2.1  实验动物分析  10只孕昆明小鼠，缺氧后9只正常分娩，产下的新生鼠完成实验过程，1只缺氧过程中妊娠终止被淘汰，缺氧组4只孕鼠，治疗组5只孕鼠，每窝新生鼠取8只，对照组40只，缺氧组32只，治疗组40只。

2.2  复方脑肽节苷脂对宫内缺氧小鼠生长发育的影响  宫内缺氧后新生鼠出生当天体质量外观没有太大差异，随着生长发育逐渐出现明显生长发育迟缓现象，表现为毛发稀疏无光泽，发育期各阶段其体质量明显低于正常对照组(P < 0.05)，复方脑肽节苷脂治疗组，体质量明显高于缺氧组(P < 0.05)，表明复方脑肽节苷脂能明显改善宫内缺氧对新生鼠生长发育的影响，见表1。

2.3  小鼠跳台实验结果  与对照组相比，缺氧组动物潜伏期延长，但错误次数增加(P < 0.01)，与缺氧组比较，治疗组能减少错误次数并延长潜伏期(P < 0.05)，见表2。

2.4  免疫荧光测胶质纤维酸性蛋白、神经蛋白聚糖、胶原蛋白Ⅳ和SynDIG1表达  胶质纤维酸性蛋白、神经蛋白聚糖和胶原蛋白Ⅳ均为胞质和轴突着色(胶质纤维酸性蛋白主要表达于星形胶质细胞的胞浆，神经蛋白聚糖和胶原蛋白Ⅳ主要表达主要表达于神经元胞质和轴突)，与对照组比较，缺氧组脑皮质胶质纤维酸性蛋白、神经蛋白聚糖阳性细胞表达明显增强(P < 0.05)；而治疗组鼠脑皮质中胶质纤维酸性蛋白、神经蛋白聚糖的表达水平与缺氧组相比则显著减弱(P < 0.05)，见图1。与对照组相比，缺氧组脑海马CA2区胶原蛋白Ⅳ阳性物表达强度明显减弱(P < 0.05)；而治疗组鼠脑海马CA2区胶原蛋白IV的表达水平较缺氧组显著增强(P < 0.05)，见图1。SynDIG1在突触位点囊泡表达，呈点块状着色，与对照组相比，缺氧组脑海马CA2区SynDIG1阳性物表达强度明显减弱(P < 0.05)；而治疗组鼠脑海马CA2区SynDIG1的表达水平较缺氧组则显著增强 (P < 0.05)；与对照组相比，缺氧组各指标差异无显著性意义(P > 0.05)，见图1。

2.5  胶质纤维酸性蛋白、神经蛋白聚糖、胶原蛋白Ⅳ和SynDIG1蛋白Westernblot检测  与对照组相比，缺氧组胶质纤维酸性蛋白和神经蛋白聚糖蛋白相对表达量明显增高，但胶原蛋白Ⅳ和SynDIG1蛋白相对表达量明显减少  (P < 0.05)，见图2；与缺氧组相比，治疗组胶质纤维酸性蛋白和神经蛋白聚糖蛋白的相对表达量明显减少，而胶原蛋白Ⅳ和SynDIG1蛋白相对表达量明显增高(P < 0.05)，但与对照组相比，治疗组各检测蛋白的表达量差异无显著性(P > 0.05)，见图2。

宫内缺氧是胚胎发育过程中的常见症，常引起胎儿生长发育受限、智力低下等，严重者还会造成胎儿重要器官发育不良以及成年后的代谢异常。胚胎时期和出生后不久是哺乳动物中枢神经系统再生的黄金时期，成年后神经组织的再生能力几乎没有，这就为治疗脑损伤和神经退行性疾病带来了较大的难度，故寻找早期治疗手段显得尤为重要。复方脑肽节苷脂注射液(compound porcine cerebroside and ganglioside injection，CPCGI)是一种复方制剂，其主要成分为多肽、多种神经节苷脂、次黄嘌呤等，可以改善机体代谢、促进病态细胞及缺氧组织的正常生理功能的恢复，参与脑组织神经元的生长、分化和再生过程，改善脑血液循环和脑代谢功能^[1]，因此该药具有神经保护、使受损的神经组织重新得以恢复营养和功能等作用。临床研究显示，复方脑肽节苷脂注射液能明显改善老年痴呆病的认知功能^[2]，并可应用于多种原因导致的脑部功能障碍的治疗，但其具体药理作用机制尚待探究。目前复方脑肽节苷脂注射液的研究大多集中在临床一些颅脑损伤和新生儿缺血缺氧性脑病的疗效观察和分析^[3-4]，但其参与神经功能恢复的分子机制的基础性研究仅见少数几例报道。研究表明，复方脑肽节苷脂注射液可通过增加脑缺血区血管内皮生长因子及其相关受体的表达，改善缺血区血液循环，从而改善神经功能^[5]，复方脑肽节苷脂注射液也可通过抑制神经细胞的凋亡而发挥神经保护作用^[6]。该研究通过建立宫内缺氧新生鼠模型，观察缺氧对新生小鼠脑损伤及神经功能的影响，并探讨复方脑肽节苷脂注射液对宫内缺氧小鼠的神经保护作用，分析其治疗脑缺氧的机制及在神经功能恢复中的意义，为复方脑肽节苷脂注射液应用于临床提供充分的理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2018年11月至2019年5月在漯河医学高等专科学校科研中心完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  健康两三月龄昆明小鼠15只，体质量25-30 g, 郑州大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(豫)2017-0001。实验中对动物处置完全符合动物伦理学要求，最低限度减少动物的痛苦。

