新鲜羊膜与脱细胞羊膜修复腱鞘缺损预防肌腱粘连

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.30.015

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (30): 4842-4846.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.30.015

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新鲜羊膜与脱细胞羊膜修复腱鞘缺损预防肌腱粘连

白江博，赵红芳，高瑞姣，张冰，于昆仑，杨彦涛，马韬，田德虎

河北医科大学第三医院手外科，河北省骨科生物力学重点实验室，河北省石家庄市 050051

收稿日期:2017-05-10 出版日期:2017-10-28 发布日期:2017-11-07
通讯作者: 田德虎，主任医师，教授，硕士生导师，河北医科大学第三医院手外科，河北省骨科生物力学重点实验室，河北省石家庄市 050051
作者简介:白江博，男，1982年生，河北省武安市人，汉族，硕士，主治医师，主要从事肌腱损伤修复及重建研究。
基金资助:
河北省医学科学研究重点课题计划(ZL20140210)

Fresh amniotic membrane versus acellular amniotic membrane for repair of the tendon sheath and prevention of tendon adhesion

Bai Jiang-bo, Zhao Hong-fang, Gao Rui-jiao, Zhang Bing, Yu Kun-lun, Yang Yan-tao, Ma Tao, Tian De-hu

Department of Hand Surgery, Third Affiliated Hospital of Hebei Medical University, Hebei Provincial Key Laboratory of Orthopedics Biomechanics, Shijiazhuang 050051, Hebei Province, China

Received:2017-05-10 Online:2017-10-28 Published:2017-11-07
Contact: Tian De-hu, Chief physician, Professor, Master’s supervisor, Department of Hand Surgery, Third Affiliated Hospital of Hebei Medical University, Hebei Provincial Key Laboratory of Orthopedics Biomechanics, Shijiazhuang 050051, Hebei Province, China
About author:Bai Jiang-bo, Master, Attending physician, Department of Hand Surgery, Third Affiliated Hospital of Hebei Medical University, Hebei Provincial Key Laboratory of Orthopedics Biomechanics, Shijiazhuang 050051, Hebei Province, China
Supported by:
the Medical Research Project of Hebei Province, No. ZL20140210

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

羊膜：是一种半透膜，其独有的结构可阻止某些物质通过，保证包裹内组织正常营养供应，而且具有抗粘连能力、组织相容性好、炎性反应轻、纤维包裹少及可降解等特性。

防粘连材料：最初运用的非生物合成材料主要有金箔、硅胶膜等，其优点是取材简便、性质非常稳定、局部停留时间充足，但存在无通透性、排异反应明显、组织反应大、需要二期手术取出、影响肌腱愈合等问题。有学者利用自体组织作为阻断外源性愈合的屏障材料来预防肌腱粘连，自体组织材料不会产生免疫反应，而且通透性良好，不阻断肌腱的营养供应，是预防粘连的金标准，但自体材料的供源有限且会增加副损伤、方法也较为复杂，限制了其临床应用。

背景：羊膜独有的结构可阻止某些物质通过，能保证包裹内组织正常营养供应，而且具有抗粘连、组织相容性好、炎性反应轻、纤维包裹少及可降解等特性。

目的：比较新鲜羊膜及脱细胞羊膜修复腱鞘缺损，预防肌腱粘连和促进肌腱愈合的作用。

方法：取60只雄性来亨鸡，制作双足第三足趾制备肌腱及腱鞘损伤模型，随机分为3组修复，新鲜羊膜组采用新鲜人羊膜修复腱鞘缺损，脱细胞羊膜组采用人脱细胞羊膜修复腱鞘缺损，对照组不做腱鞘修复。修复后进行第三足趾组织学观察及生物力学测试。

结果与结论：①组织学观察：修复后2周，3组均存在充血水肿及炎症反应，新鲜羊膜组最轻，对照组最严重，3组水肿及炎症反应随时间延长逐渐减轻。修复12周，各组假鞘较修复后4周明显成熟，新鲜羊膜组及脱细胞羊膜组假鞘表面细胞致密层状排列整齐，表面光滑；对照组假鞘表面细胞排列紊乱，结构松散，可见表面纤维组织突出假鞘表面；②生物力学测试：脱细胞羊膜组、新鲜羊膜组修复后4，8，12周的肌腱滑动距离均大于对照组(P < 0.05)，前2组间比较差异无显著性意义；脱细胞羊膜组、新鲜羊膜组修复后4，8周的肌腱最大拉伸断裂强度高于对照组(P < 0.05)，且新鲜羊膜组高于脱细胞羊膜组(P < 0.05)，3组修复后12周的肌腱最大拉伸断裂强度无差异；③结果表明：新鲜羊膜和脱细胞羊膜均可用于重建腱鞘缺损，预防肌腱粘连，新鲜羊膜在促进早期肌腱愈合方面优于脱细胞羊膜。

