人脐带间充质干细胞联合玻璃酸钠注射液治疗膝骨关节炎

doi:10.12307/2021.136

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

人脐带间充质干细胞：来源于脐带组织的间充质干细胞，具有自我更新、多向分化、抗炎、免疫调节等特点。
膝骨关节炎：累及膝关节的骨关节炎，是一种进行性关节退行性疾病，以透明关节软骨的渐进退化和骨质硬化为病理特征。
背景：膝骨关节炎严重影响患者的正常生活，目前仍无最佳治疗方案。
目的：评价人脐带间充质干细胞联合玻璃酸钠注射液治疗膝骨关节炎的有效性和安全性。
方法：①细胞学实验观察人脐带间充质干细胞对淋巴细胞增殖和调节性T细胞比例的影响；②油红O染色、阿尔新蓝染色观察预混玻璃酸钠对人脐带间充质干细胞成脂和成软骨的影响；③对新西兰白兔行右膝前交叉韧带切断术和内侧半月板切除术造模，术后第6，9和12周关节内分别注射人脐带间充质干细胞、玻璃酸钠注射液、人脐带间充质干细胞联合玻璃酸钠注射液，术后第16周处死全部新西兰白兔，取心、肝、脾、肺、肾、脑、关节腔周围肌肉和膝关节，用qPCR方法检测人特异基因FOXP2表达；取股骨髁用于形态学、组织学和免疫组化分析。
结果与结论：①人脐带间充质干细胞抑制T淋巴细胞增殖和上调调节性T细胞比例；②预混玻璃酸钠的人脐带间充质干细胞依然保持成脂和成软骨的能力；③术后第16周，新西兰白兔心、肝、脾、肺、肾、脑、关节腔周围肌肉和膝关节中人特异基因FOXP2全部为阴性；④人脐带间充质干细胞联合玻璃酸钠组大体观察关节面较平整光滑，ICRS评分较玻璃酸钠组显著升高；苏木精-伊红染色显示软骨厚度增加，Pineda评分明显低于玻璃酸钠组和人脐带间充质干细胞组；软骨全层含较多蛋白聚糖，OARSI评分明显低于玻璃酸钠组和人脐带间充质干细胞组；免疫组化显示关节软骨Ⅱ型胶原表达增加，基质金属蛋白酶13表达减少；⑤结果显示，人脐带间充质干细胞联合玻璃酸钠注射液在关节软骨修复方面优于单纯玻璃酸钠注射液或单纯人脐带间充质干细胞，且无明显不良反应。
https://orcid.org/0000-0001-6630-2368(崔晓燕)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 脐带间充质干细胞, 玻璃酸钠, 骨关节炎, 膝, 软骨, 兔

Abstract: BACKGROUND: Knee osteoarthritis seriously affects the living quality of patients and there is still no optimal treatment.
OBJECTIVE: To evaluate the efficacy and safety of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells combined with hyaluronic acid on the treatment of knee osteoarthritis.
METHODS: (1) Cytological experiments were carried out to observe the effect of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells on lymphocyte proliferation and proportion of regulatory T cells. (2) The effects of premixed sodium hyaluronate on adipogenesis and chondrogenesis of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were observed by oil red O staining and alcian blue staining. (3) Rabbit osteoarthritis was induced surgically by anterior cruciate ligament transection and medial meniscectomy of right knee joints. The intra-articular injection was given at 6, 9 and 12 weeks after surgery of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, sodium hyaluronate injection, umbilical cord-derived mesenchymal stem cells combined with sodium hyaluronate injection. All rabbits were sacrificed at 16 weeks after surgery. The specific FOXP2 gene was measured in the heart, liver, spleen, lung, kidney, brain, muscles around the joint cavity, and knee joint with qPCR method. The morphological, histological and immunohistochemical analyses were carried out to detect the cartilage repair of femoral condyles.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells suppressed T lymphocyte proliferation and upregulated proportion of regulatory T cells. (2) Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells premixed with sodium hyaluronate still retained the property of adipogenesis and chondrogenesis. (3) At 16 weeks after treatment, the human specific gene FOXP2 was all negative in the heart, liver, spleen, lung, kidney, brain and muscles around the joint cavity of rabbits. (4) The articular surface of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells + sodium hyaluronate group was flat and smooth, and the ICRS score was significantly higher than that of the sodium hyaluronate group. Hematoxylin-eosin staining results showed that cartilage thickness was increased and the Pineda score of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells + sodium hyaluronate group was significantly lower than that of the sodium hyaluronate group and the human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells group. The whole cartilage layer of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells + sodium hyaluronate group contained more proteoglycans. The OARSI score of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells + sodium hyaluronate group was significantly lower than that of the sodium hyaluronate group and the human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells group. Immunohistochemical analysis showed that the expression of type II collagen in articular cartilage was increased and the expression of matrix metalloproteinase-13 was decreased. (5) The results indicate that human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells combined with sodium hyaluronate treatment were superior to either sodium hyaluronate treatment alone or human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells treatment alone in articular cartilage repair and there was no significant adverse reaction.

