含锌镁合金对人成骨肉瘤U2OS细胞株体外增殖的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.30.003

摘要/Abstract

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文题释义：

锌与肿瘤细胞的关系：锌与肿瘤细胞的增殖、凋亡等密切相关，能够选择性抑制A549、Caco-2、HeLa、HepG2、HT29 等肿瘤细胞的生长。因此，作者将锌添加入纯镁中制备出不同锌含量镁锌合金Mg-xZn，通过实验证明其抗肿瘤效果，并对其机制进行初步探究。

背景：合金化可提高纯镁的抗腐蚀性能，延缓其降解速率；大量文献表明锌具有良好的抗肿瘤效果。

目的：评价含锌镁合金对人成骨肉瘤U2OS细胞体外增殖及凋亡的影响。

方法：检测纯镁及不同含锌量镁合金(质量分数2%、4%、6%)在Hank’s液中的氢气释放速率。取人成骨肉瘤U2OS细胞(或MC3T3-E1细胞)，分别与不同含锌量镁合金浸提液、纯镁浸提液及钛合金浸提液共培养1，3，5 d，MTT法检测细胞增殖。取人成骨肉瘤U2OS细胞，分别与不同含锌量镁合金浸提液、纯镁浸提液及钛合金浸提液共培养24 h，流式细胞仪分析细胞凋亡，Western Blotting检测凋亡相关蛋白的表达水平。

结果与结论：①在初始的100 h内，纯镁组氢气释放速率明显高于含锌镁合金组；在不同含锌量镁合金组中，以含锌量4%镁合金组氢气释放速率最慢；②不同含锌量镁合金均可明显抑制人成骨肉瘤U2OS细胞的增殖，且与锌含量呈正相关；不同含锌量镁合金对MC3T3-E1细胞的毒性在0至1级之间；③不同含锌量的镁合金可明显促进人成骨肉瘤U2OS细胞的凋亡，且与锌含量呈正相关；④不同含锌量镁合金可上调人成骨肉瘤U2OS细胞p53、Bax蛋白表达，下调Bcl-2蛋白表达，改变Bcl-2/Bax比例，其中以含锌量4%镁合金效果最显著；⑤结果表明：含锌镁合金可抑制人成骨肉瘤U2OS细胞的体外增殖，诱导其凋亡。

ORCID: 0000-0002-3648-7004(杨万石)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 镁锌合金, 人成骨肉瘤U2OS细胞, 细胞增殖, 细胞凋亡

Abstract:

BACKGROUND: Alloying can improve the corrosion resistance and slow the degradation of pure magnesium. In addition, increasing studies have shown that zinc has good antitumor effect.

OBJECTIVE: To evaluate the effect of zinc-containing magnesium alloy on the proliferation and apoptosis of human osteosarcoma U2OS cells in vitro.

METHODS: The corrosion resistance of pure magnesium and different zinc-containing (2%, 4%, 6%) magnesium alloys were observed and compared by the hydrogen release assay in the Hank’s solution. MTT assay was used to examine the effects of different zinc-containing magnesium alloy extractions on the proliferation of U2OS cells (or MC3T3-E1 cells) after co-culture of 1, 3, 5 days. After 24-hour co-culture with pure magnesium, different zinc-containing magnesium alloys and titanium alloy extractions, the apoptotic rates of U2OS cells were analyzed by flow cytometry, and the expression of apoptosis-related proteins were detected by western blot assay.

RESULTS AND CONCLUSION: The corrosion resistance of pure magnesium was improved after addition of Zn within the initial 100 hours, and the magnesium alloy containing 4% zinc exhibited the optimal corrosion resistance. Different zinc-containing magnesium alloy extractions obviously inhibited the U2OS proliferation in a zinc level-depended manner, and the cytotoxicity of different zinc-containing magnesium alloy extractions to MC3T3-E1 was graded 0-1. Different zinc-containing magnesium alloy extractions could also induce obvious apoptosis in U2OS cells in a zinc level-depended manner. Different zinc-containing magnesium alloy extractions, especially the magnesium alloy containing 4% zinc, up-regulated the expression of p53 and Bax proteins and down-regulated the expression of Bcl-2 protein in U2OS cells, leading to the disorder of Bcl-2/Bax. These findings suggest that different zinc-containing magnesium alloy extractions can inhibit the proliferation and induce apoptosis of U2OS cells in vitro.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Alloy, Zinc, Osteosarcoma, Cell Proliferation, Apoptosis, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

赵小魁，何保华，邵楠，张胜国，杨万石. 含锌镁合金对人成骨肉瘤U2OS细胞株体外增殖的影响[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(30): 4769-4774.

