛膝甾酮对成骨细胞钙化结节形成的影响不同质量浓度牛膝甾酮处理成骨细胞21 d后进行茜素红染色，各组钙结节数量明显增多且呈递增趋势，说明牛膝甾酮以剂量依赖的方式促进成骨细胞钙结节的形成，增强骨基质的矿化，见图6。

2.6 牛膝甾酮对成骨细胞自噬体形成的影响自噬体能够被MDC染成绿色荧光的亮点，当牛膝甾酮质量浓度为 5 mg/L以上时，细胞内可见荧光强度明显增强的自噬小体，见图7。

2.7 牛膝甾酮对成骨分化标志物的影响不同质量浓度牛膝甾酮干预成骨细胞后，通过RT-qPCR检测成骨分化标志物的表达水平。干预24 h后，与0 mg/L牛膝甾酮组比较，5 mg/L牛膝甾酮能够显著提高OCN mRNA的表达水平 (P < 0.05)，10 mg/L牛膝甾酮能显著提高OPN、OCN、OPG、Collagen Ⅰ mRNA的表达水平(P < 0.05)。干预 48 h后，与0 mg/L牛膝甾酮组比较，1 mg/L牛膝甾酮能显著增加OPN、OCN、OPG mRNA的表达(P < 0.05)；5 mg/L以及10 mg/L牛膝甾酮可明显上调OPN、OCN、OPG、Collagen Ⅰ mRNA的表达水平(P < 0.05)，见图8。

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引言

骨质疏松症是一种以骨量减少、骨组织显微结构发生退行性变，导致骨脆性增加以及易于发生骨折的全身性、代谢性骨病^[1-2]，脆性骨折是骨质疏松症严重的并发症^[3]，导致患者生活质量下降甚至死亡等，相关医疗和护理需要投入大量的人力、物力和财力，这将是社会及个人沉重的经济负担^[4-5]。目前，一线抗骨质疏松药物在收获临床疗效的同时依然存在着局限性，如双膦酸盐导致的消化道溃疡、下颌骨坏死、非典型股骨骨折，高剂量特立帕肽在实验小鼠中诱发的骨肉瘤事件以及降钙素过敏事件等，亟需开发更加安全、高效的抗骨质疏松药物。

课题组前期研究通过六味地黄丸以及金匮肾气丸干预成骨细胞^[6-7]，在促进成骨细胞生物学效应以及提高去势SD大鼠骨密度方面，金匮肾气丸优于六味地黄丸；通过成分分析，金匮肾气丸比六味地黄丸多了牛膝、车前子、附子3味药物，其中牛膝为补肝肾、强筋骨之要药，因此课题组推测牛膝是导致该差异的主要原因之一。通过高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)从牛膝中提取出活性成分“蜕皮甾酮(ecdysterone，ES)”和“牛膝甾酮(inokosterone，IS)”，课题组已对蜕皮甾酮的成骨效能进行了考察，通过细胞实验发现蜕皮甾酮能够显著促进成骨细胞的增殖以及成骨分化^[6]，而尚未开展牛膝甾酮相关的基础研究，且目前尚无牛膝甾酮对成骨细胞生物学效应的文献报道，因此，课题组拟通过不同质量浓度(1，5，10 mg/L)牛膝甾酮干预SD乳鼠成骨细胞，考察其对成骨细胞增殖、分化的影响及其潜在的分子机制，以期为抗骨质疏松症新药研发提供新的思路和实验参考依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学对比观察实验。

1.2 时间及地点实验于2019年3至7月在广州中医药大学岭南医学研究中心骨伤科重点实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物新生24 h的SPF级雌性SD乳鼠10只，由广州中医药大学实验动物中心提供，实验动物质量合格证号：NO.44005800009602，实验动物许可证号：SCXK (粤) 2018-0034，实验单位使用许可证编号：SYXK(粤)2018- 0001。

1.3.2 实验仪器细胞超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；移液器(Eppendorf，德国)；倒置相差显微镜(Leica，德国)；细胞培养箱(Thermo Fisher，美国)；冷冻离心机(Eppendorf，德国)；全自动酶标仪(Thermo Fisher，美国)；实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems Inc，美国)；多功能激光扫描成像系统(Amersham，英国)。

1.3.3 实验药物牛膝甾酮购于南京森贝伽生物科技有限公司，货号：15130-85-5，分子式为C₂₇H₄₄O₇，相对分子质量为480.63，可溶于α-MEM，纯度≥98%，5 mg/支，牛膝甾酮结构见图1。

