miR-15b通过靶向ABCG2信号通路抑制胶质瘤干细胞迁移及侵染

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.33.010

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (33): 5305-5312.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.33.010

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miR-15b通过靶向ABCG2信号通路抑制胶质瘤干细胞迁移及侵染

刘义锋¹，张保朝¹，温昌明¹，闻公灵¹，周国平²，张敬伟³，贺海发⁴，汪宁¹，李巍⁵

郑州大学附属医院(南阳医院)南阳中心医院，¹神经内科，²神经外科，³肿瘤内科，⁴病理科，河南省南阳市 473000；⁵解放军沈阳军区总医院神经内科，辽宁省沈阳市 110016

修回日期:2017-06-25 出版日期:2017-11-28 发布日期:2017-12-01
通讯作者: 张保朝，硕士生导师，主任医师，南阳市中心医院神经内科，河南省南阳市 473000
作者简介:刘义锋，男，1982年生，河南省南阳市人，汉族，2012年郑州大学毕业，硕士，主治医师，主要从事神经病学方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金青年科学基金资助项目(81401097)

miR-15b suppresses glioma stem cell migration and invasion by targeting ABCG2 signaling pathway

Liu Yi-feng¹, Zhang Bao-chao¹, Wen Chang-ming¹, Wen Gong-ling¹, Zhou Guo-ping², Zhang Jing-wei³, He Hai-fa⁴, Wang Ning¹, Li Wei⁵

¹Department of Neurology, ²Department of Neurosurgery, ³Department of Oncology, ⁴Department of Pathology, Affiliated Hospital of Zhengzhou University (Nanyang Hospital), Nanyang Central Hospital, Nanyang 473000, Henan Province, China; ⁵Department of Neurology, General Hospital of Shenyang Military Region, Shenyang 110016, Liaoning Province, China

Revised:2017-06-25 Online:2017-11-28 Published:2017-12-01
Contact: Zhang Bao-chao, Master’s supervisor, Chief physician, Department of Neurology, Affiliated Hospital of Zhengzhou University (Nanyang Hospital), Nanyang Central Hospital, Nanyang 473000, Henan Province, China
About author:Liu Yi-feng, Master, Attending physician, Department of Neurology, Affiliated Hospital of Zhengzhou University (Nanyang Hospital), Nanyang Central Hospital, Nanyang 473000, Henan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China for the Youth, No. 81401097

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
miR-15b在胶质瘤干细胞侵染过程中的作用：利用细胞模型实验评估miR-15b表达对胶质瘤干细胞细胞迁移和侵染的影响，胶质瘤干细胞转染miR-15b模拟物或抑制物以上调或下调miR-15b表达。结果证明上调miR-15b能抑制胶质瘤干细胞细胞迁移。与此相反，下调miR-15b表达增强了胶质瘤干细胞细胞迁移和侵染能力。这些结果提示在胶质瘤干细胞中，miR-15b的表达与细胞迁移和侵染密切相关。
ABCG2：在胶质瘤干细胞中ABCG2是miR-15b的另外一个靶基因。在神经胶质瘤中，ABCG2与病理进程呈正相关，并且是决定药物治疗效果的重要分子。后来的研究表明，ABCG2在胶质瘤干细胞中过表达，并保护干细胞免于死亡和保持体内平衡。

