不同添加成分对自体移植脂肪细胞活性的影响：进展与现状

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.32.023

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
细胞辅助脂肪移植：是指将基质血管碎片中的细胞群加入脂肪中，以活细胞进行脂肪移植，此过程即为细胞辅助脂肪移植技术。随着脂肪移植的发展，出现了脂肪干细胞或其他添加成分的辅助脂肪移植技术，现已广泛应用于临床。
复合物缓释体：是指将药物加入透明质酸等物质中形成复合物，使药物缓慢进入血液，减小血液药物浓度。一般的给药方式，使人体内的药物浓度只能维持较短的时间，血液中或是体内组织中的药物浓度上下波动较大。因此，复合物缓释体的制备与选择在治疗中经常是非常需要的。

摘要
背景：自体脂肪组织没有排异性，由于其来源相对丰富，成本相对低廉，移植后外观相对自然，目前已成为近乎理想的组织填充物。
目的：文章就近年来不同添加成分对脂肪细胞活性影响的研究进展做一综述。
方法：以“Autologousadipose tissue；rate of survival；stromal vascular fraction；platelet-rich plasma;growth factor；adipose derived stem cells；leptin”为英文检索词，以“脂肪细胞，成活率,自体脂肪移植，基质血管成分，富血小板血浆，生长因子，脂肪来源干细胞，瘦素”为中文检索词。应用计算机检索中国知网全文数据库、万方全文数据库、维普期刊全文数据库、PubMed数据库、Elsevier数据库、Embase数据库有关脂肪细胞活性的文献，保留47篇文献进一步总结分析。
结果与结论：自体脂肪组织移植还存在一些缺陷，研究发现单纯颗粒脂肪移植后存活率低于60%，移植后脂肪组织吸收率较高，可能出现囊肿、钙化等一系列并发症，这些都制约着自体脂肪移植的广泛临床应用。国内外学者一直在试图通过改进吸脂方法、冻存条件，或采用不同添加成分如富血小板血浆、血管基质成分等等不同方法，以提高脂肪移植成活率。其中血管基质成分、富血小板血浆、脂肪来源干细胞、A型肉毒毒素、部分细胞因子已有临床研究证实其可行及有效性，瘦素、部分生长因子及药物的研究仍需从动物模型转入临床实验的研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-2906-2048(孙音)

关键词: 组织构建, 组织工程, 脂肪细胞活性, 自体脂肪移植, 添加成分

Abstract:

BACKGROUND: Autologous adipose tissue has become an ideal filling material due to the fact that it has no rejection reaction, but has abundant source, good texture and appearance after transplantation, and low cost.
OBJECTIVE: To review the research advance in the effect of different additive ingredients on the activity of adipocytes.
METHODS: A computer-based retrieval of CNKI, WanFang, VIP, PubMed, Elsevier, and Embase databases was conducted for the articles about adipocyte viability using the keywords of “autologous adipose tissue, rate of survival, stromal vascular fraction, platelet-rich plasma, growth factor, adipose derived stem cells, leptin” in English and Chinese, respectively. Finally 47 eligible articles were included for further analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: Autologous fat transplantation still holds some limitations. It has been found that the survival rate of single autologous fat globules is less than 60%. The high absorption rate of adipose tissues, cyst, calcification and other complications after transplantation restrict its far-ranging application. In order to improve the survival rate of transplanted adipose tissues, most of scholars have been trying to improve the method of liposuction, cryopreservation conditions, or add different ingredients such as platelet-rich plasma and stromal vascular fraction. The stromal vascular fraction, platelet rich plasma, adipose derived stem cells, botulinum toxin A, and some cytokines have been confirmed to be feasible and effective according to a series of trials; however, the studies on leptin and some other kinds of cytokines and drugs still in the experimental stage, which need to be explored in depth.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Adipocytes, Transplantation, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

孙音，魏国茜，顾洛莎，顾劲松. 不同添加成分对自体移植脂肪细胞活性的影响：进展与现状[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(32): 5221-5226.

Sun Yin1, Wei Guo-qian1, Gu Luo-sha2, Gu Jin-song3. Effect of different additive ingredients on the activity of adipocytes: research progress and application status[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(32): 5221-5226.