Zhao Xiao-kui, He Bao-hua, Shao Nan, Zhang Sheng-guo, Yang Wan-shi.

Effects of zinc-containing magnesium alloys on proliferation of human osteosarcoma U2OS cells in vitro

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(30): 4769-4774.

图/表（结果） 5

2.1 材料体外降解实验结果释氢实验结果表明(图1)，在初始100 h内，纯镁组氢气释放率明显高于含锌镁合金组，之后接近于平稳；当浸泡100 h后，各组之间氢气释放率接近。整个过程中，随着时间的增加，含锌镁合金组氢气释放率缓慢增加，其中含锌6%镁合金组速率最快，含锌4%镁合金组氢气释放速率始终保持最慢。

2.2 材料浸提液对U2OS及MC3T3-E1细胞形态学及增殖的影响

U2OS细胞：共培养5 d后，倒置显微镜下观察(图2A-E)发现，钛合金浸提液组细胞呈长梭形贴壁生长良好，其余各材料浸提液组中可见部分细胞体积变小、变圆，伪足消失，部分细胞脱壁浮起，随着锌含量的增加，细胞形态改变增多，细胞生长明显减慢，部分细胞坏死。MTT实验结果表明(图2F)，各材料浸提液组中U2OS细胞增殖均受到抑制，并且呈现明显的时间和剂量依赖性，当培养1，3 d时，含锌4%、6%镁合金浸提液组的细胞增殖低于纯镁浸提液组、钛合金浸提液组(P < 0.05)；培养5 d时，含锌镁合金浸提液组、纯镁浸提液组细胞增殖低于钛合金浸提液组 (P < 0.05)，含锌4%、6%镁合金浸提液组的细胞增殖低于纯镁浸提液组(P < 0.05)。

MC3T3-E1细胞：共培养5 d后，倒置显微镜下观察(图3A-E)发现，各组细胞正常生长，细胞形态呈梭形、贴壁良好，胞浆内可见少量离散的黑色颗粒，镜下未见明显细胞溶解等。共培养1，3 d后，各组A值基本相当，各组之间无明显差异；培养5 d时，含锌2%镁合金浸提液组细胞增殖高于钛合金浸提液组(P < 0.05)，见图3F。根据细胞增殖所测的A值计算出细胞相对增殖率，纯镁及含锌镁合金的细胞毒性分级均处于0至1级之间。

2.3 材料浸提液对U2OS细胞凋亡的影响流式细胞仪检测结果显示(图4)，纯镁及含锌镁合金浸提液可诱导U2OS细胞凋亡，随着锌含量的增加，凋亡细胞的百分比相应增加，其中含锌4%、6%镁合金浸提液组细胞凋亡百分比高于钛合金浸提液组(P < 0.05)。

2.4　材料浸提液作用后对U2OS细胞凋亡相关蛋白表达的影响纯镁及含锌镁合金浸提液组p53表达量高于钛合金浸提液组(P < 0.05)，并且其含量随着材料中锌含量的增高而增高；与钛合金浸提液组相比，纯镁及含锌镁合金浸提液组Bax表达量明显上调，Bcl-2表达量明显下调，其中含锌4%镁合金浸提液组Bax、Bcl-2表达量与钛合金浸提液组比较差异有显著性意义(P < 0.05)；同时，纯镁及含锌镁合金浸提液组Bcl-2/Bax比值均低于钛合金浸提液组，见图5。

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引言

骨肉瘤是临床上最常见的原发性恶性骨肿瘤，好发于儿童和青少年时期，其恶性程度高，预后差，手术切除后易复发，即使采用手术联合新化疗方案，患者5年生存率也仅为55%-68%^[1-2]。有文献表明，植入材料作为一种异物存在肿瘤切除部位，是原位肿瘤易复发的一个重要因素^[3-4]。因此，研发一种自身具有抗肿瘤效果的生物植入材料显得很有意义。