ORCID: 0000-0002-6065-0828(田德虎)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 膜生物材料, 羊膜, 脱细胞羊膜, 腱鞘, 肌腱粘连, 肌腱愈合

Abstract:

BACKGROUND: Amniotic membrane has a unique structure that can block the penetration of certain substances, to ensure normal nutrition supply for the surrounded tissues, and is also characterized by anti-adhesion, good tissue compatibility, mild inflammatory reaction, few fibers and biodegradability.

OBJECTIVE: To compare the effects of fresh amniotic membrane and acellular amniotic membrane to prevent adhesion and promote tendon healing during the repair of tendon sheath defects.

METHODS: Sixty healthy male leghorn chickens were selected, and the model of tendon injury and tendon sheath defects was established at the third toes. The animal models were then randomly divided into three groups and underwent repair with fresh amniotic membrane (group A), acellular amniotic membrane (group B), and no treatment in control group (group C), respectively. Histological observation and biomechanical analysis of the third toes were performed after repair.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Histological observation. Congestive edema and inflammatory response were found in all animals at 2 weeks after repair, but mildest in the group A and severest in the group C. These inflammatory responses gradually alleviated over time in the three groups. At 12 weeks after repair, the new tendon sheath formed in all the animals, which was more mature than that at 4 weeks after repair. The synovial cells on the surface of the tendon sheath were arrayed tidily with dense structure in the groups A and B, but in the group C, the synovial cells were distributed disorderly with loose structure and prominent fibrous tissues. (2) Biomechanical analysis. Tendon sliding distance in the groups A and B was significantly larger than that in the group C at 4, 8, 12 weeks after repair (P < 0.05), but there were no significant difference in the distance between the groups A and B (P > 0.05). At 4 and 8 weeks after repair, the maximum tensile strength was largest in the group A, sequentially followed by group B and group C (P < 0.05), but there were no significant difference among the three groups at 12 weeks after repair (P > 0.05). To conclude, both fresh amniotic membrane and acellular amniotic membrane can promote tendon healing and prevent the adhesion of tendon through tendon sheath reconstruction, but the fresh amniotic membrane is preferred to promote early tendon healing compared with acellular amniotic membrane.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Amnion, Tissue Adhesions, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

白江博，赵红芳，高瑞姣，张冰，于昆仑，杨彦涛，马韬，田德虎. 新鲜羊膜与脱细胞羊膜修复腱鞘缺损预防肌腱粘连[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(30): 4842-4846.

Bai Jiang-bo, Zhao Hong-fang, Gao Rui-jiao, Zhang Bing, Yu Kun-lun, Yang Yan-tao, Ma Tao, Tian De-hu.

Fresh amniotic membrane versus acellular amniotic membrane for repair of the tendon sheath and prevention of tendon adhesion

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(30): 4842-4846.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析各组鸡均存活良好，伤口无红肿及脓液渗出，无坏死组织。

2.2 大体观察结果修复后2周，新鲜羊膜组与脱细胞羊膜组腱鞘缺损区由皮下组织代替，形态似腱鞘样结构，羊膜可辨认，腱鞘缺损处组织充血水肿，重建腱鞘表面光滑，肌腱断端由纤维组织连接，与重建腱鞘无粘连；对照组假鞘内面不光滑，肌腱断端与周围松散纤维组织相连，较易剥离。修复后4周，各组腱鞘缺损处周围组织充血水肿明显消退，新鲜羊膜组及脱细胞羊膜组重建腱鞘内壁光滑，羊膜组织难以辨认，肌腱吻合口愈合良好，腱周少许薄膜粘连；对照组无明显完整腱鞘结构，肌腱与周围组织有较多纤维结蹄组织相连，较难剥离，见图1。修复后8，12周，新鲜羊膜组及脱细胞羊膜组重建腱鞘完整，内壁光滑，可见肌腱愈合良好，肌腱与周围组织有少许薄膜粘连，容易剥离；对照组无完整腱鞘结构，肌腱与周围组织有瘢痕组织致密粘连，肌腱滑动困难。