图/表（结果） 2

2.1 基质血管成分由于在能量调控、炎症反应和免疫应答方面的作用，脂肪组织已被认为是一个内分泌器官。除此之外，脂肪组织还是多功能细胞(具有多向分化潜能)的来源之一，而多功能细胞就存在于脂肪组织基质血管成分中(见图1)^[2]。脂肪组织中的基质血管成分是脂肪组织经过胶原酶消化、过滤、离心、除去成熟脂肪细胞后获得的产物。基质血管成分易于从脂肪组织中提取，并含有大量脂肪组织来源干细胞。从人类乳房、内脏脂肪组织中获取的基质血管成分含有内皮细胞、非特征性基质细胞、血液细胞及组织型巨噬细胞^[3]。此外，基质血管成分细胞还是造血祖细胞和中胚层干细胞 (可以分化为骨、软骨、肌肉、神经细胞)的来源之一^[4]。有研究发现，基质血管成分细胞在移植后能够自发地向脂肪细胞分化，有促进脂肪组织再生的作用；同时也能向内皮细胞分化，参与脂肪移植物内新生血管的形成过程^[2]。

孙凯等^[5]选择了24例行面部脂肪填充的患者，将静置、纯化后的自体颗粒脂肪加入自身基质血管成分，再将此混合物移植到面部，术后随访1年，满意率为 100%，移植受区皮肤较术前白皙、细嫩；而46例未加入基质血管成分的对照组均存在移植后脂肪组织不同程度的吸收。该研究表明，基质血管成分可以提高自体颗粒脂肪的存活率。混合基质血管成分的脂肪移植于鼻唇沟部位效果最好，其余为颧骨周围以及眶下区，表明基质血管成分在面部深皱纹的区域较其他区域明显。朱茗等^[4]从临床抽脂患者获取脂肪组织并提取其中基质血管成分及脂肪来源干细胞，将其分别与裸鼠的脂肪组织混合后移植于其背部的皮下组织，术后3个月发现，基质血管成分、脂肪来源干细胞各自均能有效提高脂肪移植成活率。

2.2 脂肪来源干细胞脂肪来源干细胞是指从脂肪组织中分离提取出的贴壁生长、具有可塑性、黏附性和多向

分化能力的细胞群。近年研究发现，脂肪来源干细胞作为种子细胞，能促使血管、骨、软骨、肌腱、神经、皮肤等组织的修复、再生及更新^[6]，并能分泌血管内皮生长因子、肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子等细胞因子。脂肪来源干细胞还能转化为新生代脂肪细胞，现有的成熟脂肪细胞凋亡后，新生代脂肪细胞会对脂肪组织进行补充。在此研究基础上，Matsumoto等^[7]提出了脂肪来源干细胞辅助自体脂肪移植的概念，研究发现加入脂肪来源干细胞的脂肪移植可使脂肪细胞成活率在单纯脂肪颗粒移植的基础上提高35%。

国内已有学者将脂肪来源干细胞辅助自体脂肪移植应用于临床隆胸^[8-9]，观察认为，术中添加脂肪来源干细胞能减少脂肪颗粒液化、感染等并发症，具有促进移植物血管再生、提高脂肪细胞存活率、减少手术次数等优点。随访发现术后3个月，乳房内保存的移植脂肪基本存活，之后乳房的隆起效果不再发生变化，不同年龄的患者均可获得满意的临床效果。Tian等^[10]比较了加入同种同源、同种异源的脂肪来源干细胞应用于大鼠脂肪移植的效果，从称质量、光镜观察、血管密度测定等几方面评定效果得出结论，异体脂肪来源干细胞和自体来源的脂肪来源干细胞都能较高程度的提高大鼠移植脂肪组织的成活率。

但目前脂肪来源干细胞的应用仍有许多重要问题有待探索解决，有研究显示，长时间培养的脂肪来源干细胞可使免疫缺陷小鼠发生肿瘤^[11]，故尚需临床大样本进行长期观察研究，以确定其移植后的安全性。