摘要
背景：miR-15b在肿瘤起始和发展过程中发挥重要作用，于是作者推测miR-15b可能参与调解胶质瘤干细胞细胞的迁移和侵染，而这目前尚无相关报道，并且其机制也不清楚。
目的：探讨miR-15b对胶质瘤干细胞迁移和侵染的影响及相关分子机制。
方法：实时荧光定量PCR检测胶质瘤组织、正常成人脑组织，胶质瘤干细胞及非胶质瘤干细胞中miR-15b的表达情况。①分别以ABCG2特异性siRNA、对照siRNA转染胶质瘤干细胞；②分别以miR-15抑制物、miR-15模拟物及miR-对照分别转染胶质瘤干细胞。转染后48 h，Transwell检测细胞迁移和侵染能力，ELISA法和明胶酶谱实验检测细胞培养上清中基质金属蛋白酶2/9蛋白量及活性变化。将胶质瘤干细胞及非胶质瘤干细胞分别注入裸鼠皮下，30 d内观察成瘤情况。
结果与结论：①与正常脑组织相比，胶质瘤中miR-15b的表达明显较低且与胶质瘤所处阶段呈负相关性。与非胶质瘤干细胞相比，胶质瘤干细胞中miR-15b的表达显著下调；②与miR-对照组比较，miR-15b模拟物组细胞迁移及侵染能力显著下降(P < 0.01)，miR-15b抑制物组细胞迁移及侵染能力显著增加(P < 0.01)；TargetScan生物学软件预测表明ABCG2为miR-15b潜在的靶基因；③与对照siRNA组比较，ABCG2 siRNA组细胞迁移及侵染能力显著下降(P < 0.01)；④ELISA检测表明，上调miR-15b基因表达显著抑制基质金属蛋白酶2/9蛋白的表达；⑤ELISA法和明胶酶谱实验检测结果表明，ABCG2 siRNA转染可显著抑制基质金属蛋白酶2/9蛋白的活性，但不影响其表达量；⑥裸鼠体内实验表明，胶质瘤干细胞具有更强的成瘤能力；⑦结果表明，miR-15b通过靶作用于ABCG2调控胶质瘤干细胞的迁移和侵染，上调miR-15b表达可抑制胶质瘤干细胞的迁移和侵染。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-9066-0392(刘义锋)

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 胶质瘤干细胞, miR-15b, 迁移, 侵染, ABCG2, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: miR-15b plays an important role in the initiation and development of tumors, based on which, we speculate that miR-15b may be involved in the migration and invasion of glioma stem cells (GSCs). However, there is no relevant report and the mechanism of action is also unclear.
OBJECTIVE: To identify the effects of miR-15b on the migration and invasion of GSCs and the mechanisms involved in this process.
METHODS: Quantitative PCR was performed to evaluate the expression of miR-15b in the gliomas tissues, normal brain tissues, GSCs and non-GSCs. After knockdown of ATP-binding cassette superfamily G member 2 (ABCG2) by ABCG2 specific siRNA, Transwell assay was performed to determine the effect of ABCG2 on GSCs migration and invasion. Additionally, the GSCs were transfected with miR-15b mimics or inhibitor to up-regulate or down-regulate the expression of miR-15b. At 48 hours after transfection, Transwell assay was used to detect the effect of miR-15b on GSCs migration and invasion; ELISA and gelatin zymography assays were performed to determine the matrix metalloproteinase-2/-9 (MMP-2/-9) expression and activity after treatment with miR-15b. CD133-positive or non-CD133-positive cells were directly injected subcutaneously into nude mice. Tumor formation was observed within 30 days after injection.
RESULTS AND CONCLUSION: miR-15b was significantly down-regulated in gliomas tissues compared with normal brain tissues, which was negatively correlated with the stage of gliomas. In addition, miR-15b was significantly down-regulated in GSCs compared with non-GSCs. Up-regulation of miR-15b significantly reduced the migration and invasion ability of GSCs (P < 0.01), and down-regulation of miR-15b significantly enhanced the cell migration and invasion of GSCs (P < 0.01). By target prediction analysis, we obtained that ABCG2 was a potential target gene of miR-15b. Luciferase assay confirmed that miR-15b targeted ABCG2 directly, and migration and invasion of GSCs were dramatically reduced by ABCG2 siRNA (P < 0.01). ELISA results showed that up-regulation miR-15b significantly inhibited MMP-2/-9 expression. ELISA and gelatin zymography assay results showed that ABCG2 siRNA did not affect MMP-2/-9 expression, but significantly inhibited the activity of MMP-2/-9. In the in vivo tumor model, GSCs were more tumorigenic as compared with non-GSCs from the same tumor in vivo. To conclude, miR-15b regulates the migration and invasion of GSCs by targeting the ABCG2 signaling pathway, and up-regulation of miR-15b can suppress the migration and invasion of GSCs.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, MicroRNAs, Cell Migration Assays, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

刘义锋，张保朝，温昌明，闻公灵，周国平，张敬伟，贺海发，汪宁，李巍. miR-15b通过靶向ABCG2信号通路抑制胶质瘤干细胞迁移及侵染[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(33): 5305-5312.