相对于传统钛合金、不锈钢、钴铬合金等永久性骨植入材料，金属镁及其合金因其优良的力学性能、良好的生物相容性及可生物降解等特性，已逐渐成为研究热点^[5]。合金化能够减缓植入部位镁合金降解率、提高其机械性能^[6-7]。因此，将具有特定功能的元素添加入纯镁中，不仅可提高材料本身的机械性能，同时能使其功能多样化。例如：Ca、Sr添加如纯镁中可显著提高其成骨性能^[8-9]，Cu、Ag的加入能增加镁合金的抗菌性能^[10-11]。然而有研究表明，Mg-Cu、Mg-Ag等合金毒性相对较大，生物性相容性较差^[12]，限制了其作为骨科植入材料在临床上的发展和应用。

Chen等^[13-15]研究已在体外及动物实验方面表明，镁锌合金在生物相容性及降解稳定性方面优于纯镁及可降解高分子聚乳酸等材料。有文献表明，锌离子不仅具有促进成骨、提高合金耐腐蚀性能和机械强度等功能，而且能够选择性地杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤生长^[16-19]。因此，此次课题制备出新型不同锌含量的镁锌合金，通过相关实验观察其抗肿瘤效果并对相关机制进行初步探究，为该系列具有抗肿瘤功能的镁锌合金植入材料应用于临床提供理论基础。

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材料方法

1.1 设计细胞学体外实验。

1.2 时间及地点实验于2015年8月至2016年8月在解放军广州军区广州总医院全军热区组织救治与组织修复重点实验室完成。

1.3 材料

金属合金材料：含锌镁合金Mg-xZn(x=2%、4%、6%)由上海奥芮济医疗科技有限公司制造，主要成分为镁(纯度99.9%)和锌(质量比分别为2%、4%、6%)。材料被加工成直径12 mm、厚2 mm的圆片状，在SiC砂纸上磨平并抛光后，用丙酮和无水乙醇超声清洗，在解放军广州军区广州总医院用29 kGy的⁶⁰Co射线消毒后待用。

细胞：人骨肉瘤U2OS细胞及小鼠MC3T3-E1细胞由中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库提供。

主要试剂及仪器：a-MEM 培养基、RPMI-1640、优等胎牛血清(Hyclone)；胰酶(GIBCO公司)AIR TECH 超净工作台(苏净集团安泰公司)；CO₂培养箱(Precision Scientific)；96孔板、24孔板和6孔板(Corning)；酶标仪(Multiskan Spectrum)；MTT(Sigma)；倒置显微镜(Olympus)；Annexin V-PE/7-AAD凋亡试剂盒(凯基生物公司)；鼠抗人Bcl-2和Bax多克隆抗体、兔抗鼠二抗IgG/HRP(美国Santa Cruz公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 材料浸提液的制备根据ISO10993-12标准，按可降解材料表面积/浸提介质为1.25 cm²/mL的比例，向装有3种含锌镁合金材料、纯镁材料及Ti-6AL-4V钛合金的离心管中分别加入含体积分数10%胎牛血清的α-MEM细胞培养液，放于37 ℃ CO₂培养箱中浸提72 h，提取浸提液后4 ℃冷藏待用，并分别记为a、b、c、d、e组。重复上述步骤，将培养液替换为含体积分数10%胎牛血清的RPMI-1640细胞培养液，再次制备材料浸提液，分别记为A、B、C、D、E组。

1.4.2 材料体外降解测试采用自行设计的设备测量镁合金材料在Hank’s液中的氢气释放率，评价该系列镁合金材料耐腐蚀性能。将3种含锌镁合金材料置于同样规格的烧杯中，用Hank’s液以1 cm²/40 mL比例浸泡至于37 ℃水浴箱中，以纯镁(纯度> 99.99%)作为对照组。将漏斗反向置于样品上，然后将装有Hank’s溶液的酸滴定管安装在漏斗上，收集从样品表面释放的氢气，检测析氢体积，并根据报道的方法计算析氢速率^[20]。

