低强度脉冲超声联合关节腔内注射玻璃酸钠修复关节软骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.30.004

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

玻璃酸钠：又名透明质酸钠，是由N-乙酰葡萄糖醛酸反复交替而形成的一种高分子多糖体生物材料。玻璃酸钠为广泛存在于动物和人体内的生理活性物质，在人皮肤、关节滑膜液、脐带、房水、眼玻璃体中均有分布。玻璃酸钠具有高度的黏弹性、可塑性以及良好的生物相容性，在预防粘连和修复软组织方面有明显作用。临床上用于多种皮肤损伤，促进伤口愈合，对于擦伤及撕裂伤，腿部的溃疡，糖尿病性溃疡，压迫性溃疡，以及清创术、静脉淤滞性溃疡等均有效；玻璃酸钠为关节滑液的主要成分，是软骨基质的成分之一，在关节腔内起润滑作用，可覆盖和保护关节软骨，改善关节挛缩，抑制软骨变性变化表面，改善病理性关节液。可用于变形膝关节病和肩关节周围炎的辅助治疗。

低强度脉冲超声波(Low intensity pulsed ultrasound，LIPU)：是一种加速骨折修复、促进骨折愈合的物理疗法。低强度脉冲超声波是一种非侵入性机械能，经皮传递后可在生物器官内产生高频率的声波。1952年意大利学者首先报道了低强度脉冲超声波可加速兔桡骨骨折愈合，随后Heckman和Kristiansen等学者关于低强度脉冲超声波促进人胫骨和桡骨远端骨折的报道不仅促使美国FDA批准低强度脉冲超声波的临床应用，同时带来低强度脉冲超声波在骨折愈合修复领域应用和研究的热潮。

背景：文献报道将低强度脉冲超声联合关节腔内注射玻璃酸钠运用于家兔关节软骨缺损修复中效果理想，能促进缺损部位愈合，但是该结论尚未得到进一步证实。

目的：进一步验证低强度脉冲超声联合关节腔内注射玻璃钠在家兔关节软骨缺损中的修复效果。

方法：60只家兔采用4 mL/kg浓度为20%乌拉坦溶液注射麻醉，在股骨踝部作直径为3 mm、深为3 mm的关节软骨缺损模型，根据处理方法分为模型对照组、玻璃酸钠组和观察组。模型对照组建模成功后不采取任何措施处理，玻璃酸钠组关节腔内注射玻璃酸钠修复，观察组在玻璃酸钠组基础上联合低强度脉冲超声修复。大体观察关节兔软骨缺损部位的形态；比较3组家兔修复后苏木精-伊红染色、番红O染色及Wakitani组织学评分。

结果与结论：①大体观察：模型对照组修复5周后缺损直径缩小，表面不平整且低于周围组织；玻璃酸钠组修复5后缺损部位与正常软骨组织边界清晰；观察组修复5周后缺损部位完全修复；②观察组家兔修复后2，5周Wakitani组织学评分，低于玻璃酸钠组和模型对照组(P < 0.05)；③观察组修复5周缺损部位细胞排列整齐；玻璃酸钠组修复5周后可见少许软骨区大量软骨样细胞；模型对照组修复后2，5周可见毛细心血管分布，排列不均匀；④观察组修复5周后缺损部位形态与正常软骨相似；玻璃酸钠组修复5周后深层蛋白多糖及软骨陷窝存在明显着色；模型对照组修复2，5周后深层染色偏白；⑤结果提示：低强度脉冲超声联合关节腔内注射玻璃钠在家兔关节软骨缺损中能取得理想修复效果。

ORCID: 0000-0003-4873-4145(郝德峰)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 软骨生物材料, 低强度脉冲超声, 关节腔, 玻璃酸钠, 关节软骨缺损, Wakitani组织学评分

Abstract:

BACKGROUND: As reported, the use of low-intensity pulsed ultrasound combined with intra-articular injection of sodium hyaluronate in rabbit articular cartilage defect repair is ideal, which can promote the healing of defect site. However, the conclusion has not been further confirmed.

OBJECTIVE: To investigate the effect of low-intensity pulsed ultrasound combined with intra-articular injection of sodium hyaluronate in repairing articular cartilage defects in rabbits.