Liu Yi-feng, Zhang Bao-chao, Wen Chang-ming, Wen Gong-ling, Zhou Guo-ping, Zhang Jing-wei, He Hai-fa, Wang Ning, Li Wei. miR-15b suppresses glioma stem cell migration and invasion by targeting ABCG2 signaling pathway[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(33): 5305-5312.

图/表（结果） 3

2.1 qPCR检测人原发性神经胶质瘤细胞和对应的恶性胶质瘤干细胞中miR-15b和ABCG2的表达 研究分析了495例胶质瘤患者的TCGA多行性成胶质细胞瘤数据和10个正常脑组织的信息，以探讨miR-15b表达水平。结果表明多行性成胶质细胞瘤中miR-15b表达量显著低于正常脑组织(P < 0.000 1)，见图1A。为进一步探讨胶质瘤组织样品中miR-15b的表达是否降低，茎环-qPCR检测了30个不同时期的胶质瘤样品中miR-15b的表达情况。结果如图1B所示，胶质瘤样本中miR-15b的表达显著下调，并且其表达水平与胶质瘤所处阶段呈负相关，这表明多行性成胶质细胞瘤(Ⅳ期)患者中miR-15b的表达量是最低的。然后，探讨了miR-15b和ABCG2在非胶质瘤干细胞和对应的胶质瘤干细胞中表达的区别。结果表明，与非胶质瘤干细胞相比，胶质瘤干细胞中的miR-15b表达量更低，见图1C。研究进一步分析了557例胶质瘤患者和10个正常脑组织的TCGA 多行性成胶质细胞瘤数据，以探讨ABCG2的表达情况。结果表明，多行性成胶质细胞瘤中ABCG2的表达量略有上升，但差异无统计学意义(P > 0.05)，见图1D，这与以前的报道相反^[11-12]。研究也利用qPCR分析了正常脑组织和神经胶质瘤样本中ABCG2的表达情况。结果表明，胶质瘤样本中ABCG2表达量更高并且与肿瘤所处的阶段呈正相关性，见图1E。体外和体内实验检测结果表明，胶质瘤干细胞中ABCG2的表达水平比非胶质瘤干细胞中分别高2.26倍和3.27倍，见图1F，G。

2.2 miR-15b模拟物和抑制物对原发性胶质瘤干细胞迁移和侵染的影响 使用化学合成的miR-15b模拟物和抑制物转染原发性胶质瘤干细胞，以上调和下调胶质瘤干细胞细胞中miR-15b的表达。见图2A所示，转染miR-15b抑制物后，miR-15b表达量显著降低，而转染了模拟物组的miR-15b表达量显著升高。见图2B、D所示，与miR-对照组相比，miR-15b模拟物组细胞迁移能力下降了约50%，而miR-15b抑制物组细胞迁移能力增加了2.1倍。Transwell侵染检测结果表明miR-15b模拟物组细胞的侵染能力下降了约23%，而miR-15b抑制物组的细胞侵染能力增加了约1.5倍，见图2C、E。这些结果明miR-15b在调控人胶质瘤干细胞细胞迁移和侵染方面发挥重要的作用。

2.3 miR-15b调控胶质瘤干细胞中基质金属蛋白酶2/9活性 有研究证明，包括胶质瘤干细胞在内的高阶段的神经胶质瘤中基质金属蛋白酶2/9的表达水平较高，其在这些部位的表达有利于胶质瘤的侵染和扩散^[13]。因此，胶质瘤干细胞中基质金属蛋白酶2/9表达量的变化可能与miR-15b调控的细胞侵染和扩散有关。

为探讨上调或下调miR-15b表达是否影响胶质瘤干细胞中基质金属蛋白酶2/9的表达，胶质瘤干细胞细胞转染miR-15b模拟物或抑制物后，通过ELISA检测了基质金属蛋白酶2/9的表达情况。结果表明，上调miR-15b表达显著抑制胶质瘤干细胞中基质金属蛋白酶2/9的表达(图3A)，而下调miR-15b表达显著增加基质金属蛋白酶2/9的表达(图3B)，上述结果表明miR-15b能显著影响胶质瘤干细胞中基质金属蛋白酶2/9蛋白表达。