1.3.2  主要仪器和试剂  复方脑肽节苷脂注射液(批号180504，吉林步长制药有限公司)；鼠抗突触分化诱导基因1蛋白(Synapse differentiation induced gene 1，SynDIG1)、胶质纤维酸性蛋白、β-actin和兔抗CollagenIV抗体(美国Abcam公司)；兔抗Neuroncan抗体(美国Santa Cruz公司)；二抗为Alexa 488羊抗兔IgG(美国Invitrogen公司)、Alexa 568羊抗鼠IgG(美国Invitrogen公司)；振动切片机(德国莱卡公司)；DT-200小鼠跳台仪(成都泰盟软件有限公司)；RIPA裂解液、ECL发光试剂盒、HRP标记的山羊抗兔和羊抗鼠IG(碧云天生物公司)；荧光显微镜(日本Olympus公司)。

1.4  实验方法

1.4.1  动物配种与分组  成年健康雌性昆明小鼠15只，与雄鼠合笼，次日晨观察到阴栓记为怀孕0 d，孕鼠随机分为对照组、缺氧组和治疗组各5只。

1.4.2  动物缺氧模型的制作  缺氧组和治疗组孕鼠自孕14 d开始，置入动物缺氧箱内(体积分数10%氧浓度)3 h，连续缺氧5 d(孕第14-18天)，对照组不缺氧，余同缺氧组。待孕鼠自然分娩后第2天3组幼鼠处理：①治疗组：自然分娩后第2天腹腔注射复方脑肽节苷脂注射液(1 mL/kg)，连续7 d，休息2 d，再连续治疗7 d；②缺氧组予腹腔注射等量PBS；③对照组不治疗。

1.5  主要观察指标

1.5.1  动物生长发育观察  分别在小鼠出生后1，7，14，21，30 d用电子天平测量鼠的体质量以了解其生长发育情况。

1.5.2  小鼠跳台测试  出生后第30天，每组随机抽取5只进行跳台测试，通过小鼠跳台实验检测小鼠学习记忆能力。试验时，先将小鼠放在铜栅栏上，当铜栅栏接通电源，小鼠受到电击而跳上平台。坚持训练5 min，记录每只鼠5 min内遭受到电击(32 V)的次数，记录为它的错误次数，记录为它的学习成绩。24 h后重新检测，先将小鼠放在跳台上，记录第1次跳下的时间(潜伏期)，受电击5 min内的错误次数，以此反映记忆保持情况。动物每隔1 d测试1次，每次   5 min，共3次，记录最后1次小鼠的潜伏期和错误次数。

1.5.3  常规免疫荧光鉴定  小鼠跳台实验结束后当天，用40 g/L多聚甲醛灌注固定，取各组鼠的脑组织。4%的凝胶包埋行振动切片，选脑皮质和海马为观察点，经海马冠状切面切片(片厚20 μm)。脑片用0.1 mol/L PBS 冲洗切片  (5 min×3次)，加一抗，4 ℃湿盒过夜。实验用一抗为：鼠抗胶质纤维酸性蛋白和SynDIG1单克隆抗体(1∶500)；兔抗胶原蛋白Ⅳ和神经蛋白聚糖多克隆抗体(1∶200)。用 0.1 mol/L PBS冲洗脑片3次，漂洗后滴加相应二抗，避光孵育1 h，0.1 mol/L PBS冲洗3次，65%甘油封固。选取结构典型、染色理想的切片，海马CA2区和前脑皮质区做为观察部位并拍照。每个标本取3个6 cm×5 cm大小的视野，用ImagePro-Plus6.0(IPP6.0)图像分析软件进行分析，取其平均值，作为该切片的数值。