METHODS: Sixty rabbits were anesthetized using 20% urethane solution injection at a dose of 4mL/kg, and a model of articular cartilage defect (3 mm in diameter and 3 mm in depth) was made on the femoral ankle of each rabbit. Then, there were three groups in this study: model group with no intervention, sodium hyaluronate group with intra-articular injection of sodium hyaluronate, and observation group with intra-articular injection of sodium hyaluronate combined with low-intensity pulsed ultrasound. Gross observation, hematoxylin-eosin staining, safranin O staining and Wakitani scores were compared among groups after repair.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) At 5 weeks after repair, in the model group, the defect size was reduced with uneven surface that was lower than the surrounding tissues; in the sodium hyaluronate group, there was a clear boundary between the defect and surrounding cartilage tissues; in the observation group, the defect was completely repaired. (2) After 2 and 5 weeks, the Wakitani scores in the observation group were significantly lower than those in the other two groups (P < 0.05). (3) After 5 weeks, in the observation group, the cells around the defect site arranged regularly, and in the sodium hyaluronate group, there were a large amount of cartilage-like cells in few cartilage regions. In the model group, there were irregularly arranged capillary blood vessels after 2 and 5 weeks. (4) After 5 weeks of repair, cartilage tissues with normal structure were found in the defect site in the observation group, and deeply stained proteoglycan and cartilage lacunae were observed in the sodium hyaluronate group, while in the model group, the deep layer stained white was observed at 2 and 5 weeks after repair. To conclude, low-intensity pulsed ultrasound combined with intra-articular injection of sodium hyaluronate can achieve the ideal repair effect on rabbit articular cartilage defects.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Sonication, Cartilage, Articular, Hyaluronic Acid, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

郝德峰，张鲁青，刘玉栋. 低强度脉冲超声联合关节腔内注射玻璃酸钠修复关节软骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(30): 4775-4780.

Hao De-feng, Zhang Lu-qing, Liu Yu-dong.

Low-intensity pulsed ultrasound combined with intra-articular injection of sodium hyaluronate in the repair of articular cartilage defects

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(30): 4775-4780.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析家兔60只全部进行结果分析，中途无脱落。

2.2 各组家兔一般情况 3组家兔建模麻醉清醒后饮食、饮水相对较少，建模后12 h逐渐恢复正常饮食、饮水。术后5 d家兔均能站立，1周基本能行走。所有家兔均未见缺损部位关节红肿，切口均得到良好的愈合。

2.3 各组家兔大体观察模型对照组未采取任何措施处理，修复2周后缺损部位凹陷明显，周围软骨色泽正常，欠平整，弹性也比较差；5周后家兔缺损部位未见完全修复，但是缺损直径缩小，表面不平整且低于周围组织。玻璃酸钠组家兔修复2周后缺损部位未见完全修复，基底平整，存在新生软骨样组织，边界清晰；5周后缺损部位与正常软骨组织边界清晰，表面平整，弹性略差。观察组修复2周后大部分缺损部位已经修复，存在少许凹陷，缺损部位可见新生软骨组织；5周后缺损部位完全修复，色泽、厚度等于周围组织相似，边界模糊，见图3。

2.4 各组家兔修复后2，5周Wakitani组织学评分情况比较观察组家兔修复后2，5周Wakitani组织学评分，低于玻璃酸钠组和模型对照组(P < 0.05)；玻璃酸钠组家兔修复后2，5周Wakitani组织学评分，低于模型对照组(P < 0.05)，见表1。

2.5 各组家兔修复后2，5周苏木精-伊红染色情况比较观察组修复2周时可见大量细胞增殖，且多以纤维母细胞为主，部分出现软骨母细胞；修复后5周缺损部位以软骨样细胞为主，细胞排列整齐，基质均匀着色，交界部位不明显。玻璃酸钠组修复2周后可见大量纤维母细胞增殖，但是未见软骨母细胞，基质染色不均匀；修复5周后可见少许软骨区大量软骨样细胞，密度稍低，可见少许软骨母细胞。模型对照组修复后2，5周可见毛细心血管分布，软骨细胞较少，排列不均匀，见图4。