为验证基质金属蛋白酶2或基质金属蛋白酶9是否是miR-15b的一个靶基因，首先使用TargetScan软件进行分析，发现在基质金属蛋白酶2/9基因的3’UTR区域没有miR-15b预测的结合位点。随后构建基质金属蛋白酶2/9 3’UTR序列的荧光素酶报告载体(野生型：pGL3-WT-MMP-2-3’UTR和pGL3-WT-MMP-9-3’UTR)和miR-15b结合位点突变了的突变质粒(pGL3-MUT- MMP-2-3’UTR和pGL3-MUT-MMP-9- 3’UTR)，共转染后检测结果表明，与突变型对照组相比， miR-15b模拟物没有使野生型质粒转染组的荧光素酶活性显著下降，表明基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9均不是miR-15b的靶基因(图3C，D)。这些结果表明miR-15b负调控基质金属蛋白酶2/9，但不直接靶向基质金属蛋白酶2/9 mRNA转录。

2.4 ABCG2是miR-15b的靶基，其能调控胶质瘤干细胞细胞迁移和侵染 ABCG2有助于维持GSC-样特征和固有的药物抗性^[14]。过表达ABCG2能促进多种肿瘤迁移及侵染^[15-17]。然而，ABCG2在胶质瘤干细胞中的功能尚且未知。为探讨ABCG2对胶质瘤干细胞迁移和侵染的影响，胶质瘤干细胞转染ABCG2特异性siRNA以敲低ABCG2的表达，然后进行细胞迁移检测。结果表明，与对照siRNA相比，ABCG2 siRNA转染后24 h显著抑制胶质瘤干细胞细胞迁移(图4A)。研究利用Transwell检测进一步分析了敲低ABCG2表达对细胞侵染的影响，结果发现与对照siRNA相比，ABCG2 siRNA转染后显著抑制胶质瘤干细胞细胞侵染(图4B)。

为探讨miR-15b是否影响ABCG2的表达，胶质瘤干细胞转染miR-15b模拟物或抑制物，然后进行Western blot检测。结果表明上调miR-15b表达抑制ABCG2的表达，而下调miR-15b表达则促进ABCG2的表达(图4C)。这些结果表明miR-15b能调控胶质瘤干细胞中ABCG2的表达。为探讨ABCG2是否是miR-15b的直接的靶基因，本实验根据软件预测结果构建了含有预测的miR-15b靶位点的ABCG2 3’UTR的荧光素酶报告载体。miR-15b和预测的靶基因的序列比对结果如图4D所示。荧光素酶报告质粒和miR-15b模拟物或随机miRNA对照共转染胶质瘤干细胞。检测结果表明，与对照组相比，miR-15b模拟物和荧光素酶报告质粒共转染后，荧光素酶活性显著下降(图4E)。这些结果表明ABCG2是miR-15b的直接靶基因。

2.5 敲低ABCG2表达抑制基质金属蛋白酶2/9蛋白活性而不影响其蛋白表达量 上面的结果证明ABCG2是miR-15b的靶基因。接下来的实验试图探讨miR-15b是否通过ABCG2调节基质金属蛋白酶的表达。为明确ABCG2和基质金属蛋白酶2/9蛋白之间的关系，胶质瘤干细胞转染ABCG2 siRNA后，ELISA检测基质金属蛋白酶2/9的表达量。结果表明，ABCG2 siRNA组和阴性对照组相比，基质金属蛋白酶2/9的蛋白量没有显著区别(图5A，B)。进一步通过明胶酶谱检测分析胶质瘤干细胞转染ABCG2 siRNA后基质金属蛋白酶2/9活性变化情况。结果表明，敲低ABCG2表达显著抑制胶质瘤干细胞中基质金属蛋白酶2/9活性(图5C，D)。这些结果表明ABCG2显著影响胶质瘤干细胞中基质金属蛋白酶2/9的蛋白活性，而不影响其表达量。