2.3 富血小板血浆富血小板血浆是由全血离心得到的含有高浓度血小板的血浆，富含来源于血小板的多种生长因子和黏附分子。研究表明只有当富血小板血浆中血小板计数达到10⁹ L^-1，或全血血小板数的4-7倍，才能取得有效的临床效果^[12]。血小板中含有α颗粒和高密度颗粒，而每个血小板中大约含有50-80个α颗粒。目前已证实α颗粒中至少有7种能够激活创面修复的生长因子，包括3种血小板衍化生长因子、两种转化生长因子β、血管内皮生长因子、表皮生长因子以及3种细胞黏附蛋白(纤维蛋白原、纤维连接蛋白和玻连蛋白)^[13]。富血小板血浆中基质细胞衍生因子１、胰岛素样生长因子1、碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子等^[14]，是目前认为促进血管生成及前脂肪细胞分化的生长因子。

血小板激活后可以释放生长因子，它的激活是α颗粒与血小板膜融合、胞吐释放蛋白、通过添加组蛋白和碳水化合物使侧链活化的过程。富血小板血浆的激活方法影响富血小板血浆中生长因子的释放。Kim等^[15]比较了4种不同激活方式的富血小板血浆应用于脂肪移植的疗效，使用0.1%Triton-X(或142.8 U/mL凝血酶与14.3 g/L CaCl₂•2H₂O混合)激活会使血小板衍生生长因子和转化生长因子β的释放更充分，获得含量更高的生长因子；在20 mg/L胶原蛋白预先激活后添加10 U/mL凝血酶和2 mLCaCl₂•2H₂O，会使血管内皮生长因子含量更高；单纯使用10%CaCl₂•2H₂O激活获得的成纤维细胞生长因子的含量更高，因此不能说哪种激活方法更好，但可根据需要侧重选择。

Salgarello等^[16]将自体脂肪组织与富血小板血浆按9∶1混合移植用于乳房重建(采用梯度离心法以1 100×g离心10 min制备富血小板血浆，加入氯化钙激活)，术后1年，富血小板血浆混合脂肪移植组的体积维持率为69%，而单纯脂肪移植组只有39%。此外，Gentile等^[17]报道添加富血小板血浆与添加基质血管成分辅助人体脂肪移植的体积维持率分别为69%、63%，二者效果相似。Cervelli等^[18]进一步研究发现，已激活的富血小板血浆对脂肪来源干细胞的增殖有促进作用，40%体积比的富血小板血浆是最佳的混合比例，能促进人面部移植脂肪的体积维持达50周。但不同动物间富血小板血浆与脂肪颗粒混合的最适比例各不相同，需研究、探讨，制定标准的人类富血小板血浆制备和激活方法^[19]。

目前，多数研究证实，富血小板血浆能提高脂肪细胞的存活率和促进血管新生，提高移植脂肪组织的体积维持率，当富血小板血浆中的生长因子持续、缓慢释放时效果更佳。富血小板血浆还能减轻炎症反应程度和减少囊肿形成，对体外培养人原代脂肪来源干细胞的增殖有促进作用^[20]。

2.4 细胞因子为增加移植后脂肪组织的血供，研究者们发现了一些促进移植后血管形成的细胞因子，如白细胞介素8、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、血管生成素1等(表1)。

王少华等^[27]在自体脂肪移植的动物实验中分别加入碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、表皮生长因子、胰岛素，通过重量测定、苏木精-伊红染色

镜下观察、微血管CD34染色及计数比较。发现移植后胰岛素组与生理盐水对照组无明显差异，其余生长因子组所剩脂肪组织质量较大，但该差异随时间的推移逐步减小。实验组与对照组的重量差异于第90天时各无统计学意义。苏木精-伊红染色镜下见生长因子组脂肪细胞大小不一，以小体积为主；碱性成纤维细胞生长因子组以较多的纤维组织间隔较为显著；血管内皮生长因子组以脂肪组织周边较多纤维增生较为显著；胰岛素与对照组所示接近，大部分移植物纤维化，可见较大区域囊样脂肪池及坏死灶。免疫组织化学SABC(Strept Avidin-Biotin Complex)法测定血管密度，移植7 d后，生长因子组血管密度均高于对照组及胰岛素组，但与对照组的差异随时间的推移逐渐减小，至移植后3个月无差异。说明生长因子对新生血管的形成起到加速作用，而不是促进新生血管量的增加。黄成等^[28]将纯化脂肪颗粒与碱性成纤维细胞生长因子混合后注入受术者乳房，术后3个月随访观察，乳房隆起值和患者的满意度均高于纯化后直接注射的对照组，全部受术者无感染、坏死、局部组织过度增长等症状。

