2.1  实验动物数量分析  实验选用大鼠45只，分为3组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。

2.2  各组大鼠脑组织含水量及脑组织梗死情况  和正常组相比，模型组大鼠脑组织含水量及脑组织梗死比例升高；和模型组相比，自噬抑制剂组大鼠脑组织含水量及脑组织梗死比例显著升高(P < 0.05)，见表1、图1。



2.3  各组大鼠免疫荧光结果  图2中蓝色荧光为细胞核染色，红色荧光为线粒体染色，绿色荧光为LC3标记自噬染色，黄色荧光为线粒体自噬表达。和正常组相比，模型组大鼠绿色、红色荧光表达升高，共定位阳性细胞数量升高；和模型组相比，自噬抑制剂组大鼠绿色、红色荧光表达降低，共定位阳性细胞数量显著降低(P < 0.05)，见表2。

2.4  各组大鼠流式荧光结果  和正常组相比，模型组大鼠红色荧光强度降低，绿色荧光强度增加；和模型组相比，自噬抑制剂组大鼠红色荧光强度降低，绿色荧光强度显著增加(P < 0.05)，见表3，图3。

2.5  各组大鼠PINK1蛋白和线粒体LC3、Parkin蛋白表达  和正常组相比，模型组大鼠PINK1、LC3、Parkin蛋白表达量升高；和模型组相比，自噬抑制剂组大鼠PINK1、LC3、Parkin蛋白表达量显著降低(P < 0.05)，见表4，图4。

高血压脑出血为临床多见致死性疾病，伴随人们生活环境与饮食习惯的改变，临床高血压脑出血患者发病率逐年升高，血肿早期扩大会加重脑水肿和脑梗死，而患者在发病后所发生血肿占位效应为导致预后不理想主要因   素^[1-3]。脑出血后脑组织内三磷酸腺苷合成打断，线粒体受到损坏，氧化呼吸链内电子漏出形成凋亡因子与活性氧并释放到神经元胞浆中，浆细胞死亡路径激活^[4-5]。线粒体自噬为在营养缺乏、细胞衰老和活性氧等应激影响下，细胞中线粒体发生去极化损害，自噬体特异性包裹了受损线粒体，同时融合溶酶体以后发生降解，进而保持细胞内环境的稳定，微管相关蛋白1轻链3(LC3)为自噬体特征蛋白^[6-8]。相关研究显示，哺乳动物中除了FUNDC1、Bnip3与Nix为和低氧环境联系紧密线粒体自噬路径，介导脑损伤线粒体主要自噬路径为Pink1/ Parkin，PINK1在Parkin的上游，Pink1/Parkin路径介导受损线粒体表层功能蛋白或者结构多聚泛素化，同时当做自噬体选择包括标志，在细胞自噬依赖去极化线粒体降解中有重要影响^[9-11]。因此，此次研究通过分析Pink1/Parkin介导的线粒体自噬在高血压脑出血后脑损伤大鼠中的作用，为临床患者诊疗提供一些借鉴。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2016年9月至2018年9月在四川绵阳完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  选取SPF级Wistar雄性大鼠45只，8周龄，购自北京维通利华实验动物公司，许可证号：SCXK (京)：2019-14，体质量220-240 g，平均(235.61±5.72)g。常规饲养1周后开始实验，大鼠分笼饲养，每个笼内5只，室温维持在22-26 ℃，相对湿度在55%-65%间，昼夜循环，保持12 h光照，大鼠灌胃、添加饲料及换水等都有专人进行。

1.3.2  实验用主要试剂与仪器  自噬小体示踪剂(lysotracker)、线粒体示踪剂(mitotracker)(美国Invitrogen公司)；自噬抑制剂3-MA(美国Sigma公司)；线粒体膜电位试剂盒、蛋白酶抑制剂PMSF、组织线粒体分离试剂盒(上海碧云天生物公司)；BCA蛋白定量试剂盒(北京百泰克生物公司)；ECL低物化学发光试剂(美国Pierce公司)；电热恒温鼓风干燥箱(型号：DHG-9023A)、数字显示隔水式电热恒温培养箱(型号：PYX-DHS)、漩涡混合器(型号：XW-80A)、离心机(型号：TGL-168)均由美国KIMBLE公司生产；病理组织漂烘仪(型号：PHY-Ⅲ，由常州中威电子仪器厂生产)；转轮式切片机(型号：莱卡-2016，由德国莱卡公司生产)；电泳仪(型号：DYY-6D，由北京六一仪器厂生产)。

1.4  实验方法

1.4.1  动物分组  随机数字表法将45只大鼠分成3组，分别为正常组、模型组和自噬抑制剂组，每组15只。

1.4.2  制备大鼠高血压模型和脑出血模型  无菌手术下降大鼠双肾动脉下极分支结扎，同时采用高脂高盐饲料喂养2个月，以制备高血压模型。依据包新民等^[12]定位法，模型组和自噬抑制组大鼠立体定位仪于冠状缝前1.5 mm、中线旁开2 mm位置将0.7 mL自体血注入，以制备脑出血模型。造模前自噬抑制剂组大鼠由腹腔注射2 μL溶有三甲基腺嘌呤(3MA，100 mmol/L)的PBS，模型组和正常组大鼠腹腔注射2 μL PBS。成功造模标准：大鼠处死解剖观察，若脑组织均产生血肿，且血肿位于尾状核区，各层面为类圆形或者圆形，有明显占位效应。