2.6 体内肿瘤模型实验结果 从18 d开始，CD133阳性细胞组肿瘤体积明显大于非CD133阳性细胞组，见图6。

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引言

恶性神经胶质瘤是脑部最常见的原发性恶性肿瘤，具有侵略性、高度侵染性和神经破坏性。虽然临床上使用外科手术、化疗和放疗的联合治疗等多种手段治疗恶性胶质瘤患者，多行性成胶质细胞瘤患者的平均存活时间只有不到2年^[1]。到目前为止，尚无能有效治疗多行性成胶质细胞瘤的药物。因此，急需对传统的治疗手段进行改进或开发新的独特的治疗手段。

肿瘤干细胞假设吸引了众多研究者的目光，因为其可能是治疗包括多行性成胶质细胞瘤在内肿瘤的独特细胞靶标^[2]。越来越多的研究证明，胶质瘤含有数量不多的有治疗抗性的胶质瘤干细胞，并且肿瘤的复发被认为与胶质瘤干细胞有关^[3-4]。恶性胶质瘤细胞能轻易地侵入周围正常脑组织，造成肿瘤频繁复发，使得病程得以推进并引起较高的死亡率。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)途径是控制胶质瘤干细胞分化的至关重要方式^[5]。有报道证明在神经胶质的不同瘤阶段miRNA显著失调表达。如miR-145是一种肿瘤抑制因子，其与胶质瘤的致病性有关，抑制miR-145表达可致胶质瘤细胞增殖和侵染力增强^[6]。最近的研究表明miRNA与茎状细胞分化有关^[7]。miR-15b能通过靶向多种细胞骨架物质和全能性因子，导致原发性子宫内膜间质细胞的干细胞表型受到抑制。这些研究表明miR-15b在肿瘤起始和发展过程中发挥重要作用。于是，作者推测miR-15b可能参与调解胶质瘤干细胞细胞的迁移和侵染，而这目前尚无相关报道，并且其机制也不清楚。ATP结合转运蛋白G家族成员2(ATP-binding cassette superfamily G member 2，ABCG2)是一种ATP结合盒式转运蛋白，与癌症干细胞的表型有关。Wang等^[8]研究表明在人胰腺癌细胞中，ABCG2能调控细胞迁移和侵染，但不影响细胞增殖、细胞周期进程和凋亡。Xu等^[9]证实ABCG2在神经胶质瘤中过表达，并且ABCG2阳性细胞比例接近100%。当前的研究探讨了miR-15b在胶质瘤干细胞致病过程中的作用及miR-15b介导的胶质瘤干细胞发育异常分子机制。

材料方法

1.1 设计 细胞学实验分析。

1.2 时间及地点 实验于2015年8月至2016年2月在南阳市中心医院病理实验室完成。

1.3 材料

恶性胶质瘤组织：从被确诊为世界卫生组织定义的Ⅳ期胶质瘤的成年患者胶质瘤组织中获取恶性胶质瘤组织。相关实验提前告诉患者并征得其同意。

实验动物：6周龄雌性裸鼠20只，体质量80 g左右，购自解放军第四军医大学实验动物中心，许可证号：SCXK2014-002。所有实验动物符合卫生部一级动物标准，得到动物伦理学委员会批准。

实验试剂和仪器：DMEMF12培养基、胎牛血清、青霉素/链霉素(Hyclone，美国)；人重组表皮生长因子、人重组碱性成纤维细胞生长因子、人白血病抑制因子(Chemicon，美国)；B27(Life Technologies，美国)；CD133/2-PE(Miltenyi Biotech，美国)；抗-GFAP单克隆抗体(Dako，丹麦)；抗-ABCG2抗体、MMP-2/9抗体(Santa Cruz Biotechnology，美国)；抗-α-tubulin抗体(Sigma- Aldrich，美国)；FuGENE HD6转染试剂(Roche，德国)；ELISA检测试剂盒(R&D，英国)；明胶酶谱检测试剂盒(碧云天生物技术研究所，中国)；ABCG2特异性siRNA(吉玛，中国)；Transwell小室(Corning，美国)；流式细胞仪(BD公司，美国)；增强型化学发光显色系统(Amersham，美国)。