1.5.4  Western blotting检测胶质纤维酸性蛋白和神经蛋白聚糖、胶原蛋白IV和SynDIG1蛋白表达  小鼠跳台结束后，麻醉后收集各组的脑组织，RIPA裂解液4 ℃裂解组织，提取总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，各泳道蛋白上样量调整为25 μg，经10%SDS-PAGE电泳分离，并转移至PVDF膜，脱脂奶粉封闭1.5 h，TBST漂洗3次，加入一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入二抗，室温下孵育1 h，TBST洗3遍，ECL发光试剂盒反应，在凝胶成像仪器下观察，拍照并分析。抗β-actin鼠单克隆抗体蛋白条带作为内参，用Image J软件进行灰度分析，并以靶蛋白积分吸光度值与β-actin值的比值表示靶蛋白的相对水平。实验重复3次。

1.6  统计学分析  结果以x(_)±s表示，各指标采用SPSS 17.0统计软件分析，组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD检验。以P < 0.05认为差异有显著性意义。

胚胎后期是神经管形成和神经系统发生的重要时期，也是大脑快速发育的时期，缺氧对神经元的损伤是致命的，严重的可致脑性瘫痪、癫痫及生长发育迟缓或智力低下等。为了验证缺氧对新生鼠的影响并探索复方脑肽节苷脂注射液对缺氧后脑损伤的治疗效果，在前期研究基础上^[7]，采用智能缺氧箱制作宫内缺氧动物模型，该箱可自动充入氮气，较为准确调节箱内氧气的浓度，使箱内氧浓度上下波动在±0.1左右^[8]，能满足实验所需参数。此次实验设置氧浓度为体积分数10%，经5 d间歇性宫内缺氧，待小鼠自然分娩后，通过腹腔注射给治疗组的新生鼠注射复方脑肽节苷脂注射液(1 mL/kg)^[9]。观察发现，缺氧不但造成大鼠体质量减轻，毛发稀疏无光泽；小鼠跳台实验结果显示，与对照组相比较，缺氧组小鼠潜伏期明显减短，而5 min内跳下平台受到电击的次数明显增多，结果说明宫内缺氧模型的制作是成功的，缺氧导致了小鼠学习记忆能力的下降。免疫荧光结果表明新生仔鼠大脑胶质纤维酸性蛋白表达量明显高于对照组，胶质纤维酸性蛋白是星形胶质细胞的特异性标记物，表达与神经元之间，它的足突包裹在血管周围，控制营养物质的流动，提供代谢环境，星形胶质细胞还参与调节缺氧引起的血脑屏障通透性、脑炎症和神经保护等方面的变化。因此，星形胶质细胞在正常情况下和大脑缺氧时均对神经元功能方面发挥着重要的作用^[10-12]。脑缺血缺氧损伤后星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白表达增强，提示星形胶质细胞发生激活^[13-14]，过度激活的星形胶质细胞也可释放炎性细胞因子，加重神经元的损害，具有毒性作用^[15]。星形细胞具有双重作用，双刃剑，早期分泌的炎症递质促进神经修复，后期形成胶质瘢痕影响髓鞘修复以及神经元轴突的生长。此次研究显示，缺氧组鼠脑胶质纤维酸性蛋白阳性物表达较对照组显著增强，提示缺氧导致鼠脑星形胶质细胞发生激活，增生，治疗组胶质纤维酸性蛋白阳性表达较缺氧组显著减弱，说明复方脑肽节苷脂一定程度上减弱了缺氧后鼠脑星形胶质细胞的增生，对缺氧刺激起到了缓解作用，有利于神经的修复。

神经蛋白聚糖是神经元分泌的特异性蛋白质，广泛分布于神经系统，研究表明发育期鼠脑有表达，大脑发育成熟后表达消失，但脑损伤后受损区胶质细胞增生，形成胶质瘢痕，此时活化的胶质细胞也分泌大量的神经蛋白聚糖，所以在胶质瘢痕中神经蛋白聚糖表达上调，神经蛋白聚糖可与神经元胞膜上特异性受体神经黏附分子和神经元胶质细胞黏附分子结合，影响轴突生长，抑制突触形成^[16]。研究表明神经蛋白聚糖的降解有可能是评价中枢神经系统治疗的潜在指标^[17-18]。SUN等^[19]研究表明，低氧条件下miR-24通过下调神经蛋白聚糖表达，从而达到细胞的抗缺氧作用。此次研究显示，缺氧组神经蛋白聚糖阳性细胞表达较对照组显著增多，治疗组神经蛋白聚糖表达较缺氧组显著减少，这一结果与此次研究胶质纤维酸性蛋白缺氧后高表达结果相吻合，结合小鼠跳台实验结果，提示复方脑肽节苷脂缓解了宫内缺氧性脑损伤小鼠脑神经胶质细胞的活化，并抑制了神经蛋白聚糖的分泌，促进神经轴突的生长与突触的形成，提高记忆功能。