1.4.3  制备大脑皮质单细胞悬液  成功造模后24 h将大鼠处死，选取100 mg右侧大脑皮质，PBS冲洗。而后将组织放置在冰上培养皿内，组织剪碎并转移至离心管内，加入0.25%胰酶-EDTA复合消化液37 ℃下消化15 min，此期间可吹打或者间断震荡。终止消化采用细胞培养液。吹打均匀以后，使用200目细胞筛过滤，采集细胞悬液，离心机3 500 r/min离心8 min后弃上清液，冲洗沉淀2次以后加入PBS，制备为单细胞悬液。

1.5  主要观察指标  

1.5.1  检测脑组织含水量  干湿比重法检测脑组织含水量，造模后24 h每组随机选取5只，麻醉后大鼠断头取脑，电子天平秤湿质量，而后锡纸包被后放置在200 ℃恒温箱内烘干12 h，取出秤干质量，脑组织含水量=(湿质量-干质量)/湿质量×100%。

1.5.2  脑梗死灶情况  采用TTC染色法检测，选取大鼠脑组织并放置在脑切片模具内冰冻15 min，从视交叉沿着冠状位切片，厚度2 mm，而后置入浓度为2% TTC内，孵育25 min。梗死组织为白色，正常组织为红色，并计算梗死体积。

1.5.3  免疫荧光共定位检测线粒体发生自噬情况  lysotracker为自噬体蓝色荧光探针，作用为自噬体荧光染色；Mitotracker为线粒体红色荧光探针，作用为活细胞线粒体特异荧光染色，两者同时进行能检测线粒体发生自噬情况。细胞计数仪下对分离的脑细胞计数，调节细胞浓度为1×    10⁹ L^-1；无水二甲基亚砜内溶解lysotracker与Mitotracker，浓度调节为1 mmol/L保存。选取Mitotracker 1 mmol/L置入PBS内调整浓度200 nmol/L，选取lysotracker 1 mmol/L置入PBS内调整浓度至150 nmol/L，单细胞悬液在离心以后上清液清除，PBS冲洗3次，离心后上清液清除，EP管内lysotracker、Mitotracker工作液悬浮细胞，避光下孵育   25 min。染色工作液去除，PBS冲洗2次，在置入PBS(含40 g/L多聚甲醛)，固定15 min，使用PBS冲洗3次，再加入PBS(含0.2%TritionX-100)孵育8 min。PBS冲洗3次后DAPI置入并孵育8 min，使用PBS冲洗后共焦成像。自噬被LC3标记时，于Mitotracker染色固定，PBS冲洗3次并封闭1 h，加入一抗孵育过夜，在将荧光素标记二抗滴入，孵育1 h，PBS冲洗后行共聚焦成像。

1.5.4  JC-1检测大鼠线粒体膜电位情况  正常细胞线粒体的膜电位比较高，线粒体中JC-1聚集体含量高，红色荧光变强；细胞受损时，线粒体膜电位降低，线粒体中JC-1为单体方式，表现为绿色荧光。所以，出现红色荧光降低或者绿色荧光变强时，说明线粒体膜电位降低，线粒体受损。8 mL超纯水内加入JC-1(200X)50 μL摇匀，在置入JC-1染色缓冲液(5X)2 mL，即是JC-1染色工作液。4 mL蒸馏水加入JC-1染色工作液1 mL制备为JC-1染色缓冲液。大脑脑组织行单细胞分离，细胞计数仪下对分离脑细胞计数，调节细胞浓度为1×10⁹ L^-1。在500 mL PBS内重悬，置入JC-1染色工作液0.5 mL，孵育15 min，离心机3 000 r/min离心  5 min，细胞沉淀。上清液清除后使用染色缓冲液冲洗2次，流式细胞仪进行检测。

1.5.5  Western-blot检测线粒体LC3、Parkin蛋白和脑组织细胞内PINK1蛋白表达  选取脑组织研磨，经过组织裂解后上样电泳，起始电压80 V，溴酚蓝染料前缘进入到分离胶上缘后电压提升到100 V，溴酚蓝泳出分离胶下缘后电泳结束。半干电转移仪于PVDF膜内行蛋白质电转移，恒流为30 mA，连续90 min。PVDF膜取出后采用5%TBST脱脂奶粉封闭，震荡60 min。结束封闭后采用TNS-T漂洗液洗膜10 min，3次，把膜转移到杂交袋内，加入适量漂洗液稀释抗体，封口后在4 ℃下孵育过夜；TBST漂洗液洗膜   10 min，3次，在加入漂洗液稀释的辣根过氧化物酶标记二抗，震荡60 min。PVDF膜放置在ECL显色液内震荡温育  5 min，暗室下曝光、显影及定影。清水冲洗以后，晾干扫描，IPP软件对扫描图像目的条带行灰度分析。

