人胎盘胎儿侧间充质干细胞无血清培养上清对肺脏上皮细胞氧化应激的保护作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.33.019

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (33): 5369-5374.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.33.019

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

人胎盘胎儿侧间充质干细胞无血清培养上清对肺脏上皮细胞氧化应激的保护作用

付雪^1，2，刘国攀^1，2，张玉洁^1，2，严秀蕊²，马晓娜²，刘晓明²，魏军^1，2

¹宁夏医科大学临床医学院，宁夏回族自治区银川市 750003；²宁夏医科大学总医院人类干细胞研究所，宁夏回族自治区银川市 750004

修回日期:2017-09-01 出版日期:2017-11-28 发布日期:2017-12-01
通讯作者: 魏军，硕士，主任医师，宁夏医科大学临床医学院，宁夏回族自治区银川市 750003；宁夏医科大学总医院人类干细胞研究所，宁夏回族自治区银川市 750004
作者简介:付雪，女，1991年生，天津市人，汉族，宁夏医科大学在读研究生，主要从事间充质干细胞抗氧化相关研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81460247)；宁夏医科大学临床医学一流学科建设项目；2017年宁夏“研究生教育创新计划”学位点建设项目(YXW2017014)

Protective role of serum-free supernatant of human placental fetal mesenchymal stem cells against oxidative stress injury to lung epithelial cells

Fu Xue^{1, 2}, Liu Guo-pan^{1, 2}, Zhang Yu-jie^{1, 2}, Yan Xiu-rui², Ma Xiao-na², Liu Xiao-ming², Wei Jun^{1, 2}

¹College of Clinical Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750003, Ningxia Hui Autonomous Region, China; ²Ningxia Human Stem Cell Institute, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China

Revised:2017-09-01 Online:2017-11-28 Published:2017-12-01
Contact: Wei Jun, Master, Chief physician, College of Clinical Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750003, Ningxia Hui Autonomous Region, China; Ningxia Human Stem Cell Institute, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
About author:Fu Xue, Studying for master’s degree, College of Clinical Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750003, Ningxia Hui Autonomous Region, China; Ningxia Human Stem Cell Institute, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81460247; First-Class Clinical Discipline Construction of Clinical Medicine of Ningxia Medical University; the Project of Postgraduate Education Innovation Plan of Ningxia in 2017, No. YXW2017014

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
人胎盘胎儿侧间充质干细胞无血清培养上清：是从人胎盘胎儿侧组织中提取间充质干细胞，使用无血清培养基进行原代及传代培养，待细胞生长密度达80%时收集的培养基。
氧化应激：是指氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物。

摘要
背景：前期研究证实人胎盘胎儿侧间充质干细胞培养上清具有一定的清除活性氧自由基的能力，且本身具有一定的抗氧化酶活性。
目的：探究人胎盘胎儿侧间充质干细胞在无血清培养条件下所得上清对氧化应激损伤的肺脏上皮细胞的保护作用及其作用机制。
方法：分别使用不同浓度的过氧化氢(200，400，500，600，800 μmol/L)对肺脏上皮细胞A549细胞系进行6，12，24 h的氧化刺激，通过CCK-8法对肺脏上皮细胞存活率进行检测，得出存活率为50%时的过氧化氢浓度作为氧化损伤模型的最适条件。用Hochest33258染色及Western Blot对模型有效性进行验证。采用无血清培养基培养胎盘胎儿侧间充质干细胞，收集P3代细胞培养上清将其作用于氧化损伤的肺脏上皮细胞，培养24 h，即上清组。同时设立损伤组(仅进行氧化损伤)和维生素C组(培养基中添加100 μmol/L的维生素C)。利用流式细胞术对各组细胞凋亡情况进行检测以及Western Blot检测凋亡相关蛋白及氧化应激经典信号通路Nrf2-Keap1-ARE信号通路相关蛋白的表达。
结果与结论：①CCK-8法检测得出，采用600 μmol/L的过氧化氢对肺脏上皮细胞进行24 h的氧化刺激，A549细胞存活率为(56.41±3.31)%。Hochest33258染色及Western Blot证实模型的可靠性；②流式细胞术结果显示维生素C组和上清组氧化损伤细胞的凋亡率与损伤组细胞相比有不同程度的降低，其中上清组与损伤组相比差异有统计学意义(P < 0.05)；③Western Blot对凋亡相关蛋白的检测显示，与损伤组对比，维生素C组和上清组凋亡促进基因Bax蛋白表达减弱，凋亡抑制基因Bcl-2蛋白表达增强，且差异有统计学意义(P < 0.05)。Nrf2-Keap1-ARE信号通路相关蛋白显示与损伤组对比，维生素C组和上清组Nrf2蛋白表达增强，Keap1分子表达减弱且差异有统计学意义(P < 0.05)；④上述结果提示，实验成功构建了肺脏上皮细胞损伤模型，且人胎盘胎儿侧间充质干细胞培养上清具有一定的抗氧化能力，能够起到减弱氧化损伤，抑制细胞凋亡的作用，其作用机制可能与激活Nrf2-Keap1-ARE信号通路有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-2443-026X(魏军)