1.4 实验方法

1.4.1 原发性恶性胶质瘤细胞的培养与处理 根据以前描述的方法对胶质瘤组织进行机械破碎，以获取恶性胶质瘤细胞^[10]。获取的恶性胶质瘤细胞用于实验之前，先在含体积分数2%胎牛血清的培养基中亚培养1周，以避免啮齿动物纤维母细胞污染，然后细胞在含体积分数10% 胎牛血清和抗生素的正常培养基中培养。通过形态学观察和抗-GFAP单克隆抗体染色确认所获取细胞的胶质源性。培养的原发性星形胶质细胞源自一个轻微的脑损伤患者脑组织碎片，进行实验之前得到患者同意。PBS冲洗后去除灰质，切碎并分散。原发性星形胶质细胞的培养按Darling描述的方法进行^[10]。qPCR检测胶质瘤组织、正常成人脑组织，胶质瘤干细胞及非-胶质瘤干细胞中miR-15b与ABCG2表达。

1.4.2 CD133阳性细胞的磁性分离 将恶性胶质瘤细胞分散成单个并用含0.5%牛血清白蛋白和2 mmol/L EDTA的PBS重悬起来。微磁珠进行磁性标记，然后恶性胶质瘤细胞使用磁细胞分离柱分离阳性磁细胞。将细胞经CD133/2-PE染色后进行细胞流式分析。肿瘤细胞用含有浓度均为20 μg/L的人重组表皮生长因子、人重组碱性成纤维细胞生长因子、人白血病抑制因子和2%B27的适合干细胞生长的DMEMF12培养基培养。这些培养条件使肿瘤细胞分化，表达特征和遗传突变上改变很少，从而保持原发性肿瘤的分子特征。

1.4.3 CD133阳性细胞的转染 转染前1 d，将细胞用不含抗生素的培养基以1.0×10⁵/孔的密度铺板。细胞用含有质量浓度均为20 μg/L的人重组表皮生长因子、人重组碱性成纤维细胞生长因子、人白血病抑制因子和2% B27的适合干细胞生长的DMEMF12培养基培养。当CD133阳性原发性胶质瘤细胞汇合度达到70%-90%时，根据FuGENE HD6转染试剂说明书要求进行转染：①实验组分别以ABCG2特异性siRNA、对照siRNA转染CD133阳性细胞，siRNA转染终浓度均为100 nmol/L，空白对照组只加入与实验组等体积的转染试剂，转染后6 h，更换为正常培养基；②以miR-15抑制物、miR-15模拟物及miR-对照分别转染CD133阳性细胞，空白对照组只加入与实验组等体积的转染试剂，miRNA的转染终浓度均为100 nmol/L，转染后6 h，更换为正常培养基。Western blot检测转染后的CD133阳性胶质瘤细胞中ABCG2蛋白表达水平。

1.4.4 细胞迁移与侵染检测 Transwell小室用于胶质瘤干细胞迁移与侵染检测。转染后48 h，胰酶消化并收集细胞，制备细胞悬液。将胶质瘤干细胞用无血清培养基以5×10³/孔的密度铺于上层腔室。然后，含体积分数20%胎牛血清的培养基加入下层腔室。孵育24 h后，用棉签将非迁移或非侵染细胞从上层腔室移走，而迁移和侵染的细胞也从下层腔室移走。从上层和下层腔室得到的细胞均用0.1%结晶紫在37 ℃染色30 min，PBS洗涤3次。被染色的细胞在33%冰浴乙酸中震荡孵育10 min。通过读取样品在570 nm处的吸光度值计算细胞侵染数。每个实验独立重复3次，与miR-对照组或对照siRNA比较，计算迁移或侵染的细胞数相对值。

1.4.5 Western blot分析 转染后48 h，为检测目的蛋白表达量，用裂解液(137 mmol/L NaCl、15 mmol/L EDTA、0.1 mmol/L原钒酸钠、15 mmol/L MgCl₂、0.1% Triton X-100、25 mmol/L MOPS、100 μmol/L苯甲基磺酰氟和20 μmol/L亮抑酶酞，调节pH至7.2)提取可溶性蛋白。从细胞中提取的总蛋白样品跑SDS-PAGE。分离的蛋白样品转入PVDF膜。PVDF膜经2.5%脱脂奶粉封闭液室温封闭1 h后，用针对ABCG2的Ⅰ抗(1∶200稀释)4 ℃轻摇孵育过夜。PBST洗膜3次，然后PVDF膜用HRP标记的Ⅱ抗室温轻摇孵育1 h。蛋白条带用增强型化学发光显色系统进行显色，α-tubulin作为上样的内参蛋白(1∶5 000稀释)。