Key words: stem cells, umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, sodium hyaluronate, osteoarthritis, knee, cartilage, rabbit

中图分类号:

崔晓燕. 人脐带间充质干细胞联合玻璃酸钠注射液治疗膝骨关节炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(31): 4956-4963.

Cui Xiaoyan. Treatment of knee osteoarthritis with human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells combined with sodium hyaluronate injection[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(31): 4956-4963.

图/表（结果） 15

2.1 人脐带来源间充质干细胞表型人脐带间充质干细胞形态为梭形，流式细胞仪检测第3代人脐带间充质干细胞特异性表面抗原CD44、CD90、CD73和CD105的阳性率分别为99.9%，100.0%，99.5%，96.8%，而CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR的表达为阴性，见图1。

2.2.1 抑制T淋巴细胞增殖脐带间充质干细胞能抑制CD4+/CD8+T细胞增殖，植物血凝素刺激后CD4+T细胞的增殖率为43.8%，加入脐带间充质干细胞后CD4+T细胞的增殖率为2.2%；植物血凝素刺激后CD8+T细胞的增殖率为44.3%，加入脐带间充质干细胞后CD8+T细胞的增殖率为12.3%，见图2。

2.2.2 上调调节性T细胞比例阳性对照组CD4+T细胞单独培养3 d后，流式细胞仪检测调节性T细胞比例为66.1%；CD4+T细胞与人脐带间充质干细胞共培养3 d后，流式细胞仪检测调节性T细胞比例为87.5%，见图3。

2.3 玻璃酸钠对人脐带间充质干细胞成脂和成软骨分化的影响玻璃酸钠与人脐带间充质干细胞预混组成脂诱导后细胞内明显有红色脂滴形成，见图4。

玻璃酸钠与人脐带间充质干细胞预混组成软骨诱导后细胞聚集形成球状，阿尔新蓝着色，见图5。

2.4 膝骨关节炎造模和治疗后实验兔大体观察结果造模5周后，1只兔子死亡，其余兔子均未出现不良状况。与造模的前4周比较，造模5周后实验兔较活跃，右腿变细，出现肌肉萎缩现象，右膝关节膨大。正常对照组和假手术组无症状。造模6周后随机选1只新西兰白兔取材观察模型构建情况，造模右膝关节红肿，左膝关节正常，见图6。

治疗后实验兔经观察均未出现不良反应，人脐带间充质干细胞+玻璃酸钠组改善比较明显，玻璃酸钠组和人脐带间充质干细胞也有两三只兔子较活跃。各治疗组与正常组和假手术组间体质量差异无显著性意义，见图7。

2.5 移植细胞的组织分布细胞注射10周后，人特异基因FOXP2在心、肝、脾、肺、肾、脑、关节腔周围肌肉和膝关节中全部为阴性，见表2。

2.6 各组股骨髁大体观察结果术后16周，正常组和假手术组关节面光滑正常，玻璃酸钠组关节面不平整，见图8A。人脐带间充质干细胞+玻璃酸钠组与玻璃酸钠组相比，ICRS评分有显著升高，见图8B。