1.3.4 实验试剂 α-MEM培养基(Hyclone，美国)；南美血清(Gibco，美国)；青链霉素(Gibco，美国)；0.25%胰蛋白酶(Gibco，美国)；PBS(Gibco，美国)；β-甘油磷酸钠(Sigma，美国)；抗坏血酸(Sigma，美国)；地塞米松(Sigma，美国)；碱性磷酸酶活性试剂盒以及碱性磷酸酶染色试剂盒(雷根，北京)；茜素红粉剂(Aladdin，上海)；CCK8试剂盒(索莱宝，北京)；MDC染色试剂盒(雷根，北京)；细胞RNA快速提取试剂盒(Takara，日本)；两步法荧光定量反转录PCR试剂盒(Takara，日本)。

1.4 方法

1.4.1 SD乳鼠成骨细胞的分离、培养以及鉴定 ①将新生SD乳鼠引颈处死，置于体积分数为75%乙醇中浸泡两三秒；②用剪刀、镊子分离颅骨，需尽量剔除附着的血管以及结缔组织，置于含PBS的培养皿中清洗干净；③用手术剪将颅骨剪成1 mm³大小的小块；④根据组织块的量加入5-10倍的0.25%胰蛋白酶，37 ℃水浴消化20-40 min，每隔5 min震荡1次使得细胞分离，待组织变得稀松，颜色略微发白时离心(1 000 r/min)10 min，舍弃上清液；⑤加入8倍于组织量的0.02%胶原酶，37 ℃水浴消化20 min，每隔5 min震荡1次使得细胞分离，弃去前2次的消化液；⑥取最后2次消化液加入3-5 mL α-MEM培养基，以终止消化；⑦1 000 r/min离心10 min，弃上清液；⑧加入PBS 5 mL冲散细胞，将细胞悬液通过120目不锈钢筛网后再离心1次，弃上清液；⑨重悬细胞，调整浓度为5×10⁸ L^-1左右，转移到25 cm²培养瓶中于37 ℃，体积分数为5%CO₂环境中培养；⑩取第3代细胞，以每孔10⁴个的密度接种于24孔培养板，500 μL/孔，培养24 h后加成骨诱导培养基(10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μmol/L抗坏血酸、10^-8 mol/L地塞米松)诱导，每2 d换液1次，培养7，21 d采用碱性磷酸酶染色和茜素红染色进行鉴定。

1.4.2 CCK8实验消化第3代细胞以3 000/孔的密度接种于96孔板，细胞分5组：空白对照组(调零组)、阴性对照组(不加药组)以及1，5，10 mg/L牛膝甾酮组，每组设置6个复孔；接种24 h待细胞贴壁后，弃去旧培养基，加入含药培养基，干预24，48 h，弃去旧培养基，加入100 μL混匀好的CCK8溶液(事先将CCK8溶液与培养基按照1∶9的比例混匀)；将96孔板在培养箱内避光孵育2 h，用酶标仪在450 nm处测定吸光度值(A)。细胞活力(%)=[A(牛膝甾酮组)-A(空白对照)]/[A(阴性对照组)-A(空白对照组)]×100%。

1.4.3 碱性磷酸酶染色消化第4代细胞，以3×10⁴/孔的密度接种于24孔板，细胞分4组：0，1，5，10 mg/L牛膝甾酮组，每组4个复孔，在培养箱中培养24 h；待细胞贴壁后，弃去孔内旧培养基，加入含药或不含药的新鲜成骨诱导培养基，每2 d换液1次；培养7 d后弃去培养液，PBS清洗3遍，每次5 min，40 g/L多聚甲醛固定30 min，弃去多聚甲醛，PBS清洗3遍，每孔加入300 μL(覆盖细胞)配制好的碱性磷酸酶孵育液，放入培养箱中培养20 min，PBS清洗3遍；加入核固红染色液复染3 min，PBS清洗3遍，扫描并显微镜拍照。

1.4.4 碱性磷酸酶活性检测消化第4代细胞，以5×10⁴/孔的密度接种于24孔板，细胞分4组：0，1，5，10 mg/L牛膝甾酮组，每组4个复孔，在培养箱中培养24 h；待细胞贴壁后，弃去孔内旧培养基，加入含药或不含药的新鲜成骨诱导培养基，每2 d换液1次；培养7，14 d后弃去培养液，使用裂解液裂解细胞后按照碱性磷酸酶活性试剂盒的说明进行操作。

1.4.5 茜素红染色消化第4代细胞，以1×10⁴/孔的密度接种于24孔板，细胞分4组：0，1，5，10 mg/L牛膝甾酮组，每组4个复孔，在培养箱中培养24 h；待细胞贴壁后，弃去孔内旧培养基，加入含药或者不含药的新鲜成骨诱导培养基，每2 d换液1次；培养21 d后弃去培养液，PBS清洗3遍，每次5 min，40 g/L多聚甲醛固定30 min，弃去多聚甲醛，PBS清洗3遍，每孔加入300 μL(覆盖细胞)茜素红染色液，室温下染色10 min，PBS清洗3遍；扫描并显微镜拍照。