2.6 各组家兔修复后2，5周番红O染色比较观察组家兔修复2周后缺损部位着色均匀，蛋白多糖分布相对均匀，修复5周后缺损部位形态与正常软骨相似，深层蛋白多糖、软骨陷窝分布均匀；玻璃酸钠组家兔修复2周细胞分布不均匀，深层蛋白被染成橙红色；修复5周后浅层细胞较多，深层蛋白多糖及软骨陷窝存在明显着色；模型对照组修复2周、5周后深层染色偏白，软骨基质相对较少，见图5。

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引言

关节软骨损伤属于是一种多发性疾病，且在不同的年龄段均可发病，随着中国交通运输、建筑行业的不断发展，导致关节软骨缺损发生率呈现上升趋势。患者发病早期如果得不到及时有效的治疗，将会演变为骨性关节炎，严重影响居民健康。数据报道显示^[1]：美国骨性关节炎患者超过2 000万人，发病率为12.5%，发病后容易引起患者工作能力的丧失，其危害仅次于心脏疾病。由于关节软骨位置相对特殊，该部位缺乏血管、神经等组织，一旦发生缺损，自我修复能力较低，从而引起关节活动受限^[2]。目前，临床上对于关节软骨缺损修复方法相对较多，包括：手术治疗、生物学方法和物理学方法，但是这些小方法各有优缺点，难以满足每一位患者修复需要。

早在1997年，美国批准关节腔内注射透明质酸钠治疗膝骨性关节炎，后经大量研究发现：关节腔内注射透明质酸钠能促进膝骨性关节软骨基质的合成，有效的抑制基质的降解，能促进关节的修复、保护关节、避免病情进一步发展^[3]。同时，关节腔内注射透明质酸钠还能有效的缓解机体疼痛，提高患膝功能。超声属于是一种诊断、治疗手段，物理治疗时主要利用1-3 W/cm²超声波强度，治疗时能产生热量，能减轻关节软骨缺损引起的疼痛，改善关节和肌肉活动^[4]。文献报道显示：低强度超声能促进结缔组织再生，能促进骨折、骨不连愈合^[5]，不仅能缩短治疗时间，还能提高生物力学性能，通过促进软骨细胞增殖、提高骨关节炎软骨基质中蛋白多糖的含量及Ⅱ型胶原的合成，从而能促进关节软骨缺损修复^[6]。骨折的愈合是一个多因素过程，多种研究表明低强度脉冲超声能促进骨折愈合，加速软骨形成，但是其研究更多的局限于组织形态学的观察，对于低强度超声修复的机制及细胞学的影响缺乏报道。

实验建立关节软骨缺损模型，探讨低强度脉冲超声联合关节腔内注射玻璃钠在家兔关节软骨缺损中的修复效果。

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材料方法

1.1 设计动物模型制备及随机对照实验。

1.2 时间及地点 2013年12月至2016年9月潍坊医学院实验室进行动物实验。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 60只家兔，雌雄随机，兔龄为4-6个月，体质量2.02-2.68 kg，平均(2.28±0.46) kg，由潍坊医学院实验室动物实验中心提供。实验过程中对家兔饲养、处理均符合《关于善待实验动物的指导性意见》相关规则^[⁷^]。所有实验均通过潍坊医学院动物委员会批准同意。60只家兔根据处理方法分为模型对照组(n=20)、玻璃酸钠组(n=20)和观察组(n=20)。

1.3.2 主要仪器和试剂注射用玻璃酸钠(施沛特，山东博士伦福瑞达制药有限公司)；造模型用的手钻(直径3.00 mm，距离钻头顶端5.0 mm处有明显标记，由潍坊医学院附属益都中心医院提供)；低强度脉冲超声治疗仪(重庆医科大学医学超声工程研究所)；图像数字分析仪(美国 Bio-RAD公司)；光学、电子显微镜 (日本Olympus公司)；戊巴比妥钠(华北制药厂)；青霉素钠(西南药业股份有限公司)。

1.3.3 低强度脉冲超声治疗仪由电源供给系统、功率发生率器及超声换能器3部分组成。低强度脉冲超声强度为30 mW/cm²，工作频率为0.6 MHz、1.0 MHz以及1.5 MHz，脉冲宽度为200 is，重复频率为1 kHz，每次使用过程中进行常规参数调整。同时，低强度脉冲超声治疗仪设置时间控制装置，固定设置时间为20 min，治疗完毕后自动关机并报警，见图1。