有学者在应用脂肪来源干细胞的基础上加入碱性成纤维细胞生长因子^[24]，发现比单独应用脂肪来源干细胞能更有效地提高移植脂肪组织存活率。赵威等^[29]发现，血管内皮生长因子能促进移植脂肪以及大鼠移植皮片新生血管的生长，提高移植物成活率；同等剂量的血管内皮生长因子(VEGF)，加入透明质酸(HA)形成HA-VEGF缓释体，可更有效地提高其成活率。说明透明质酸对血管内皮生长因子起到缓释的作用，延长其在局部的生物学效应和存留时间。研究证明藻酸钙和血管内皮生长因子复合物缓释载体，可以使血管内皮生长因子持续释放，减缓局部血管内皮生长因子的代谢，促进血管形成，提高脂肪细胞的成活^[30]。

生长因子(如碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、表皮生长因子等)在整形外科应用较广泛，但碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子已被证实与肿瘤的发生发展密切相关^[31]。理论上生长因子的半衰期大多较短，注入体内后应很快被代谢，然而临床上似乎并非如此。郑志芳等^[32]对17例面部注射外源性生长因子并产生面部肿物的患者进行回顾性分析，其中3例确定是碱性成纤维细胞生长因子，余14例不详。研究发现17例注射生长因子后产生的肿物肌束排列紊乱，脂肪细胞增多，所有肿物无恶变。然而，注射生长因子是否产生恶变，是否可控，值得进一步研究证实。

2.5 瘦素瘦素是由肥胖基因编码的一种分泌型蛋白质，由脂肪细胞分泌，入血后通过与位于中枢和外周多种组织、多种形式瘦素受体结合来发挥生物学效应。瘦素可通过旁分泌的形式作用于内皮细胞，它间接发挥促进血管增生的作用，其途径一是直接作用于血管平滑肌细胞及血管内皮细胞上的瘦素受体；二是间接作用于内源性血管增生刺激因子来发挥效应。起中间作用的内源性因子有血管内皮生长因子、纤维生长因子2等。瘦素可通过激活蛋白激酶使脂肪酸氧化，诱导T1淋巴细胞和巨噬细胞向皮下迁移；通过与血小板和内皮细胞上的血栓蛋白结合，促进血小板聚集；通过降低胰岛素水平来降低脂肪储存；可促进脂肪水解，提高血液中游离脂肪酸的浓度、增强脂肪酸的氧化；还可刺激血管内皮细胞，促进血管生成。在创伤修复初期，瘦素促进创面的炎症反应，后期则增强伤口边缘角质形成细胞的增殖。研究发现，作用于中枢靶细胞的瘦素可增加脂肪代谢^[33]，促进血管内皮细胞分化，促进局部的血管增生。

有学者用不同浓度瘦素干预人前脂肪细胞的增殖过程^[34]，MTT法检测证明超生理浓度的瘦素(1 000 mg/L)有助于前脂肪细胞的增殖，但生理浓度(100 mg/L)和低于生理浓度(10 mg/L)的瘦素对前脂肪细胞并没有显著促其增殖。曾有学者依据抽脂术后患者的瘦素水平检测结果显示，吸脂术后的较长时间内，其血清瘦素水平多呈一定程度的降低。从瘦素的促血管增生角度看，脂肪移植术后血清瘦素水平的降低可能是影响移植颗粒脂肪成活的因素之一。彭青和^[35]用瘦素干预颗粒脂肪移植的实验动物模型，证实各浓度瘦素实验组与生理盐水对照组在脂肪移植成活中存在明显差别，即瘦素浓度越高，促进血管增生的作用就越强，移植物的重量维持率也越高。瘦素是否能够提高人体脂肪颗粒移植的成活率还缺乏临床实验的研究。

