骨髓间充质干细胞复合双相磷酸钙陶瓷对幼年大鼠软骨损伤修复的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.30.005

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

双相磷酸钙陶瓷：是一种由羟基磷灰石和β-磷酸三钙按照不同比例混合构成的生物活性陶瓷，其化学组成与骨组织的无机成分十分相近，目前大量研究表明该材料具有优良的生物相容性、骨诱导性、骨传导性及降解速率可调控等特点，因此有望成为理想的骨替代材料。

修复：损伤造成机体部分细胞和组织丧失后，机体对所形成缺损进行修补恢复的过程，称为修复。修复对生物个体和物种的生存极为重要，如DNA突变损伤后进行修复时，通过各种酶(如DNA聚合酶、连接酶等)协同作用，以保持DNA分子中信息完整。

背景：小儿股骨头坏死症的发病机制与压力负荷和炎症导致的髋关节软骨损伤有关。

目的：观察骨髓间充质干细胞复合双相磷酸钙陶瓷对幼年大鼠软骨损伤修复的影响。

方法：将30只1周龄SD雄性大鼠随机分为3组，即空白组、对照组和观察组。其中，空白组不进行任何处理，对照组和观察组采用改良Hulth方法制备幼年大鼠髋关节软骨损伤模型，观察组大鼠植入骨髓间充质干细胞复合双相磷酸钙陶瓷，对照组大鼠植入骨髓间充质干细胞复合羟基磷灰石陶瓷。植入后4周，观察各组关节软骨的病理学变化，采用MTT法和流式细胞仪测定各组软骨细胞的增殖和凋亡情况。

结果与结论：①空白组关节软骨平滑、完整；对照组关节软骨损害明显，关节软骨表面破裂、缺损、凹凸不平，软骨四层结构不清晰；观察组关节软骨损伤得到一定程度的修复；②在相同观察时间点，观察组的细胞活性较对照组显著升高(均P < 0.05)，凋亡细胞比例显著降低(均P < 0.05)；③结果表明，骨髓间充质干细胞复合双相磷酸钙陶瓷能促进幼年大鼠软骨损伤的修复。

ORCID: 0000-0002-8049-8878(李国威)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 软骨生物材料, 骨髓间充质干细胞, 软骨细胞, 细胞凋亡, 双相磷酸钙陶瓷, 小儿股骨头坏死症, 髋关节软骨损伤

Abstract:

BACKGROUND: The pathogenesis of pediatric femoral head necrosis is associated with cartilage injury of the hip joint induced by stress and inflammation.

OBJECTIVE: To observe the effect of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs)/biphasic calcium phosphate ceramics (B-CPC) on cartilage repair in juvenile rats.

METHODS: Thirty male Sprague-Dawley rats, aged 1 week, were randomized into three groups. No intervention was done in blank group. A juvenile rat model of articular cartilage injury was made using improved Hulth’s method in control and observational groups, followed by implantation of BMSCs/hydroxyapatite and BMSCs/B-CPC, respectively. Four weeks later, the rat articular cartilage was observed pathologically, and MTT and flow cytometry were employed to detect chondrocyte proliferation and apoptosis, respectively.

RESULTS AND CONCLUSION: The articular cartilage of the rats in the blank group was smooth and complete. In the control group, articular cartilage damage was obvious, presenting with rupture, defect and irregularity of the articular cartilage surface, as well as unclear four-layer structure of the cartilage. In the observational group, articular cartilage injury was repaired to some extent. At the same observation time, the cell viability was significantly increased in the observational group compared with the control group (all P < 0.05), and the proportion of apoptotic cells was significantly decreased (all P < 0.05). To conclude, BMSCs/B-CPC composite can promote the cartilage repair in juvenile rats.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Calcium Phosphates, Chondrocytes, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

李国威，郭远清，陈涛，张奎渤，于兵，张大卫，张荣凯. 骨髓间充质干细胞复合双相磷酸钙陶瓷对幼年大鼠软骨损伤修复的影响[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(30): 4781-4786.