1.4.3 MTT实验

MC3T3-E1细胞增殖：取对数生长期的MC3T3-E1细胞，用胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，以2×10⁴/孔的密度接种到96 孔培养板，分6组培养，分别采用a、b、c、d、e组材料浸提液培养细胞，以含体积分数10%胎牛血清的α-MEM细胞培养液培养组作为空白对照组，5 d后倒置显微镜下观察细胞形态学变化；培养1，3，5 d后，分别加入MTT (5 g/L)，在37 ℃、体积分数5%CO₂条件下培养4 h，再加入DMSO溶解30 min。在96孔酶标仪(奥地利 Biocell-2010)上测定490 nm波长处的吸光度(A)值。各组每个时间段均做3个复孔。根据A值计算细胞相对增殖率，公式如下：细胞相对增殖率=(A值_{实验样品组}/A值_{空白对照组})×100%。

判定细胞毒性：当细胞相对增殖≥ 100%时，细胞毒性0级；当细胞增殖率在80%-99%之间时，细胞毒性为1级；当细胞相对增殖率在50%-79%之间时，细胞毒性为2级；当细胞相对增殖率在30%-49%之间时，细胞毒性为3级；当细胞相对增殖率在0-29%之间时，细胞毒性为4级。

U2OS细胞增殖：取对数生长期的U2OS细胞，分别采用A、B、C、D、E组材料浸提液培养细胞，以含体积分数体积分数10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养组作为空白对照组，5 d后倒置显微镜下观察细胞形态学变化；培养1，3，5 d后，分别加入MTT(5 g/L)，在37 ℃、体积分数5%CO₂条件下培养4 h，再加入DMSO溶解30 min。在96孔酶标仪(奥地利Biocell-2010)上测定490 nm波长处的吸光度(A)值。

1.4.4 细胞凋亡分析分别采用A、B、C、D、E组材料浸提液培养U2OS细胞，以含体积分数体积分数10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养组作为空白对照组，共培养24 h后，用4 ℃预冷的PBS洗涤细胞2次，250 μL PBS重新悬浮细胞，并调节细胞浓度为1×10⁹ L^-1。取100 μL细胞悬液于5 mL 流式管中，加入5 μL AnnexinⅤ/FITC 和10 μL PI(20 mg/L)，混匀后于室温避光孵育15 min，流式细胞仪分析细胞凋亡情况。

1.4.5 Western blot 实验分别采用A、B、C、D、E组材料浸提液培养U2OS细胞，以含体积分数体积分数10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养组作为空白对照组，共培养24 h后，生理盐水洗涤2次，加入蛋白裂解液将细胞裂解，采用12.5%SDS-PAGE进行分离，通过电转方法将蛋白质转到PVDF 膜上。分别将膜放入p53、Bax、Bcl-2的Ⅰ抗稀释液(1∶1 000)中孵育过夜，之后再用Ⅱ抗稀释液(1∶5 000)孵育2 h后在X胶片上进行曝光，用Image J 软件分析蛋白灰度值。

1.5 主要观察指标 ①各组材料表面耐腐蚀性能比较；②各组材料浸提液对U2OS细胞增殖的影响；③各组材料浸提液对U2OS细胞凋亡及凋亡相关蛋白的影响。

1.6 统计学分析采用SPSS 13.0统计软件对上述参数进行统计学处理，数据以x(_)±s表示，方差分析及bonferroni两两均数比较。P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

骨肉瘤恶性程度高，预后差，即使采用手术联合化疗治疗方案，治疗效果仍不佳。研究表明，锌与肿瘤细胞的增殖、凋亡等密切相关，能够选择性抑制A549、Caco-2、HeLa、HepG2、HT29 等肿瘤细胞的生长^[21]。因此，作者将锌添加入纯镁中制备出不同锌含量镁锌合金Mg-xZn，通过实验证明其抗肿瘤效果，并对其机制进行初步探究。