关键词: 干细胞, 间充质干细胞, 胎盘, 氧化应激, 肺脏上皮细胞, CCK-8法, Hochest33258染色, Western Blot法, 细胞凋亡, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Preliminary experimental studies have shown that the supernatant of human placental fetal mesenchymal stem cells (fPMSCs) has a certain ability to scavenge reactive oxygen species and itself has a certain antioxidant enzyme activity.
OBJECTIVE: To investigate the protective role and mechanism of fPMSCs supernatant in serum-free culture on oxidative stress-injured lung epithelial cells.
METHODS: Different concentrations of hydrogen peroxide produced oxygen stimulation to lung epithelial cell lines A549 for 6, 12, 24 hours, and the survival rate of lung epithelial cells was detected using cell counting kit-8 method. When the survival rate of lung epithelial cells was 50%, the concentration of hydrogen peroxide was most suitable to make an oxidative damage model. The validity of the model was verified using Hocheest33258 staining and western blot. fPMSCs were cultured in serum-free culture medium, and the supernatant of passage 3 cells was collected. Afterwards, the injured lung epithelial cells were cultured in the fPMSCs cell supernatant for 24 hours. Meanwhile, injury group (oxidative damage only) and vitamin C group (100 μmol/L vitamin C was added in the medium) were established. In the three groups, cell apoptosis was detected by flow cytometry; and western blot was used to detect apoptosis-related proteins and proteins related to the Nrf2-Keap1-ARE signaling pathway.
RESULTS AND CONCLUSION: After oxygen stimulation by 600 μmol/L hydrogen peroxide for 24 hours, the survival rate of A549 cells was (56.41±3.31)% as ascertained by the cell counting kit-8 assay. Findings from Hocheest33258 staining and western blot further confirmed the reliability of this model. Flow cytometry results showed that the apoptosis rate in the vitamin C group and the supernatant group decreased to some extent compared with the injury group, and the difference between the supernatant group and the injury group was statistically significant (P < 0.05). In addition, the expression of Bax significantly decreased and the expression of Bcl-2 significantly increased in the vitamin C group and the supernatant group as detected by western blot assay, in comparison with the injury group (P < 0.05). Compared with the injury group, the expression of Nrf2 protein increased and the expression of Keap1 decreased in the vitamin C group and the supernatant group (P < 0.05). These findings suggest that fPMSCs supernatant has a certain antioxidant capacity, and may attenuat oxidative damage and inhibit apoptosis in A549 cells. The mechanism is probably related to the Nrf2-Keap1-ARE signaling pathway.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Placenta, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

付雪，刘国攀，张玉洁，严秀蕊，马晓娜，刘晓明，魏军. 人胎盘胎儿侧间充质干细胞无血清培养上清对肺脏上皮细胞氧化应激的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(33): 5369-5374.

Fu Xue, Liu Guo-pan, Zhang Yu-jie, Yan Xiu-rui, Ma Xiao-na, Liu Xiao-ming, Wei Jun. Protective role of serum-free supernatant of human placental fetal mesenchymal stem cells against oxidative stress injury to lung epithelial cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(33): 5369-5374.