Li Guo-wei, Guo Yuan-qing, Chen Tao, Zhang Kui-bo, Yu Bing, Zhang Da-wei, Zhang Rong-kai .

Bone marrow mesenchymal stem cells/biphasic calcium phosphate ceramics for cartilage repair in juvenile rats

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(30): 4781-4786.

图/表（结果） 4

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引言

小儿股骨头坏死症是一种严重危害儿童健康，以髋关节功能障碍为特点的退行性关节疾病^[1-2]。目前，关于小儿股骨头坏死症的发病原因及其机制并不完全清楚，有证据表明，它是由于许多因素，包括遗传因素、围产期关节损伤、基因突变等各种不同因素综合作用的结果^[3-4]。研究表明，压力能够刺激关节软骨细胞分泌炎症细胞因子和蛋白水解酶，导致胶原蛋白的降解，使软骨基质发生变性，从而造成软骨损伤^[5]。由于软骨细胞的某些功能存在不足，即自身修复能力较差，当其受到损伤时，无法自行逆转损伤的病理生理过程。因此，软骨细胞损伤和小儿股骨头坏死症的发生发展有着非常密切的关系。目前临床上治疗小儿股骨头坏死症的方法并不能从根本上治愈关节软骨的损伤^[6-7]。因此，明确小儿股骨头坏死症的主要原因及其机制，并进一步采用全新和有效的治疗方法，对于治疗小儿股骨头坏死，促进其髋关节功能恢复具有重要的意义。

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)复合双相磷酸钙陶瓷(biphasic calcium phosphate ceramics，BCP)是近年来开始应用于临床的新型复合材料，其具有良好的生物相容性和可降解性，目前越来越受到领域内的关注。研究发现，骨髓间充质干细胞复合双相磷酸钙陶瓷材料具有其独特优势，例如能够促进骨融合，并且可替代自体骨移植。但是，关于其对软骨损伤的修复作用相关研究目前尚不多见^[8]。

实验以幼年大鼠为原材料，制作软骨损伤的动物实验模型，研究了骨髓间充质干细胞复合双相磷酸钙陶瓷对于软骨损伤的修复作用，并探讨了其潜在的作用机制，为临床运用骨髓间充质干细胞复合双相磷酸钙陶瓷治疗小儿股骨头坏死症提供了一定的理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2015年7月至2016年6月在中山大学附属第五医院中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物健康雄性SD大鼠30只，1周龄，体质量17-23 g，由四川大学华西医学中心实验动物中心提供(川质动管质第8号)。将30只大鼠按照抽签法随机分为3组，即空白组、对照组和观察组，每组10只。健康成年雄性SD大鼠1只，体质量200 g，用于制备骨髓间充质干细胞，由四川大学华西医学中心实验动物中心提供。

1.3.2 主要材料和试剂多孔纳米双相磷酸钙陶瓷和普通羟基磷灰石陶瓷(四川大学口腔生物医学工程教育部重点实验室)；CD29-PE，CD34-PE，CD44-PE，CD45-PE和CD105-PE单克隆抗体(Santa Cruz，美国)；DMEM培养基(Hyclone公司，美国)；胎牛血清(杭州四季青生物制品有限公司，中国)；胰蛋白酶(Sigma公司，美国)；Ⅱ型胶原酶(GIBCO公司，美国)；MTT(江苏碧云天生物制品有限公司，中国)；羊抗兔Ⅱ型胶原单克隆抗体免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司，中国)；免疫组织化学SABC试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司，中国)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(江苏碧云天生物制品有限公司，中国)。

1.3.3 主要仪器设备台式高速离心机(Eppendorf公司，美国)；超净工作台(苏州净化设备公司，中国)；二氧化碳细胞培养箱(Shellab公司，美国)；倒置相差显微镜(Olympus公司，日本)；超低温冰箱(Siemens公司，德国)。