1.4.6 MDC染色消化第4代细胞，以3 000/孔的密度接种于96孔板，细胞分4组：0，1，5，10 mg/L牛膝甾酮组，每组6个复孔，在培养箱中培养24 h；待细胞贴壁后，弃去孔内旧培养基，加入含药或不含药的新鲜成骨诱导培养基，培养48 h；按照MDC Stain(×500)∶Stain buffer=1∶499的比例配制成MDC染色工作液，吸出96孔板中的培养液，加入100 μL MDC染色工作液，37 ℃，体积分数数为5%CO₂避光孵育60 min，弃去工作液，加入Wash buffer清洗3遍，荧光显微镜下观察(激发滤光片波长355 nm，阻断滤光片波长512 nm)。

1.4.7 RT-qPCR 消化第4代细胞，以5×10⁴/孔的密度接种于12孔板，细胞分4组：0，1，5，10 mg/L牛膝甾酮组，每组3个复孔，在培养箱中培养24 h；待细胞贴壁后，弃去孔内旧培养基，加入含药或不含药的新鲜成骨诱导培养基；培养24，48 h后弃去培养液，用RNA提取试剂盒提取总RNA，紫外分光光度计测定RNA纯度，每组取 1.0 μg总RNA，分别加入反转录试剂盒的反应体系，在反转录仪中进行反转录生成cDNA后，采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)测定OCN、OPN、OPG、Collagen Ⅰ的表达，采用2^-^∆∆Ct法并以GAPDH为内参计算上述指标的相对表达量，引物序列见表1。

1.5 主要观察指标 ①成骨细胞活力；②成骨细胞碱性磷酸酶活性；③茜素红染色结果；④MDC染色自噬体数量；⑤成骨分化相关基因表达。

1.6 统计学分析采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。所有数据均呈正态分布，方差齐，组间均数的比较采用成组样本的单因素方差分析法，LSD法检验对组间样本均数进行两两比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨质疏松已经成为世界范围内的一个严重问题，在疾病的发展过程中，骨的强度下降、脆性增加，导致骨折的风险显著增加^[8]，成骨细胞、破骨细胞的数量及寿命的改变将导致骨形成与骨吸收间的不平衡，最终导致骨质疏松症^[9]。成骨细胞是调控骨形成的功能细胞，负责骨基质的分泌、合成与矿化，其功能受到抑制是骨质疏松症的主要发病机制之一，研究表明改善成骨细胞功能可有效治疗骨质疏松症^[10]。

近年来，成骨细胞相关基础研究日益增多^[11]，提高成骨细胞的功能及寿命是治疗骨质疏松症的有效手段之一。牛膝是补益肝肾、强筋壮骨的传统中药，其含有三萜皂苷、蜕皮甾酮、牛膝甾酮等甾体类成分和多糖成分等，牛膝多糖能发挥促进骨形成和抑制骨吸收的双向作用抑制骨质疏松^[12-14]；同时，课题组前期研究提示牛膝是金匮肾气丸和六味地黄丸成骨效能差异的关键因素之一^[6-7]，通过高效液相色谱法从牛膝中分离出2种活性成分：蜕皮甾酮和牛膝甾酮，通过细胞实验发现蜕皮甾酮能够显著促进成骨细胞的增殖以及分化，同时上调ERα、β-catenin而下调p-AMPKα，推测蜕皮甾酮通过ERα介导的β-catenin激活与p-AMPKα抑制进而正向调控成骨细胞的生物学功能；然而，另一活性成分牛膝甾酮对成骨细胞有怎样的生物学效应，目前尚无文献报道。在该研究中，课题组初步探讨了牛膝甾酮对SD乳鼠成骨细胞增殖以及分化的影响，以期为抗骨质疏松新药的开发提供新的思路。