图/表（结果） 2

2.1 氧化损伤模型的建立 CCK-8法显示，随着过氧化氢浓度的增加，作用时间的延长，细胞存活率降低。而在过氧化氢浓度为600 μmol/L，刺激时长为24 h时，细胞的存活率为(56.41±3.31)%，符合后续实验需要(表1)。

2.2 Hochest33258染色验证模型有效性 实验对正常组和损伤组细胞进行染色(图1)，结果可见损伤组细胞核出现不同程度的核固缩、核碎裂、核溶解现象；与正常组相比，细胞核内可见颗粒块状蓝色荧光，由此可知损伤组细胞凋亡现象明显。
2.3 Western Blot验证模型有效性 Bax/Bcl-2是一对经典的促凋亡/抑制凋亡蛋白，与正常组相比，损伤组Bax蛋白表达增强，而Bcl-2蛋白表达减弱(图2)，且差异有显著性意义(P < 0.05)。结果提示与正常对照组相比，损伤组细胞在分子水平上发生了凋亡，证明损伤模型的有效性。

2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率 Annexin V?FITC/PI双染结果(图3)显示为维生素C组和上清组的细胞凋亡率均低于单纯的过氧化氢损伤组，但是其仅有上清组晚期凋亡及综合凋亡率与损伤组相比差异有显著性意义(P < 0.05)

2.5 Western Blot检测凋亡相关蛋白的表达 通过Western Blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2及Caspase3的表达(图4)，可以发现与损伤组相比，维生素C组和上清组的促凋亡蛋白Bax、Caspase3表达降低；抑制凋亡蛋白Bcl-2表达升高，且差异有显著性意义(P < 0.05)。此结果证明，损伤组相比，维生素C组和上清组的细胞损伤程度均有所减低，证明上清和维生素C对损伤细胞均具有一定程度的保护作用，且培养上清的保护作用优于100 μmol/L维生素C。

2.6 Western Blot检测Nrf2-Keap1-ARE信号通路相关蛋白的表达 通过Western blot法对3组细胞Keap1、Nrf2蛋白表达水平进行检测(图5)。结果表明，与损伤组比较，维生素C组及上清组Keap1蛋白水平减少，而Nrf2蛋白表达水平增加，差异均有显著性意义(P < 0.05)。结果说明，与损伤组相比，维生素C组和上清组的细胞抗氧化能力增强，提示培养上清与维生素C均具有一定程度的抗氧化能力，且从蛋白的表达水平上看，培养上清的抗氧化能力优于维生素C。

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引言

急性肺损伤是由一系列因素导致的肺脏上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤，引发肺水肿及低氧性呼吸功能不全，临床上表现为进行性低氧血症和呼吸窘迫，可进一步发展成为急性呼吸窘迫综合征，死亡率高达35%-40%^[1-2]。而有关急性肺损伤机制的研究发现，炎症和抗炎平衡失调、氧化应激的发生与机体抗氧化能力的失调是主要的病因^[3-5]。因此，抗氧化应激、抑制炎症因子的过度释放成为治疗急性肺损伤的关键。

氧化应激，即机体遭受一系列外界刺激后，氧化系统与抗氧化系统平衡失调，导致体内正常代谢产生的活性氧无法被清除而大量蓄积，从而造成组织器官的氧化损伤^[6-7]。有研究发现机体抗氧化是通过Nrf2-Keap1-ARE信号发挥作用的^[8-9]。在正常生理情况下，Nrf2分子与胞浆中的Keap1蛋白分子结合而处于非活性状态，无法进入细胞核发挥作用。当机体受到氧化刺激时，Nrf2与Keap1发生解偶联，Nrf2磷酸化后转移进入细胞核，与抗氧化反应原件上的ARE相结合，启动ARE调控的下游二相解毒酶以及抗氧化蛋白基因的表达，提高细胞抗氧化应激的能力^[10]。