1.4 方法

1.4.1 大鼠骨髓间充质干细胞的培养及成骨诱导分化^[9] 将1只SD大鼠按照颈椎脱臼法处死，浸泡于体积分数为75%乙醇中5 min进行消毒，手术铺巾，于无菌条件下切开大鼠下肢，然后逐层分解取出其股骨、胫骨，再切除两端骨骺，用5 mL一次性注射器吸取4 mL PBS注入骨髓腔内完全冲出骨髓。将冲出液合并后用滴管反复吹打，以尽量分散团块。1 500 r/min，离心4 min，用体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打后接种于培养瓶中，倒置显微镜下观察见到瓶底有少量梭形细胞贴壁生长，给予半量换液，之后每3 d全量换液1次，待细胞占培养瓶底大部分面积(约80%)时，用0.25%胰蛋白酶消化，以1︰3比例进行传代培养。

原代细胞传代至第3代，用1 mL注射器收集细胞悬液，并充分分散细胞，调整细胞浓度至1.0×10⁸ L^-1，流式细胞仪测定细胞表型，其表达CD29，CD44和CD105，不表达CD34，CD45，符合间充质干细胞表型。

将获得的第3代骨髓间充质干细胞接种于含体积分数为15%胎牛血清、10 nmol/L地塞米松、50 mg/L维生素C，10 mmol/L β-甘油磷酸钠的DMEM培养基中，37 ℃、体积分数为5%CO₂细胞培养箱中培养14 d。

1.4.2 纳米双相磷酸钙陶瓷及羟基磷灰石试样制备将纳米双相磷酸钙陶瓷(70%羟基磷灰石、30%磷酸三钙，含孔率60%-80%，孔径100-400 μm)及相同孔径和孔隙率的羟基磷灰石陶瓷制备成5.0 mm×5.0 mm×1.0 mm大小各8块，超声净化，高压灭菌。上述材料均由四川大学口腔生物医学工程教育部重点实验室提供。

1.4.3 成骨细胞表型的鉴定及细胞生物陶瓷复合体的构建 ①鉴定：大鼠骨髓间充质干细胞经成骨诱导培养14 d后，行矿化沉积茜素红染色，Ⅰ型胶原及碱性磷酸酶细胞化学染色；②细胞生物陶瓷复合体的构建：骨髓间充质干细胞经成骨诱导培养14 d后，用0.25%胰酶消化，离心半径25 cm、1 000 r/min离心8 min，计数，制成5×10⁹ L^-1的细胞悬液，与处理过的生物陶瓷一同置入10 mm×50 mm带胶塞试管中，用注射器抽成负压以使细胞渗入陶瓷孔隙。室温放置一两个小时后放于35 mm培养皿中，加入完全培养基于37 ℃、体积分数为5%CO₂孵箱中培养。

1.4.4 动物模型的制备观察组和对照组大鼠采用改良Hulth方法^[1⁰^]制备髋关节软骨损伤模型。大鼠手术部位常规消毒和铺巾，从双侧髋关节外侧入路，开放髋关节囊，完全切除髋关节面，不损伤股骨头。观察组植入骨髓间充质干细胞复合双相磷酸钙陶瓷，对照组植入骨髓间充质干细胞复合羟基磷灰石陶瓷，给予无菌敷料，定期换药。强迫大鼠每天活动30 min，连续活动4周后可获得髋关节软骨损伤模型。空白组不进行任何处理。

1.4.5 软骨细胞获取造模4周后，将大鼠颈椎脱臼法处死，在体积分数为75%乙醇中浸泡10 min进行消毒，然后移入超净工作台，用手术刀切取约2 mm厚的双侧股骨头软骨，剪成1 mm大小，用0.25%胰蛋白酶和0.25%Ⅱ胶原酶，在37 ℃和体积分数为5%CO₂培养箱消化4-6 h。显微镜下观察到绝大多数软骨细胞分离后，在37℃和体积分数为5%CO₂培养箱中继续培养。