2.3 组织学观察结果修复后2周，3组均存在充血水肿及炎症反应，新鲜羊膜组水肿、炎性细胞浸润较轻，脱细胞羊膜充血水肿、炎性细胞侵润中等，对照组充血水肿范围较大，大量炎症细胞浸润。修复后4周，3组充血水肿及炎症反应明显减轻，新鲜羊膜组及脱细胞羊膜组假鞘浅层见多层排列整齐细胞，细胞层数多，细胞密集，靠近表面细胞表面光滑；对照组假鞘内表面细胞排列不整齐，表面纤维组织突出假鞘表面，见图2。修复后8，12周，各组假鞘较前明显成熟，新鲜羊膜组及脱细胞羊膜组假鞘表面细胞致密层状排列整齐，表面光滑；对照组假鞘表面细胞排列紊乱，结构松散，可见表面纤维组织突出假鞘表面，见图2。

2.4 生物力学检测结果修复后各时间段新鲜羊膜组与脱细胞羊膜组肌腱滑动距离比较差异均无显著性学意义 (P > 0.05)，均长于对照组(P < 0.05)，见表1。

修复后4，8周，新鲜羊膜组及脱细胞羊膜组最大拉伸断裂强度高于对照组(P < 0.05)，且新鲜羊膜组高于脱细胞羊膜组(P < 0.05)；修复后12周，3组肌腱最大拉伸强度强度比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2016年5至10月在河北医科大学第三医院动物实验中心完成。

1.3 材料

实验动物：6月龄雌性来亨鸡60只，体质量(2.03±0.06)kg，由河北医科大学动物中心提供，许可证号：1505070，随机分成3组，新鲜羊膜组、脱细胞羊膜组及对照组，每组20只。

新鲜羊膜：由河北医科大学第三医院提供，选择肝炎病毒抗体、梅毒抗体及人免疫缺陷病毒抗体均为阴性的剖腹产的产妇(采取前征得产妇知情同意)，无菌操作下取胎膜，无菌操作下用PBS冲洗净胎盘血迹，置于改良PBS中浸泡后，在净化工作台上钝性剥离羊膜，上皮面朝上平铺于消毒的乙酸纤维素薄膜上，裁剪成1.5 cm×2 cm大小，储存于4 ℃恒温冰箱中，限24 h内使用。

脱细胞羊膜：取制备好的新鲜羊膜，置于4 ℃100%甘油中脱水，每24 h更换1次，共3次。将脱水后的羊膜取出，PBS水化，加入0.25%胰蛋白酶，37 ℃室温下消化后，再用细胞刮子刮除残存的羊膜上皮细胞，于倒置相差显微镜下证实无细胞后羊膜上皮面朝上平铺于乙酸纤维薄膜纸上，漂洗、冷冻干燥，分装密封，环氧乙烷消毒备用。

1.4 实验方法

制备亨鸡双足第三足趾肌腱及腱鞘损伤模型：在60只鸡大腿中上部肌肉注射盐酸氯胺酮注射液(10 mg/kg)及地西泮注射液(0.5 mg/kg)，常规消毒，于双侧第三趾跖侧面近位趾间关节处做纵行2.5 cm切口，分离皮下组织，显露腱鞘1.5 cm，切除掌侧腱鞘1.0 cm及趾浅屈肌腱，横行切断趾深屈肌腱1/2，用5-0无创缝合线做改良kessler法中心缝合，用7-0无创缝合线做周边缝合，新鲜羊膜组取新鲜羊膜覆盖腱鞘缺损处，上皮细胞面朝向肌腱侧，用7-0无创缝合线做周边缝合固定；脱细胞羊膜组取脱细胞羊膜覆盖腱鞘缺损处，基底层朝向肌腱侧，用7-0无创缝合线做周边缝合固定；对照组不做腱鞘修复。用4-0缝合线间断缝合皮肤切口，消毒后无菌敷料包扎，然后拳击手套包扎法屈曲位固定，1周后去除固定自由活动。

1.5 主要观察指标

大体观察：定期观察实验动物存活及切口情况，修复后2，4，8及12周，各组分别处死5只动物，观察重建腱鞘光滑度、腱周组织粘连等情况。

组织学观察：大体观察后，每组随机选取2趾，以肌腱吻合口为中心，趾骨浅层锐性切取包含腱鞘浅层皮下组织、腱鞘及肌腱长约1 cm的组织，置于100%多聚甲醛固定，包埋、切片、苏木精-伊红染色，光镜下组织学观察。