根据预实验结果，牛膝甾酮的质量浓度拟定为1，5，10 mg/L，CCK8结果提示随着干预时间的延长尤其是在 48 h后，5，10 mg/L牛膝甾酮在一定程度上能够抑制成骨细胞的活力，以10 mg/L的抑制效应更为明显，提示该质量浓度下的牛膝甾酮存在一定的细胞毒性；成骨细胞胞浆膜上分泌的碱性磷酸酶是促进骨基质矿化的重要磷酸酶，能够增加局部钙、磷的浓度，有助于骨基质的钙化，是成骨细胞早期分化的指标，其活性与成骨分化呈正相关^[15]，有趣的是，尽管牛膝甾酮呈现出一定程度的细胞毒性，但碱性磷酸酶染色以及碱性磷酸酶活性测定结果却提示牛膝甾酮呈剂量依赖方式提高成骨细胞碱性磷酸酶活性，以5，10 mg/L的促进效应最为明显；钙盐沉积形成矿化结节，是成骨细胞中晚期分化的主要指标之一，成骨诱导21 d后，同样的趋势亦可见于茜素红染色，与0 mg/L牛膝甾酮组比较，牛膝甾酮以剂量依赖的方式(尤其在5，10 mg/L)促进矿化结节的形成，这些结果提示牛膝甾酮能够显著促进SD乳鼠成骨细胞的分化。为进一步探索其潜在的分子机制，采用RT-qPCR检测成骨分化标志物的表达水平，成骨细胞在增殖、分化过程中会分泌Collagen Ⅰ以及OPN、OPG、OCN等非胶原蛋白，Collagen Ⅰ是骨组织的主要有机组成成分，约占有机成分的90%^[16]；OPN在膜内化骨、软骨内化骨区域内含量丰富，对骨基质的矿化有重要作用；OPG是调节破骨细胞功能和活性的关键性调节因子，OPG的升高能显著抑制骨吸收，促进骨形成；OCN是由成骨细胞分泌的一种非胶原蛋白，代表成骨细胞的活性，是骨形成的重要标志物之^[17]。RT-qPCR结果提示牛膝甾酮能显著上调成骨分化相关基因Collagen Ⅰ、OPN、OPG、OCN mRNA的表达水平，以5，10 mg/L牛膝甾酮在48 h时间点的上调效应最为明显，初步说明牛膝甾酮能够通过上调成骨分化相关标志物而促进SD乳鼠成骨细胞的分化效能。

此外，近年来细胞自噬成为研究的热点之一，研究表明自噬参与调节成骨细胞主导的骨形成与破骨细胞主导的骨吸收的动态平衡，并影响了骨质疏松的发生与发展^[18]。研究发现将成骨细胞的自噬相关基因如BECN-1、ATG7、LC3Ⅱ等敲除后，将明显导致其矿化不足^[19]；持续氧化应激将导致成骨细胞凋亡，而经自噬诱导处理后能够显著减轻氧化应激导致的凋亡效应，如雌激素可通过诱导更高水平的自噬而对抗成骨细胞的凋亡^[19-21]；还有研究者提出在成骨细胞与骨基质结合分化为骨细胞时，自噬也是必不可少的^[22]。鉴于自噬对骨代谢调控的重要性，该研究亦初步探讨了牛膝甾酮对SD乳鼠成骨细胞自噬水平的影响。单丹磺酰尸胺(MDC)是一种荧色光素，属于嗜酸性染色剂，通常被用于检测自噬体形成，用不同质量浓度的牛膝甾酮干预成骨细胞后通过MDC检测细胞内自噬小体的形成情况，与0 mg/L牛膝甾酮组比较，当牛膝甾酮质量浓度在5 mg/L以上时，能够显著增加细胞内自噬小体的数量，提示牛膝甾酮能够提高成骨细胞的自噬水平而促进成骨分化。

综上，该研究初步探讨了牛膝甾酮对SD乳鼠成骨细胞增殖、分化的调控效应，在该研究质量浓度下的牛膝甾酮存在细胞毒性，在一定程度上抑制成骨细胞的活力，但是能够显著上调成骨分化相关标志物，最终促进成骨细胞的早期分化和晚期矿化能力；此外，近年来的文献报道提示激活自噬是一种潜在的促进成骨分化的新途径，牛膝甾酮能够提高成骨细胞的自噬水平，该研究可为抗骨质疏松新药的研发提供新的思路。

值得注意的是，该研究存在一定的局限性：①牛膝甾酮对SD乳鼠成骨细胞存在细胞毒性，考虑药物浓度过高，拟在后期研究中研究低质量浓度牛膝甾酮对成骨细胞活力的影响；②该研究初步考察了牛膝甾酮对成骨细胞自噬小体形成的影响，但没有深入探究其对自噬相关基因的调控效应；③成骨分化是多信号通路相互作用的结果，牛膝甾酮通过何种分子通路干预成骨分化不得而知；④基因表达的终产物是蛋白，该研究初步验证了牛膝甾酮能够上调成骨分化相关基因Collagen Ⅰ、OPN、OPG、OCN mRNA的表达水平，但没有进一步从蛋白水平加强验证，这些均需要在后续研究中深入探索，以期明确牛膝甾酮发挥相关效应的分子机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

牛膝甾酮干预SD乳鼠成骨细胞的增殖与分化

Inokosterone effects on proliferation and differentiation of osteoblasts from neonatal Sprague-Dawley rats

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