1.4.6 细胞活力测定(MTT法)^[1¹^] 将处于对数生长期的软骨细胞消化离心重悬成为单细胞悬液。以每孔5×10³个细胞接种于96孔板，在37 ℃和体积分数为5%CO₂培养箱过夜，换液，加入5 g/L MTT 20 μL，4 h后吸去上清，添加150 μL二甲基亚砜，避光振荡10 min，在酶标仪中检测450 nm波长处的吸光度值。

1.4.7 流式细胞仪检测细胞凋亡^[1²^] 将软骨细胞常规消化离心重悬成为单个细胞悬液。以每孔2×10⁵个细胞接种于96孔板，在37 ℃和体积分数为5%CO₂培养箱过夜。吸去孔中培养基，换液，每孔加入100 μL含有不同浓度二甲双胍的培养液。培养24 h，消化、离心、收集细胞。250 μL组合缓冲液重悬，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-1。100 μL细胞悬液加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，孵育15 min，上流式细胞仪检测。

1.5 主要观察指标 ①髋关节软骨光镜下病理变化：采用苏木精-伊红染色，倒置显微镜观察各组镜下软骨细胞排列情况；②关节软骨形态学变化：Mankin’s 评分表对各组大鼠髋关节软骨得分进行评价^[1³^]；③细胞活力：MTT法测定450 nm波长处的吸光度值；④细胞凋亡：流式细胞仪检测细胞凋亡的比例。

1.6 统计学分析采用IBM SPSS 17.0统计学软件处理数据。每组实验重复3次，计量资料以x(_)±s表示。根据实验设计使用单因素方差分析，组间比较进行t 检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

关节软骨损伤是小儿股骨头坏死症发生发展的重要因素之一^[14]。目前，对于小儿股骨头坏死症中的关节软骨损伤的主要原因和机制并不完全清楚。研究表明，压力和炎症会激活关节软骨细胞，从而导致炎症因子和蛋白水解酶的分泌，通过分解胶原蛋白纤维，使软骨细胞外基质发生变性，导致软骨细胞损伤^[15-17]。相关研究发现，软骨的自身修复能力较差，无法自行逆转损伤的病理生理过程。因此，作为关节软骨组织中惟一的细胞成分，软骨细胞的生理和病理变化与小儿股骨头坏死症的发生和发展有着非常密切的关系^[18]。

实验采用改良的Hulth方法制备幼年大鼠髋关节软骨损伤的动物模型。在去除大鼠髋关节的月状面之后，强迫大鼠活动，以造成髋关节股骨头软骨面的压力损伤和炎症反应，此种设计更加符合小儿股骨头坏死症中软骨细胞压力和炎症损伤的机制。

研究表明，骨髓间充质干细胞具有在体外和体内向多种间充质细胞分化的功能，已成为组织工程最重要的细胞之一^[19-21]。骨髓间充质干细胞在矿化诱导后能分化为成骨细胞^[22]，无机的磷酸钙陶瓷材料由于缺乏细胞识别位点，表面活性低，亲和力差，导致细胞黏附性差，在实际应用中经常需要进行表面改性以提高黏附力。而具有生物活性的纳米材料具有界面效应，使材料的比表面积增加，表面活性增大，具有引导组织细胞生长的能力^[23]。Webster等^[24]的研究结果证实，纳米陶瓷材料可以大量地吸附玻璃体结合蛋白，可有选择性地吸附成骨细胞，而对成纤维细胞则无此吸附作用。