2.6 A型肉毒毒素脂肪组织移植后的成活及再生基础是血运重建，在通过血管重建形成血液循环前，移植脂肪组织的营养来源于周围血浆的扩散。为了保证移植脂肪组织与受区广泛、良好的接触，移植的脂肪组织的稳固定植是一个很重要的影响因素。然而，在面部等特殊部位，因表情肌的频繁活动，致使移植的脂肪不能稳固定植，从而影响移植脂肪组织早期的血运重建。众所周知，A型肉毒毒素作用于横纹肌的神经肌接头，从而产生肌肉松弛性麻痹，阻止了表情肌的活动，有利于移植脂肪颗粒在面部受区的定植。此外，A型肉毒素可降低移植脂肪组织的脂解作用^[36]，减少去甲肾上腺素的分泌，从而减少血管收缩，改善移植脂肪组织的营养供应，移植脂肪组织的存活率也将相应提高。另外，在游离皮瓣局部使用A型肉毒素可通过抑制自主神经系统使末梢血管扩张，从而提高皮瓣的存活率^[37]，也间接佐证脂肪移植中使用A型肉毒素的积极作用。

张涛等^[38]取小鼠腹部脂肪组织分成两组，实验组加A型肉毒素后移植到背部右侧，对照组加生理盐水后移植到背部左侧。随机抽取4只，分别于术后第7，14，28，42，56天取材，从肉眼、病理切片观察比较其脂肪细胞的活性。实验组脂肪组织在质量、体积、细胞完整度、存活率四方面，术后1，2，4，6和8周后均明显高于对照组(P < 0.05)。说明A型肉毒素可以提高脂肪细胞活性，促进自体脂肪颗粒移植的存活率。余若晖^[39]将额颞部首次脂肪移植的患者分为两组，一组于接受自体脂肪移植前注射A型肉毒毒素，另一组仅接受自体脂肪移植，对其进行回顾性分析，证实A型肉毒毒素在初次自体脂肪移植术(额颞部)中，能够术后效果和患者满意度。

2.7 药物

2.7.1 川芎嗪川芎嗪主要成分为2，3，5，6－四甲基毗傣。它具备抑制血小板聚集、抗凝溶栓、抗氧化、扩张小动脉、改善微循环、保护血管内皮及钙拮抗的作用，对血液系统及脏器等组织疾病都有治疗保护作用。

吴慧玲等^[40]取SD大鼠腹腔颗粒脂肪，试验组加入不同剂量的磷酸川芎嗪注射液于大鼠背部皮下，对照组则不做添加直接移植，于术后第4天、1周、2周、4周、6周、10周取材、取血，通过测定血清血管内皮生长因子的含量、脂肪移植物体积、形态学观察、微血管密度定量研究，结果发现试验组移植后血清血管内皮生长因子表达程度增高；移植早期脂肪体积下降明显，移植后7周的体积维持率为41.3%，移植体部位经历了炎症反应、脂肪细胞坏死及增生、纤维化，而后趋于稳定等过程。与对照组相比，实验组SD大鼠自体脂肪移植的成活率得到了更大的提高。

2.7.2 丹参、黄芪丹参具有促进血管新生、改善微循环、调节免疫、预防应激性溃疡、抗菌消炎、抗肿瘤、抗肝纤维化等作用^[41]。黄芪具有显著的抗氧化活性，能够抑制自由基的产生，并能够清除体内过剩自由基，保护线粒体的结构和功能，从而起到保护细胞、延长细胞寿命的作用^[42]。

李鹏飞等^[43]通过新西兰白兔自体脂肪移植动物模型，观察比较丹参、黄芪在自体脂肪移植中对细胞保护、血运重建、毛细血管新生及成活率的影响。实验组分别将丹参、黄芪注射液注射入腹腔；对照组注射生理盐水。于不同时间点采血、取材进行研究，术后第12周，两实验组的脂肪细胞活性、体积、存活率等方面明显高于对照组。提示应用丹参或黄芪有助于提高自体脂肪移植成活率。

2.7.3 其他研究发现，选择性β1受体阻断剂能够阻断脂肪细胞膜上腺苷酸环化酶活性^[44]，有效对抗脂解作用，且能促进前脂肪细胞向脂肪细胞的分化。Joshua Gillis^[45]将N-乙酰半胱氨酸加入肿胀麻醉液及脂肪来源干细胞中进行脂肪移植，发现移植的脂肪组织中纤维化和炎症表现明显减少，脂肪细胞密度增加了33%。前列腺素类等药物对移植后脂肪组织的存活有一定促进作用，但是效果均不理想^[46]。

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