间充质干细胞来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，由于其具有强大的多向分化潜能及免疫调控能力而被公认为组织修复的理想种子。目前已经有大量实验证实间充质干细胞可以在急性肺损伤等一系列肺脏疾病中发挥重要作用，且部分作用机制是减轻氧化应激。Shalaby等^[11]证实了间充质干细胞可以减轻肺组织损伤，提高血清中抗氧化酶类物质的活性。Wilson等^[12]将间充质干细胞用于治疗急性呼吸窘迫综合征，且取得了较好的效果。另外，一些研究认为间充质干细胞发挥抗炎及抗氧化作用是基于其强大的旁分泌功能，即当外源间充质干细胞进入机体后，会通过分泌抗炎因子及抗氧化酶类物质，减轻炎症及氧化刺激，从而减轻组织损伤。因此认为间充质干细胞的培养上清同样具有一定的组织修复能力^[13]。

课题组将胎盘胎儿侧间充质干细胞作为研究对象，是因其具有间充质干细胞的特性，且来源易得，培养体系稳定等特征。另外前期研究证实了胎盘胎儿侧间充质干细胞培养上清具有一定的清除活性氧自由基的能力，且本身具有一定的抗氧化酶活性，其总抗氧化能力相当于100 μmol/L维生素C^[14]。故实验旨在检测间充质干细胞培养上清是否可以对氧化损伤的肺脏上皮细胞起到保护或者修复作用。

材料方法

1.1 设计 细胞学实验。

1.2 时间及地点 于2016年11月至2017年5月在宁夏医科大学总医院人类干细胞研究所完成。

1.3 材料

实验用细胞：①胎盘间充质干细胞：取自宁夏医科大学总医院干细胞研究所胎盘干细胞库；②人肺脏上皮细胞A549细胞系：取自中科院上海细胞库

主要仪器和试剂：间充质干细胞培养基、间充质干细胞培养基消化酶、终止液、冻存液、基质胶(美国STEM CELL公司)；DMEM高糖培养基、胎牛血清、Tryple、GlutaMAX、青链霉素(美国Gibco公司)；Nrf2(S40)、Keap1、β-actin抗体(美国abcam公司)；Bax、Bcl-2、Caspase3(美国Proteintech公司)；体积分数3%过氧化氢(烟台市双双化工有限公司)；CCK-8细胞增殖及毒性检测试剂盒(日本株式会社同仁化学研究所)；AnnexinFITC/PI双染试剂盒(美国BD公司)；流式细胞仪(日本SYSMEX公司)；荧光显微镜(日本OLYMPUS)。

1.4 实验方法

1.4.1 建立肺细胞上皮氧化损伤模型 A549细胞系按常规培养于DMEM高糖培养基中，当细胞融合度达80%时使用tryple进行消化传代，制成细胞悬液，以5×10³/孔种植于96孔板中，放入培养箱中贴壁培养12 h。培养结束后，将终浓度为200，400，500，600，800 μmol/L的过氧化氢培养基溶液，分别对96孔板中的细胞进行6，12，24 h的氧化刺激，刺激结束后向每孔加入40 g/L CCK-8试剂，37 ℃避光孵育2 h后测定隔空吸光度值，计算出经过不同时长、不同浓度刺激后细胞的存活率，每组实验平行重复5次，得出存活率为50%时的过氧化氢浓度及刺激时长作为氧化损伤模型的最适条件。

1.4.2 Hochest33258染色验证模型有效性 A549细胞制成细胞悬液，1.5×10⁵/孔接种在铺好爬片的6孔板中，分别设置正常组和损伤组，正常组细胞不做任何处理，损伤组按上得的最适条件对细胞进行氧化刺激。氧化损伤结束后，去除6孔板内多余培养基，每孔内加入40 g/L多聚甲醛0.5 mL，固定10 min。固定结束后去固定液，加入PBS洗2遍，每次3 min，吸尽液体。再加入0.5 mL Hoechst 33258染色液(5 mg/L)，染色5 min。清洗后进行封固，并在荧光显微镜下观察2组细胞的损伤情况。