双相磷酸钙陶瓷是由一种由羟基磷灰石和β-磷酸三钙按照不同比例混合构成的生物活性陶瓷，其化学组成与骨组织的无机成分十分相近，目前大量研究表明该材料具有优良的生物相容性、骨诱导性、骨传导性及降解速率可调控等特点，因此有望成为理想的骨替代材料^[25-29]。王涛等^[30]将SD大鼠骨髓基质细胞经矿化诱导培养、扩增并检测证实其已具成骨细胞表型后，分别与多孔纳米双相磷酸钙陶瓷支架(实验组)、普通多孔羟基磷灰石陶瓷支架(对照组)体外复合培养，结果表明，两组材料上皆有细胞附着生长，但实验组细胞的黏附能力、增殖活力及成骨活性均强于对照组，说明SD大鼠骨髓基质细胞与新型多孔纳米双相磷酸钙陶瓷支架材料有良好的细胞相容性。王永明等^[8]探索自体骨髓间充质干细胞复合双相磷酸钙陶瓷在腰椎骨折患者脊柱融合中的应用，将体外分离培养患者自体骨髓间充质干细胞复合双相磷酸钙陶瓷材料后，回植于胸腰椎体骨折处，采用后路腰椎椎体间融合术，钛合金椎弓根钉棒系统作脊柱内固定。结果显示，患者术后6个月Lenke字母分级均为A、B级，伤椎复位效果良好，优良率为68%(17/25)，说明自体骨髓间充质干细胞复合双相磷酸钙陶瓷材料是一种优良的促进脊柱融合方法，可替代自体髂骨移植。

虽然骨髓间充质干细胞复合双相磷酸钙陶瓷具有调节抗炎症和促进骨折愈合等临床功效^[31-32]，但是其对于软骨损伤的作用，特别是对于小儿股骨头坏死症的直接作用，国内外却未有报道。实验结果表明，压力和炎症可以促使幼年大鼠的软骨损伤。骨髓间充质干细胞复合双相磷酸钙陶瓷对于软骨损伤有一定的修复作用^[33-34]。关节软骨是由软骨细胞及细胞外基质构成^[35]，从外到内，可分为4个层次的结构，包括表浅层、过渡层、辐射层和钙化层。通过病理切片观察到空白组关节软骨苏木精-伊红染色均匀，层次清晰明显，可见关节软骨表层平滑完整，无破损、裂隙，4层结构清晰，细胞均匀分布，排列呈柱状，无团簇现象，潮线完整而清晰。对照组染色不均匀，关节表面凹凸不平，表面存在缺损、裂隙，甚至裂隙可达深层，软骨细胞分布不均匀，软骨细胞数量明显减少，可见软骨细胞凋亡现象，软骨4层结构不清晰，可见大量软骨细胞簇集，潮线不完整、模糊，部分可见血管翳现象。而观察组关节软骨苏木精-伊红染色均匀，层次清晰明显，显微镜下观察软骨细胞增加，排列轻度紊乱，潮线的清晰完整程度较模型组改善。上述实验结果提示，利用骨髓间充质干细胞复合双相磷酸钙陶瓷对幼年大鼠坏死的股骨头进行修复，可明显改善软骨的损伤程度，促进康复。支持以往的相关结论^[33-34]。

另外，实验进一步采用MTT法和流式细胞仪测定上述各组软骨细胞的增殖和凋亡情况，并在相同观察时间点进行组间比较。实验结果显示，与对照组相比较，观察组的软骨细胞增殖明显增加(P < 0.05)，软骨细胞的凋亡比例也明显下降(P < 0.05)。这再次证实了骨髓间充质干细胞复合双相磷酸钙陶瓷在修复幼年大鼠软骨损伤中的显著作用。

以往研究表明，压力和损伤如果达到一定的阈值，可以造成幼年小鼠软骨损伤^[36]。而骨髓间充质干细胞复合双相磷酸钙陶瓷通过促进幼年小鼠软骨细胞增殖，抑制压力应激诱导的细胞凋亡，从而促进了软骨损伤的修复。

结论：压力和炎症可以抑制幼年大鼠软骨细胞增殖，并且导致幼年大鼠软骨细胞凋亡，这种机制可能是造成小儿股骨头坏死症的重要原因之一。骨髓间充质干细胞复合双相磷酸钙陶瓷可以明显促进压力和炎症作用下软骨细胞的增殖，降低软骨细胞的凋亡比例，从而促进了软骨损伤修复，为临床上应用骨髓间充质干细胞复合双相磷酸钙陶瓷治疗小儿股骨头坏死症提供了一定的思路和线索。这对于治疗小儿股骨头坏死，促进其髋关节功能恢复具有重要的理论和实际意义。

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