生物力学检测：修复后4，8及12周，随机取5趾，自跖趾关节处离断并保留近端长段趾深屈肌腱，行生物力学测试。①肌腱滑动距离：取第三足趾固定于ElectroForce3520生物力学测试仪(BOSE公司，美国)夹具上，趾间关节伸直，垂直于水平面，于趾深屈肌腱出鞘管处标记，夹具固定肌腱，以20 mm/min的拉伸速度拉伸肌腱，逐渐增加牵引力至10 N。用游标卡尺(精确度0.02 mm，上海驭琅量具有限公司)测量肌腱拉出腱鞘的长度，为肌腱滑动距离。每个标本测试3次，取平均值；②肌腱最大拉伸断裂强度：保留第三趾末节，分离趾深屈肌腱与周围组织，将趾深屈肌腱固定于生物力学测试仪夹具上，以 20 mm/min，最大量程为200 N，牵拉至肌腱断裂并记录测量值，评价肌腱愈合质量。

1.6 统计学分析采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，数据以x(_)±s表示；组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD检验，P < 0.05认为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

肌腱外源性愈合是发生肌腱粘连的主要原因，如何避免外源性愈合是解决肌腱粘连的有效措施。许多学者在预防肌腱粘连及促进肌腱愈合方面进行了研究，都在一定程度上取得了一定效果^[2-3]。

完整腱鞘是一个理想的屏障，具有阻止腱周结蹄组织侵入，促进肌腱愈合及预防肌腱粘连有重要作用。临床上肌腱损伤的患者极少能够保持腱鞘完整，即使行腱鞘切开者，也常由于组织水肿等原因使腱鞘组织的一期修复变得困难，故探索合适的腱鞘修复材料才有具有重大临床意义。

最初运用的非生物合成材料主要有金箔、硅胶膜等。其优点是取材简便、性质非常稳定、局部停留时间充足。章庆国等^[4]利用金箔预防屈肌腱粘连，实验表明金箔组动物的屈趾功能明显优于单纯肌腱修复组，认为金箔可能是通过刺激周围组织形成假鞘，阻止外源性愈合产生粘连，且没有影响肌腱愈合，可视为较理想的防粘连材料。虽然非生物材料在一定程度上减轻了粘连，但其缺点也是非常明显的，如无通透性、排异反应明显、组织反应大、需要二期手术取出、影响肌腱愈合等，因阻断了肌腱营养而致肌腱坏死。这些缺点制约了非生物材料的发展，未能真正运用于临床。有学者利用自体组织作为阻断外源性愈合的屏障材料来预防肌腱粘连，自体组织材料不会产生免疫反应，而且通透性良好，不阻断肌腱的营养供应，是预防粘连的金标准^[5-9]。牟善霄等^[5-6]以鸡双足为模型，利用自身大隐静脉修复缺损的鞘管防止肌腱粘连。阎道海等^[7]在临床上利用自体静脉移植重建腱鞘防止肌腱粘连，取得了较满意疗效。韩文冬等^[8]将自体脂肪颗粒纯化移植修复腱鞘，认为纯化脂肪颗粒是预防肌腱粘连的较理想的材料，具有良好的生物相容性，具有促进肌腱愈合、防止或减轻术后粘连、改善肌腱滑动的作用。但自体材料的供源有限且会增加副损伤，方法也较为复杂，限制了其临床应用。

由于组织工程技术的发展，采用组织工程化腱鞘来修复腱鞘缺损变得可行。Jiang等^[10]应用静电纺丝技术制作多层生物膜，重建腱鞘缺损预防肌腱粘连，促进肌腱滑动及预防肌腱粘连，取得了满意效果。薛辉等^[11]利用组织工程技术制作了去细胞肌肉组织工程支架，证实其与人羊膜上皮细胞有良好的相容性，为进一步研究新的防粘连材料奠定了一定实验基础。徐梁等^[12]将腱鞘细胞种植于具有良好生物相容性的聚乙醇酸支架上，构建出组织工程化腱鞘，以修复鸡腱鞘缺损，研究发现形成的组织工程化腱鞘与正常腱鞘组织类似，腱鞘内表面光滑，腱鞘与肌腱之间有明显间隙。Baymurat等^[13]构建负载滑膜细胞的组织工程肌腱修复腱鞘缺损，滑膜细胞分泌胶原基质及透明质酸钠可起到预防肌腱粘连的作用。Li等^[14]构建持续释放塞来昔布的双层生物膜重建腱鞘缺损，塞来昔布抑制局部炎症反应，降低局部瘢痕增生，有效预防肌腱粘连。将组织工程化腱鞘用于修复腱鞘缺损，对于预防肌腱粘连具有重要意义。但其准备时间较长，在腱鞘体外培养过程中肌腱已愈合、产生粘连，且腱鞘细胞的取材来源有限、价格昂贵等均制约其广泛运用。