1.6  统计学分析  采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料x(_)±s表示，单因素方差分析，组间两两对比t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

线粒体为不断融合与分裂动态平衡细胞器，若打破这一平衡则会造成线粒体功能出现障碍，同时线粒体功能障碍所牵扯很多疾病发生与发展^[13-14]。线粒体自噬为经过特异性自噬将受损线粒体清除，所以在保持线粒体自稳态和细胞存活中线粒体自噬有重要影响^[15-18]。此次研究显示，和正常组相比，模型组大鼠脑组织含水量及脑组织梗死比例升高；和模型组相比，自噬抑制剂组大鼠脑组织含水量及脑组织梗死比例显著升高，说明抑制线粒体自噬可能会使大鼠缺氧缺血情况加重。推测线粒体自噬抑制后，线粒体损伤加重，机体氧化呼吸链内电子漏出，形成大量活性氧、释放凋亡因子至神经元胞浆内，将细胞死亡路径激活，加速细胞凋亡。ZUO等^[19]研究显示，动脉缺血大鼠中前期缺氧缺血下依赖线粒体分裂蛋白所表达线粒体自噬能够将受损线粒体清除，保持细胞稳态，促进细胞存活。荧光探针JC-1为阳离子型亲脂性染料，可以跨越细胞膜，伴随细胞膜电位改变于膜两侧维持动态平衡^[20-22]。正常细胞线粒体内膜电位较高，线粒体中JC-1聚集体含量高，红色荧光变强，流式图内显示时FL2阳性率增大，若细胞受损，则线粒体膜电位降低，线粒体中JC-1为单体方式，出现绿色荧光，则FL1阳性率变强。此次研究显示，脑出血大鼠和正常大鼠相比，线粒体中JC-1单体含量较高，FL1路径内绿色荧光强度变大，增加了线粒体膜裂解，使膜电位显著下降。同时，在免疫荧光检测显示自噬小体与线粒体共定位阳性变多，说明脑出血大鼠脑组织内线粒体自噬明显增大。CAVALLUCCI等^[23]建立局灶性脑受损大鼠模型显示，经电镜对线粒体形态检测，受损脑组织内有线粒体自噬存在，同时线粒体自噬加强能够使局灶性脑受损远期退化推迟。

临床帕金森病致病中Pink1和Parkin有重要的影响，所以受到了人们的广泛关注。PARK2与PINK1基因改变为家族性神经退行性疾病主要致病因素。激酶Pink1功能异常则会造成线粒体功能失调，对多巴胺神经元细胞生存产生影响，Pink1能够直接结合E3泛素连接酶Parkin以起到协同影响^[24-27]。有研究显示，上述两种蛋白紧密结合可将线粒体自噬启动，并将受损线粒体特异性清除^[28-29]。蛋白激酶Pink1是胞核基因编码，胞质合成以后经过线粒体膜分子进入到线粒体的内部，并使线粒体中蛋白水解酶发生将解。而线粒体损伤则会造成内膜电位消散，阻止了Pink1向内膜的转移，避免蛋白水解酶将其降解，于线粒体外模内积累。Parkin为E3泛素连接酶，Pink1由细胞质内将其招募并出现磷酸化^[30-33]。Parkin活化后可将需降解线粒体标记泛素标签，进而被接头蛋白所识别，而后者连接LC3等相关ATP酶增强子，产生线粒体自噬体^[34]。三甲基腺嘌呤(3MA)为自噬抑制剂，经过对ClassⅢ PI3K抑制而抑制产生自噬体，三甲基腺嘌呤不但可抑制非选择性自噬，还能够抑制选择性自噬。目前，相关研究均证实线粒体自噬调节异常和临床很多疾病联系紧密，特别是脑损伤与神经退行性疾病^[35-36]。此次研究显示，注射自噬抑制剂后可看到自噬小体与线粒体共定位阳性率降低，明显抑制了线粒体自噬。同时免疫荧光显示线粒体自噬被抑制后，绿色荧光变强而红色荧光下降，线粒体的膜电位降低，凋亡细胞变多。

综上所述，线粒体自噬可缓解高血压脑出血后脑损伤程度，Pink1/Parkin通路在线粒体自噬中有重要作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
线粒体自噬：指在营养缺乏、细胞衰老和活性氧等应激影响下，细胞中线粒体发生去极化损伤。
三甲基腺嘌呤(3MA)：指自噬抑制剂，通过对ClassⅢ PI3K抑制而抑制产生自噬体，三甲基腺嘌呤不但可抑制非选择性自噬，还能够抑制选择性自噬。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

线粒体是一种存在于大多数细胞中的由两层膜包被的细胞器，细胞中制造能量的结构，细胞进行有氧呼吸的主要场所，被称为"power house"。其直径在0.5-10μm。线粒体拥有自身的遗传物质和遗传体系，但它的基因组大小有限，是一种半自主细胞器。除了为细胞提供能量外，线粒体还参与诸如细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并拥有调控细胞生长和细胞周期的能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程