1.4.3 Western Blot验证模型有效性 分组方法同上，刺激结束后去除培养液，用预冷的PBS清洗3次，再各孔中加入200 μL蛋白裂解液，放置冰上裂解15 min，用刮板将6孔板内细胞及裂解液一同刮下，至于1.5 mL EP管中，放置4 ℃冰箱内的摇床中充分裂解1 h。结束后放入4 ℃离心机，14 000 r/min离心15 min，吸取上清转移至新的EP管中，按比例加入上样缓冲液后-80 ℃保存备用。制备12%分离胶，上样后进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后采用恒定电压100 V转膜1 h。转膜结束后，取出聚偏二氟乙烯膜，室温下使用5%脱脂牛奶封闭1 h。4 ℃条件下孵育一对凋亡基因Bax(Proteintech No.12789-1-AP)，Bcl-2(Proteintech No.50599-2-Ig)的一抗过夜，洗膜后室温下孵育羊抗兔二抗(Proteintech No.SAOOO1-2)1 h，再次洗膜后进行曝光显影，以β-actin作为内参，计算各蛋白的相对表达量。

1.4.4 流式细胞术检测细胞凋亡率 将A549细胞系分为3组：损伤组，仅对其进行过氧化氢刺激；维生素C组，对其进行过氧化氢刺激后，用含100 μmol/L的维生素C培养基进行培养24 h；上清组，复苏P1代人胎盘胎儿侧间充质干细胞至培养皿中，使用无血清培养基培养(美国Stem Cell公司)至80%融合后收集上清，将细胞部分冻存后进行传代。将人胎盘胎儿侧间充质干细胞培养至P3代，每代次培养时间为48 h，细胞生长密度达80%时收集上清，离心去除杂质及细胞碎片后按需分装后，于-80 ℃冰箱冻存。在使用过氧化氢对对A549细胞系进行过氧化氢刺激后，将收集的培养上清与损伤的A549细胞进行共培养24 h。培养结束后收集各组培养上清至15 mL离心管中，并消化各组细胞至同一离心管中，1 000 r/min离心5 min，去除上清后用冷PBS洗涤细胞2次，然后以1×10⁹ L^-1的细胞浓度将细胞重悬于结合缓冲液中。将100 μL的溶液(1×10⁵个细胞)转移到1.5 mL培养管中。加入5 μL FITC Annexin V和5 μLPI，轻轻涡旋细胞，并在室温(25 ℃)下在黑暗中孵育15 min。向每个管中补加入1 mL的结合缓冲液，上机对各组细胞进行凋亡率检测。

1.4.5 Western Blot检测凋亡相关蛋白及抗氧化信号通路相关蛋白的表达 3组培养结束后提取蛋白，利用Western Blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase3，以及抗氧化经典信号通路Nrf2-Keap1-ARE相关蛋白Nrf2、Keap1表达情况(提取蛋白及Western Blot方法参照1.4.3)并比较组间差异。

1.5 主要观察指标 ①当肺脏上皮细胞存活率为50%时，过氧化氢浓度及刺激时长；②Hochest33258染色后正常组和损伤组细胞形态差异；③Western Blot验证模型有效性；④流式细胞术检测的细胞凋亡率；⑤Western Blot检测的凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase3，以及抗氧化经典信号通路Nrf2-Keap1-ARE相关蛋白Nrf2、Keap1的表达情况。

1.6 统计学分析 实验数据以x(_)±s表示，采用SPSS 22.0统计软件进行统计分析，组间比较采用两独立样本t 检验，P < 0.05认为差异有显著性意义。

讨论

间充质干细胞作为理想的组织修复的种子，具有强大的免疫调节能力以及抗氧化能力而被广泛重已经用于多种疾病的治疗^[15-18]。Liu等^[19]发现间充质干细胞可以显著降低血糖和糖化血红蛋白水平，改善C肽水平和β细胞功能，减少全身炎症标志物和T淋巴细胞计数；Jang等^[20]将间充质干细胞用于酒精性肝硬化患者的治疗，发现其有助于减轻肝纤维化水平；Hare等^[21]将异体和自体骨髓间充质干细胞通过心内膜注射到心力衰竭的患者体内，发现其可以显著改善患者心功能。除此之外，间充质干细胞在肺纤维化、支气管发育不全、急性呼吸窘迫综合征等多种肺疾病中取得了较大的进步^[22-23]。间充质干细胞应用于肺脏疾病中可以明显减轻其炎症反应及氧化应激程度，从而减轻肺脏损伤程度^[24-26]。