1.4 方法

1.4.1 关节软骨缺损模型建立选家兔在手术前一天下午，采用9%硫酸钠对双肢脱毛，根据家兔体质量采用3%戊巴比妥钠25 mg/kg耳缘静脉注射进行静脉麻醉，待麻醉生效后家兔保持仰卧位姿势，利用绷带完成家兔四肢的固定，采用碘酒、乙醇对一侧后肢皮肤消毒，铺好洞巾，采用缝线将洞巾固定在皮肤上。取膝关节前切口，在髌骨下纵向做一个长为2 cm的手术切口，逐层深入，切开关节囊，充分暴露股骨踝间窝关节面，利用直径3.00、深度3 mm的骨软骨缺损，建立模型时应保持动作轻柔，避免对邻近软骨面产生损伤。钻孔时深度到3.0 mm明显标记处即可，见图2^[⁸^-⁹^]。

家兔模型建立完毕后，采用生理盐水完成伤口的冲洗，逐层缝合切口，不进行包扎、固定。手术后给予10⁵ U/kg青霉素钠肌肉注射预防感染，1次/d，连续使用3 d。3组家兔均采用营养颗粒饲料进行喂养，自由饮水。

1.4.2 家兔的处理所有家兔建模后72 h时开始进行治疗处理。①模型对照组建模成功后不采取任何措施处理，家兔自由饮食，自由活动；②玻璃酸钠组关节腔内注射玻璃酸钠。修复方法：对家兔缺损部位进行常规消毒，佩戴一次性无菌操作手套，采用5 mL一次性注射器对准穿刺点进入关节腔，对于伴有关节积液家兔应该尽可能抽尽关节液，然后将2 mL注射用玻璃酸钠缓慢注入关节腔内，注射完毕后采用碘酒对穿刺部位进行消毒，采用无菌敷料进行覆盖，被动活动患肢使得玻璃酸钠均匀分布，保持穿刺部位局部干燥、清洁，每周注射1次，连续性注射5次^[1⁰^]；③观察组在玻璃酸钠组基础上联合低强度脉冲超声。修复方法：家兔在建模后72 h即开始进行低强度脉冲超声波治疗，治疗前肌肉注射5%-10%戊巴比妥钠，待家兔活动量明显减少后保持仰卧位姿势。治疗时2人配合，一人安扶家兔，一人手持超声治疗头，治疗时将治疗仪的治疗头紧贴在家兔关节软骨缺损部位，治疗头上涂抹耦合剂，治疗过程中不移动治疗头的位置，设置超声脉冲相关参数：强度 30 mW/cm²，频率1.5 MHz，脉冲宽度200 is，每天治疗 1次，每次20 min，连续治疗5 d(1个疗程)^[1¹^]。

1.5 主要观察指标

1.5.1 大体观察修复后2周及5周后2个时间点各处死家兔5只，采用耳缘静脉注射空气栓塞方法处死家兔，取缺损部位组织，观察关节软骨缺损部位的形态、色泽以及与周围组织的关系^[1²^]。

1.5.2 Wakitani组织学评分观察3组家兔修复后2周、5周Wakitani组织学评分情况，该评分法共有5项，总分0-14分，得分越低，修复效果越理想^[1³^]。

1.5.3 组织学观察 3组家兔修复后2周、5周苏木精-伊红染色、番红O染色情况。大体观察后取家兔缺损部位组织，以锋利剪刀获得大小为0.5 mm×1 mm×1 mm，将其放入2.5%戊二醛固定液中，采用组织切片制备4 μm切片，染色前采用二甲苯进行拖拉处理，常规苏木精-伊红及番红O染色，倒置显微镜下观察缺损部位情况。

1.6 统计学分析采用SPSS 18.0软件处理，计数资料采用n(%)表示，行卡方检验，计量资料采用x(_)±s表示，行t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

关节软骨位置相对特殊，既无神经支配，也缺乏血液、淋巴供应，导致该部位细胞密度、活性相对较低，当机体关节软骨发生缺损后难以实现自我修复，从而逐渐演变为不可逆的退行性骨关节病，影响患者健康^[14]。文献报道显示：关节软骨缺损的发生、发展与传导载荷、吸收震荡、受力等有关^[15]。因此，采取安全、科学的方法提高关节软骨缺损修复效果具有重要的意义。