1.4.6 ELISA检测细胞培养上清中基质金属蛋白酶2/9的水平 转染后48 h，收集各组细胞培养上清，用PBS稀释经特定处理的上清样品，加入96孔板内，在40 ℃条件下孵育直到96孔板变干燥为止。PBS洗3次后，2%牛血清白蛋白室温封闭1 h。PBS洗3次，0.05% PBST稀释MMP-2/9抗体，加入96孔板内，37 ℃孵育1 h。孵育结束后，PBS洗3次，然后用HRP标记的Ⅱ抗孵育4 h。孵育完成后，PBS洗3次，加入TMB底物。读取样品在450 nm处的吸光度值。

1.4.7 明胶酶谱检测 按1.4.1①分组转染后48 h，收集各组细胞培养上清，用于基质金属蛋白酶2/9活性检测。使用明胶酶谱检测试剂盒检测培养上清中基质金属蛋白酶2/9活性。经特定处理的培养上清与SDS上样缓冲液混合，70 V条件下跑0.1%明胶-10%SDS-PAGE 2 h。然后，2.5% Triton X-100洗胶2次，每次1.5 h，以去除SDS，随后胶在50 mmol/L Tris-HCl、200 mmol/L NaCl、5 mmol/L CaCl₂、0.02% Brij-35分析液中孵育过夜。上述处理完成后，0.5%考马斯亮蓝染色2 h，然后，在脱色液中脱色0.5 h。胶用0.7%乙酸脱色，在蓝色背景下，胶上的明胶酶活性以一片光亮区域呈现出来，表明此处明胶已经被明胶酶消化。

1.4.8 体内肿瘤模型 将细胞浓度为2×10¹⁰L^-¹的CD133阳性或非CD133阳性细胞分别通过皮下注射的方式注射入裸鼠左右侧，观察肿瘤生长，每隔3 d用卡尺测量肿瘤体积。皮下注射后30 d处死肿瘤携带小鼠，切除体内的肿瘤并测量肿瘤体积(mm³)。肿瘤体积按照如下公式计算：体积= 长×宽²× 0.5。

1.5 主要观察指标 ①胶质瘤组织、正常成人脑组织，胶质瘤干细胞及非-胶质瘤干细胞中miR-15b的表达情况；②胶质瘤干细胞转染miR-15b模拟物或抑制物后，胶质瘤干细胞细胞迁移和侵染能力的变化；③裸鼠体内过表达miR-15b后，体内肿瘤生长情况；④miR-15b模拟物和ABCG2 mRNA的3’UTR报告质粒共转染胶质瘤干细胞后，荧光素酶活性变化；⑤特定处理后的胶质瘤干细胞细胞培养上清中基质金属蛋白酶2/9蛋白量及活性变化；⑥ABCG2特异性siRNA敲低ABCG2表达后，胶质瘤干细胞细胞迁移和侵染变化。

1.6 统计学分析 利用SPSS 13.0版本对实验数据进行统计分析。数据以x(_)±s表示。所有的数据用Student’s t 检验或ANOVA进行统计分析。以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

恶性胶质瘤细胞迁移和侵染入周围正常脑组织容易导致神经胶质瘤预后不良。最近的研究表明，胶质瘤干细胞介导肿瘤的迁移和侵染^[18]。然而，尚无有效的手段抑制恶性胶质瘤细胞迁移和侵染。miRNAs是一类小的调节RNA，其在多种癌症的进程中发挥重要的调控作用。最近，miRNA途径被证明参与调节干细胞的分化，侵染和凋亡^[19]。在多行性成胶质细胞瘤恶性转化过程中，miR-145b的表达显著下调^[6]。在人神经胶质瘤中，miR-15b对细胞增殖，致肿瘤性转化，恶性进展和侵染具有负面影响，表明miR-15b对于神经胶质瘤疾病的致病性来说是很重要的。然而，miR-15b在胶质瘤干细胞中的表达，功能和机制都未知。研究首次报道了人胶质瘤干细胞中miR-15b的功能和机制。