虽然近年来间充质干细胞给难治性疾病患者带来了新的希望和福音，但是临床上也存在一系列的问题，比如间充质干细胞虽然具有较低的免疫原性，仍成瘤风险^[27-28]。而且有研究发现间充质干细胞发挥抗氧化和抗炎功能主要依赖于旁分泌功能，在培养过程中将细胞因子，抗氧化酶类物质分泌到外周，此类小分子物质在适当的贮存条件下持续存在于培养上清中并适时发挥作用^[29-32]。由于过氧化氢是一类活性氧，极易透过细胞膜对细胞造成损伤。在适宜浓度的过氧化氢诱导下，细胞 DNA 被损伤，相关的基因表达发生变化，细胞内蛋白质和脂质进而被损伤，但这种损伤不会造成细胞死亡，而且在适宜的保护剂作用下，这些损伤还有可能被修复^[33]，因此使用过氧化氢成为一种经典的氧化损伤药物。而不同细胞系对于过氧化氢耐受程度不同，因此建立肺脏上皮细胞的氧化损伤模型是实验重要的前期准备工作之一。实验第一部分旨在利用过氧化氢作为刺激源，以细胞存活率、细胞形态及凋亡相关蛋白为判断指标，建立肺脏上皮细胞的氧化损伤模型而应用于下一步实验。实验的结果显示，使用600 μmol/L的过氧化氢对肺脏上皮细胞进行刺激，细胞存活率为56.41%，使用Hocheest33258染色后发现损伤组的部分细胞发生明显凋亡，胞质完整性降低，细胞核出现不同程度的核碎裂、核溶解现象，且可以加细胞核内的荧光呈现浓染致密的颗粒块状。Western Blot对凋亡相关蛋白的检测显示，与正常组对比，损伤组显著促进Bax蛋白表达，抑制BCL-2蛋白表达，提示模型可以用于后续实验。

实验的第二部分，将人胎盘胎儿侧间充质干细胞培养上清作用于经过损伤的肺脏上皮细胞后，与损伤组相比可以降低细胞凋亡率、抑制细胞凋亡蛋白的表达、增强抗氧化通路关键转录因子Nrf2的表达，且人胎盘胎儿侧间充质干细胞培养上清的抗氧化作用高于100 μmol/L的维生素C。结果表明人胎盘胎儿侧间充质干细胞培养上清可以保护肺脏上皮细胞，对抗H₂O₂造成的氧化应激损伤，且其作用机制与激活Nrf2-Keap1-ARE信号通路相关。虽然Western Blot证实了培养上清对于氧化损伤的肺脏上皮细胞的积极作用，但在流式细胞术Annexin V?FITC/PI双染检测细胞凋亡的过程中发现，维生素C组和上清组与损伤组相比，凋亡率呈降低趋势，但是除上清组的晚期凋亡率和综合凋亡率与损伤组相比具有统计学意义以外，其余均无差异。探究其原因，认为过氧化氢损伤后的肺脏上皮细胞因发生凋亡的程度不同而在后期呈现增殖能力的差异，3组细胞经过24 h的培养后，优势细胞大量增殖，而凋亡严重的细胞不发生增殖或直接死亡，所以在流式细胞术对凋亡细胞的检测过程中，活细胞数占了较大比率，而凋亡细胞比率降低，这就合理解释了Western Blot在分子水平上可以检测组间的明显差异，而流式细胞术在细胞水平上的检测差异不明显。因此在下一阶段的实验中，需要适当优化实验条件。

综上所述，人胎盘胎儿侧间充质干细胞培养上清具有抗氧化能力，且在一定程度上可以减轻过氧化氢所致的细胞凋亡，其作用机制与激活Nrf2-Keap1-ARE信号通路相关。提示在间充质干细胞应用于临床的过程中，除细胞本身外，其培养上清同样具有潜在的治疗价值。

人胎盘胎儿侧间充质干细胞无血清培养上清对肺脏上皮细胞氧化应激的保护作用

Protective role of serum-free supernatant of human placental fetal mesenchymal stem cells against oxidative stress injury to lung epithelial cells

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