近年来，低强度脉冲超声联合关节腔内注射玻璃酸钠在家兔关节软骨缺损中得到应用，且效果理想。本研究中，3组家兔建模麻醉清醒后饮食、饮水相对较少，建模后12 h逐渐恢复正常饮食、饮水。术后5 d家兔均能站立，1周基本能行走。所有家兔均未见缺损部位关节红肿，切口均得到良好的愈合。关节腔内注射玻璃酸钠是常用的修复方法，该材料属于是一种N-乙酰葡萄醛酸反复交替而成的高分子材料，是人体内天然组成部分，广泛存在于多种人体组织中。而在关节内的透明质酸钠主要由纤维样滑膜细胞分泌而成，注射后能维持关节内环境稳态。同时，透明质酸钠具有较高的粘弹性和可塑性，能改善关节滑液的流体特征，发挥润滑关节，减少关节机械磨损等作用^[16]。此外，关节腔内注射玻璃酸钠还能渗入关节软骨内，能改善关节软骨细胞的营养，进一步促进细胞的增殖、抑制细胞凋亡，从而能有效的抑制关节基质的降解，能保护关节软骨作用^[17]。研究中，模型对照组未采取任何措施处理，修复2周后缺损部位凹陷明显，周围软骨色泽正常；修复5周后家兔缺损部位未见完全修复，但是缺损直径缩小，表面不平整且低于周围组织。玻璃酸钠组家兔修复2周后缺损部位未见完全修复，边界清晰；修复5后缺损部位与正常软骨组织边界清晰；观察组修复2周后大部分缺损部位已经修复；修复5周后缺损部位完全修复。文献报道显示：关节腔内注射透明质酸钠打破了由透明质酸钠的关节内环境稳定^[18]，避免形成恶性循环，能促进膝骨性关节炎的发生、发展，实现缺损部位的生理作用，达到关节软骨缺损的修复目的。

低强度脉冲超声也是关节软骨缺损中常用的修复方法，该方法属于是一种物理治疗方法，采用脉冲的工作模式，能实现软骨损伤的治疗。目前，对于低强度脉冲超声治疗关节软骨缺损修复的机制尚不完全知晓，可分为以下几方面^[19]：①采用低强度脉冲超声治疗时以声能的形式穿过机体组织，并且能将声能转化为热能，从而能使得局部产生微热作用，从而提高组织对温度的敏感性，增强生物酶的活性，从而促进细胞新陈代谢；②采用低强度脉冲超声修复关节软骨缺损部位能产生空穴效应，直接作用与细胞内，从而能提高细胞膜的穿透性，加快细胞营养物质的摄取及排出，增强细胞新陈代谢。研究中，观察组修复2周时可见大量细胞增殖，且多以纤维母细胞为主；修复后5周缺损部位细胞排列整齐；玻璃酸钠组修复2周后可见大量纤维母细胞增殖；修复5周后可见少许软骨区大量软骨样细胞；模型对照组修复后2，5周可见毛细心血管分布，排列不均匀。文献报道显示：低强度脉冲超声对关节软骨缺损具有良好的促进作用，能提高关节细胞中硫酸盐的含量，具有促进细胞增殖及合成作用。家兔关节软骨缺损中在关节腔内注射玻璃酸钠基础上联合低强度脉冲超声治疗效果理想，能发挥不同修复方法优势，达到优势互补，促进缺损部位早期修复。研究中，观察组家兔修复2周后缺损部位着色均匀，蛋白多糖分布相对均匀；修复5周后缺损部位形态与正常软骨相似；玻璃酸钠组家兔修复2周细胞分布不均匀，深层蛋白被染成橙红色；修复5周后深层蛋白多糖及软骨陷窝存在明显着色；模型对照组修复2周、5周后深层染色偏白。由此看出：低强度脉冲超声联合关节腔内注射玻璃酸钠的修复效果。

综上所述，家兔关节软骨缺损中在关节腔内注射玻璃酸钠基础上联合低强度脉冲超声治疗效果理想，能促进缺损部位修复，改善关节软骨功能，具有广泛的运用前景。

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