合金化能够减缓植入部位的镁合金降解率，提高其机械性能释，氢实验结果证实了添加锌后，镁合金耐腐蚀性能得到了很大提高，整个过程中降解比较稳定^[6-7]。MTT实验结果表明，该系列含锌镁合金Mg-xZn浸提液能够明显抑制U2OS细胞的增殖，并且与锌含量呈正相关，但对正常MC3T3-E1细胞的毒性处于理想范围之内。同时还观察到，纯镁浸提液组对U2OS细胞增殖也显示出一定的抑制效果，这说明锌不是导致U2OS细胞增殖抑制的惟一原因。有文献表明，碱性环境能抑制肿瘤细胞生长，金属镁及镁合金降解时，溶液中的主要产物是Mg(OH)₂，但溶液中的Cl^-使Mg(OH)₂转换为MgCl₂，使溶液中的OH^-增多，导致溶液中的pH迅速上升^[22]。因此，可推测纯镁浸提液组能够抑制U2OS增殖可能与其快速降解，导致浸提液pH上升，改变了肿瘤生长的酸性环境有关。此外，李文辉等^[23]研究表明含锌镁合金Mg-xZn(x=2%、4%、6%)在模拟体液中浸泡3 d的腐蚀速率约为Mg的1/2，这可以很好地解释为什么纯镁浸提液组能够显示出与含锌2%镁合金浸提液组相当的肿瘤抑制效果。总结可推测出，酸性环境的改变及锌离子的存在，共同抑制了U2OS细胞增殖。综合文献及此次实验结果可得出，尽管pH的上升是抑制U2OS细胞增殖的一个因素，但锌离子在整个抑制U2OS细胞增殖过程起到了关键作用。

细胞凋亡是调控细胞自杀的过程，与机体发育、多细胞有机体的组织内环境稳定，以及各种生理病理学环境有密切的联系^[24]。肿瘤细胞具有能够避免凋亡同时促进增殖的特性^[25]。因此，进一步采用流式细胞术和蛋白质印迹法来观察该系列镁锌合金对U2OS细胞凋亡影响及检测相关凋亡蛋白的表达情况。此次研究发现含锌镁合金浸提液能够诱导U2OS细胞凋亡，凋亡细胞数目随着锌含量的增加而增加，这与前述U2OS细胞MTT结果相一致。可以推测，该系类镁锌合金浸提液是通过诱导U2OS细胞凋亡达到增殖抑制效果。近年来，大量研究表明锌离子能够选择性诱导许多哺乳动物癌细胞线粒体中活性氧蓄积，导致多种肿瘤细胞发生线粒体通路凋亡^[26-29]。同时有文献表明，高pH也能通过抑制超氧化物岐化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶活力等体内还原剂，减弱细胞捕获自由基的能力，导致过量的活性氧在细胞内蓄积，继而诱导细胞凋亡。浸提液高pH无法选择性地诱导肿瘤细胞凋亡，可能是导致该系列镁合金浸提液对正常MC3T3-E1也显示出微弱增殖抑制作用的原因。众所周知，线粒体介导的凋亡通路主要是通过改变p53、Bcl-2家族蛋白实现的。p53在肿瘤的发生发展中起着广泛的作用，正常情况下处于低水平，当DNA受到损坏时其水平会迅速上升，Bcl-2家族在线粒体凋亡通路中起着至关重要的作用，Bcl-2家族主要是由抗凋亡Bcl-2蛋白和促凋亡Bax蛋白组成，二者之间的平衡决定了肿瘤是否发生。此次实验中观察到含锌镁合金浸提液可显著上调U2OS细胞Bax蛋白，下调Bcl-2蛋白水平，导致Bcl-2/Bax比例的失衡，促进线粒体凋亡通路的发生。令人疑惑的是，尽管MTT和凋亡结果揭示含锌6%镁合金浸提液组显示出更佳的抗肿瘤效果，蛋白质印迹实验结果却显示出Bax表达量低于含锌4%镁合金浸提液组，Bcl-2的表达量高于含锌4%镁合金浸提液组。据有关文献表明，当抗癌药物溶度过高时会严重破坏肿瘤细胞内部结构，导致蛋白质合成受到影响。此次实验中上述现象，可能与含锌6%镁合金浸提液中高浓度的锌离子，导致U2OS细胞结构严重受损，导致上述3种蛋白的表达量下降有关。

综上所述，此次研究表明，该系列含锌镁合金Mg-xZn是一种具有选择性的有潜力的具有抗肿瘤性能的骨科植入材料，其中含锌6%镁合金显示出最佳抗肿瘤性能，其主要是通过诱导活性氧的产生积累引起线粒体功能紊乱，诱导肿瘤细胞凋亡，进而发挥抗肿瘤作用。然而，含锌镁合金Mg-xZn具体是如何引起线粒体中活性氧积累，尚需其他的实验手段来加以验证。此外，还需建立肿瘤模型，通过体内试验来进一步验证该种新型植入材料的抗肿瘤效果。

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