目前大多数学者都把研究的焦点聚集在神经元的变化，研究发现缺氧状态下，在神经元损伤前脑部的血脑屏障可能已经发生了功能变化，中枢神经系统的血脑屏障由血管内皮细胞间的紧密连接、基底膜和毛细血管周围的星形胶质细胞的足板构成^[20]。血脑屏障可以阻止血液中有害物质进入脑组织，调节大脑内外环境、维持水平衡，在维持中枢脑正常功能方面发挥重要作用^[21]。脑缺氧后脑发生一系列病理生理变化，导致血脑屏障破坏^[22]。研究表明，基底膜是构成血脑屏障的重要组成成分，胶原蛋白Ⅳ广泛存在于基膜之中，是组成基底膜的主要蛋白质^[23-24]，胶原蛋白Ⅳ在脑损伤后的表达水平发生变化，是损伤大脑血管构建和基膜重塑的关键因素之一，在神经功能重塑方面发挥重要作用，研究表明胶原蛋白Ⅳ通过调节斑马鱼基底膜的完整性来控制小脑颗粒细胞的轴突形成^[25]。另有文献表明，大鼠在缺氧暴露后，动脉中膜胶原蛋白Ⅳ表达明显减少^[26]。此次研究结果显示，缺氧组胶原蛋白Ⅳ较对照组减少，说明缺氧导致脑血管基底膜损伤，而治疗组胶原蛋白Ⅳ的表达较缺氧组明显增多，说明复方脑肽节苷脂可促进胶原蛋白Ⅳ的表达增多，促进脑组织微血管基底膜的重塑。

海马与空间认识和记忆相关，共有CA1、CA2、CA3和DG4个区域，它们之间互相结合形成局部的神经回路，关于海马与记忆的关系的研究，过去关注较多的是CA1、CA3和DG。CA2虽然是海马很小的一部分，但近年来研究表明CA2可以控制海马局部神经回路的激活与抑制平衡^[27-29]，CA2位于能够影响到全部海马局部神经回路的部位，向CA1和CA3输入信息，对CA2灭活的小鼠进行场景恐惧条件反射学习，其场景记忆需要更多时间^[28]，提示海马CA2区在记忆中发挥重要作用。此次研究把CA2区作为观察对象，研究各组小鼠神经功能。损伤后的神经系统具有修复功能，主要表现为突触可塑性。SynDIG1是一种近年来发现的新型脑蛋白，在突触的形成和发育中发挥关键作用。研究表明SynDIG1对突触形成、发育以及寿命等有着至关重要的作用^[29-32]。突触可塑性是突触对机体内外环境变化作出反应的能力，是学习记忆的神经生物学基础。此次研究观察了复方脑肽节苷脂对宫内缺氧幼鼠的影响，免疫荧光结果表明，与对照组相比，缺氧组SynDIG1阳性表达物显著减少，而治疗组SynDIG1阳性表达较缺氧组明显增加。说明复方脑肽节苷脂可以促进缺血缺氧性脑损伤小鼠脑突触的发育与成熟，且这一结果与Westernblot结果相一致。

综上所述，复方脑肽节苷脂可减轻缺氧小鼠星形胶质细胞的活化，促进神经细胞轴突与突触的再生，改善记忆功能，其机制可能是通过下调神经蛋白聚糖的表达，促进胶原蛋白Ⅳ分泌从而改善脑内微环境所致起到神经保护作用，因此认为复方脑肽节苷脂注射液对宫内缺氧后幼年期小鼠神经功能的损伤具有治疗作用，但具体的机制仍需后续实验进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
复方脑肽节苷脂注射液：是一种复方制剂，主要由多种神经节苷脂、多肽和次黄嘌呤等成分组成，参与神经元的生长和分化以及细胞迁移和神经生长锥的定向延伸，能加速损伤的神经组织的再生修复及功能恢复，减低兴奋性氨基酸的释放，从而减轻细胞毒性，临床被广泛应用于神经损伤后的修复治疗。
突触：是神经元与神经元之间或神经元与非神经细胞之间的一种特化的细胞连接，是传递信息的关键部位，神经元之间借助突触彼此相互联系，构成机体复杂的神经网络，实现神经系统的各种功能活动。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

目前大多数学者都把研究的焦点聚集在神经元的变化，研究发现，缺氧状态下，在神经元损伤前，脑部的血脑屏障可能已经发生了功能变化，中枢神经系统的血脑屏障由血管内皮细胞间的紧密连接、基底膜和毛细血管周围的星形胶质细胞的足板构成。血脑屏障可以阻止血液中有害物质进入脑组织，调节大脑内外环境、维持水平衡，在维持中枢脑正常功能方面发挥重要作用。脑缺氧后脑发生一系列病理生理变化，导致血脑屏障破坏。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程