修复腱鞘组织材料众多，效果也不尽相同。人羊膜具有来源广泛、价格便宜、细胞相容性好、抗原性低、成本较低等特点，多年前已被作为移植修复材料在国内外广泛开展研究。羊膜是一种半透膜，其独有的结构可阻止某些物质通过，保证包裹内组织正常营养供应，而且具有抗粘连能力、组织相容性好、炎性反应轻、纤维包裹少、可降解等特性。Kesting等^[15]将冷冻处理后的人羊膜覆盖于大鼠腹壁肌肉组织创面，明显减少了粘连的发生。张振才等^[16]利用新鲜羊膜联合自体角膜缘干细胞、唇黏膜移植治疗重度眼睑球粘连，取得了良好疗效。Lee等^[17]体外实验发现，人羊膜提取物可降低受损的角膜上皮细胞的炎症反应，其在治疗伴有炎症反应的人角膜病变有很好效果。Shakeri等^[18]使用人羊膜修复兔尿路上皮损伤，证实羊膜可生物降解且生物移植抗原性非常小。Duskol等^[19]应用人羊膜修复慢性不愈合创面，取得了良好效果。Meller等^[20]将结膜细胞移植到羊膜上，用Brdu标记以后植入无胸腺的鼠皮下，植入14 d后依然能够追踪到84%的Brud标记细胞，同时研究也发现黏附在羊膜上的细胞有了干细胞特点，证实羊膜能够负载培养干细胞。董瑞一等^[21-22]用脱细胞羊膜包裹同种异体肌腱修复兔跟腱缺损，证实脱细胞羊膜可防治肌腱粘连和促进肌腱愈合，同时具备抗免疫排异的特性。高鸣等^[23]采用脱细胞羊膜重建腱鞘，重建腱鞘内壁光滑，肌腱滑动性好，愈合肌腱抗张力强。肖盼等^[24-25]发现人羊膜间充质干细胞具有干细胞特性，在合适条件下可诱导成角膜样上皮细胞及韧带细胞。

此次实验发现所有实验动物伤口无红肿及渗出液，伤口愈合良好，修复后4周组织学观察新鲜羊膜组炎症反应较轻，脱细胞羊膜组次之，对照组严重，这可能原因是羊膜细胞层含有多种细胞因子，细胞因子具有抑制炎症反应，控制免疫排斥反应发生。3组均有假鞘形成，新鲜羊膜组假鞘细胞层数较多，脱细胞羊膜组次之；对照组层数较少，排列不整齐，表层见胶原纤维，可能原因是新鲜羊膜含有上皮细胞层，羊膜细胞具有干细胞特征，羊膜细胞分化增殖成腱鞘细胞，羊膜基质可防止纤维瘢痕增生形成，防治粘连发生。生物力学结果显示，新鲜羊膜组与脱细胞羊膜组肌腱滑动度相比较无明显区别，但均好于对照组，提示新鲜羊膜组与脱细胞羊膜组在抗瘢痕过度形成、防治粘连方面无明显区别。修复后羊膜细胞组抗张力方面优于脱细胞羊膜组，可能机制为新鲜羊膜上皮细胞分化增殖成滑膜细胞及肌腱细胞有关，滑膜细胞分泌滑液给肌腱愈合提供了良好的微环境，肌腱细胞可促进肌腱内愈合。脱细胞羊膜经处理后，羊膜上皮细胞灭活，生物活动成分较少。

新鲜羊膜及脱细胞羊膜重建腱鞘均能有效阻止外源性愈合，预防肌腱粘连，在促进肌腱愈合方面新鲜羊膜优于脱细胞羊膜。新鲜羊膜和脱细胞羊膜均可作为重建腱鞘的理想材料，新鲜羊膜优于脱细胞羊膜。滑膜细胞及肌腱细胞是否由羊膜上皮细胞分化来还需进一步的实验证实。

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