研究首先检测了不同阶段胶质瘤中miR-15b的表达，发现与正常脑组织相比，胶质瘤中miR-15b的表达明显较低，与胶质瘤所处阶段呈负相关性。进一步，分析了胶质瘤干细胞及对应的非胶质瘤干细胞中miR-15b的表达，发现与非胶质瘤干细胞相比，胶质瘤干细胞中miR-15b的表达显著下调。这些结果表明，miR-15b可能在胶质瘤干细胞的致肿瘤性转化和恶性进程上发挥重要的作用。为探讨miR-15b在胶质瘤干细胞侵染过程中的作用，利用细胞模型实验评估miR-15b表达对胶质瘤干细胞细胞迁移和侵染的影响。胶质瘤干细胞转染miR-15b模拟物或抑制物以上调或下调miR-15b表达。结果证明上调miR-15b能抑制胶质瘤干细胞细胞迁移。与此相反，下调miR-15b表达增强了胶质瘤干细胞细胞迁移和侵染能力。这些结果提示在胶质瘤干细胞中，miR-15b的表达与细胞迁移和侵染密切相关。

然而，在胶质瘤干细胞中，miR-15b介导的细胞迁移和侵染抑制的机制仍然未知。最近的研究表明，基质金属蛋白酶的表达与miRNA介导的神经胶质瘤细胞中干细胞样细胞侵染有关^[13]。基质金属蛋白酶2/9是基质金属蛋白酶的两个主要成员，在神经胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞种已被证明有利于细胞的侵染和转移。之前有研究表明下调基质金属蛋白酶2/9表达介导了miR-125b所诱导的恶性胶质瘤干细胞侵染抑制^[19]。研究结果证明，在胶质瘤干细胞中，上调miR-15b表达能抑制基质金属蛋白酶2/9的表达，而下调miR-15b表达导致基质金属蛋白酶2/9表达升高。这些结果证明基质金属蛋白酶2/9下调表达介导miR-15b所诱导的胶质瘤干细胞侵染抑制，并且也表明基质金属蛋白酶2/9是miR-15b抗肿瘤活性的一个新的显著标志。然而，在接下来的双荧光素酶活性检测实验中，结果表明基质金属蛋白酶2/9均不是miR-15b的靶基因。

研究发现，在胶质瘤干细胞中ABCG2是miR-15b的另外一个靶基因。在神经胶质瘤中，ABCG2与病理进程呈正相关，并且是决定药物治疗效果的重要分子。后来的研究表明，ABCG2在胶质瘤干细胞中过表达，并保护干细胞免于死亡和保持体内平衡^[20]。最近，Omran^[21]研究表明，在侵染性导管癌细胞中，ABCG2表达量增加与乳腺肿瘤进程，侵染和转移密切相关。然而，ABCG2在胶质瘤干细胞细胞迁移和侵染中的作用仍然未知。本研究中，利用ABCG2特异性siRNA敲低ABCG2表后，胶质瘤干细胞细胞迁移和侵染能力均降低。同时，发现过表达miR-15b能抑制ABCG2的表达，而敲低miR-15b表达增加了ABCG2的表达。荧光素酶报告检测证明miR-15b直接靶向ABCG2的3’UTR序列。这些结果表明miR-15b通过靶向ABCG2而在胶质瘤干细胞进程中发挥重要作用。

为探讨miR-15b抑制物诱导的基质金属蛋白酶2/9增加是否是通过ABCG2/MMP-2/9信号通路介导的，利用ABCG2 siRNA敲低ABCG2表达。结果表明，下调ABCG2表达不能导致基质金属蛋白酶2/9表达量减少，而导致基质金属蛋白酶2/9活性下降。这表明miR-15b对ABCG2表达的负调控与基质金属蛋白酶2/9的活性有关。然而，ABCG2调控基质金属蛋白酶2/9活性而非其表达量的机制仍待研究。

总之，研究表明miR-15b-ABCG2-MMP-2/9信号通路调控胶质瘤干细胞细胞迁移和侵染。

miR-15b通过靶向ABCG2信号通路抑制胶质瘤干细胞迁移及侵染

miR-15b suppresses glioma stem cell migration and invasion by targeting ABCG2 signaling pathway

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