2.7 苏木精-伊红染色形态学观察结果苏木精-伊红染色评估由四川大学华西医院骨科完成。人脐带间充质干细胞+玻璃酸钠组的软骨厚度显著增加，见图9。

人脐带间充质干细胞+玻璃酸钠组Pineda评分明显低于玻璃酸钠组和人脐带间充质干细胞组，人脐带间充质干细胞+玻璃酸钠组评分明显高于正常组，见图10。

2.8 番红O/固绿染色形态学观察结果番红O/固绿染色评估由四川大学华西医院骨科完成。玻璃酸钠组软骨表面不连续，基质染色不均匀，染色较浅，深层存在部分胶原纤维染色。人脐带间充质干细胞组部分关节软骨表面不连续，基质染色不均匀，染色较浅，深层局部存在胶原纤维染色。人脐带间充质干细胞+玻璃酸钠组局部关节软骨表面不连续，基质染色较浅，有软骨细胞簇集或群集增生，软骨全层含较多蛋白聚糖，放射层及钙化层局部存在胶原纤维染色，见图11。

OARSI评分统计学分析，人脐带间充质干细胞+玻璃酸钠组与正常组(P=0.024 8)、玻璃酸钠组(P=0.015 1)和人脐带间充质干细胞组(P=0.030 6)相比，差异均有显著性意义，见图12。

2.9 免疫组化观察结果免疫组化评价由四川大学华西医院骨科完成。人脐带间充质干细胞组和人脐带间充质干细胞+玻璃酸钠组关节软骨Ⅱ型胶原表达增加，见图13。

人脐带间充质干细胞+玻璃酸钠组关节软骨基质金属蛋白酶13的分泌减少，见图14。

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引言

骨关节炎是成人最常见的关节炎，可造成关节疼痛、功能丧失和残疾。骨关节炎是一种进行性关节退行性疾病，其病理特征为关节软骨破坏、软骨下骨骨质硬化、滑膜炎症、韧带退化、半月板变性和关节囊肥大[1]。骨关节炎最常累及的是膝关节，膝骨关节炎导致下肢功能障碍，严重影响患者的正常生活。据中国流行病学调查显示，目前症状性膝骨关节炎的患病率为8.1%[2]，膝骨关节炎在60岁以上人群中发病率为50%[3]。膝骨关节炎的治疗方法主要有非药物治疗(减重、运动疗法、关节活动训练、物理治疗、矫形辅具等)、药物治疗(非类固醇抗炎药、氨基葡萄糖)、注射治疗(皮质类固醇激素、医用几丁糖、富血小板血浆[4]、透明质酸等)和膝关节置换手术等[5]。这些治疗方法大多数疗效有限，仅能缓解疼痛症状，不能阻止软骨损伤和关节其他组织破环[6-7]，且受不良事件的限制[8]，目前膝骨关节炎仍无最佳治疗方案。
自体软骨移植较早应用于软骨缺损再生，然而自体软骨移植与经典治疗方法相比，临床试验显示并无显著性差异[9-10]，其原因可能是骨关节炎软骨缺损往往太大[11]。间充质干细胞具有关节软骨再生潜力[12-13]，为膝骨关节炎患者提供了有希望的潜在治疗方法。间充质干细胞为中胚层起源的干细胞，能分化为结缔组织，包括骨、软骨、肌腱、韧带和脂肪等，且具有抗炎和免疫调节作用[14]。间充质干细胞无伦理学限制、免疫原性低和来源丰富，其组织来源多样化[15]，最常见的来源为骨髓，但是不足之处是骨髓采集需要侵入性操作[16]。以往研究表明骨髓和脂肪来源间充质干细胞能促进软骨修复和减轻膝骨关节炎患者疼痛并改善关节功能[17-22]。与骨髓和脂肪来源间充质干细胞相比，人脐带来源间充质干细胞具有获取容易、无需侵入性手术、高收获率和高增殖活性等优点[23]。目前使用人脐带来源间充质干细胞治疗膝骨关节炎的临床前研究较少，且多数研究为单纯人脐带来源间充质干细胞治疗研究[15，24-26]。玻璃酸钠关节内注射虽已应用于膝骨关节炎治疗，但其对软骨保护和延迟膝骨关节炎进展的作用仍然存在争议[27]。
该研究采用右膝前交叉韧带切断术和内侧半月板切除术诱导新西兰白兔骨关节炎模型，造模后采用人脐带来源间充质干细胞和/或玻璃酸钠注射液的治疗方法，观察各组兔体质量变化、移植细胞组织学分布、关节软骨组织学评分、Ⅱ型胶原和基质金属蛋白酶13表达，探讨人脐带来源间充质干细胞联合玻璃酸钠注射液治疗方法的安全性及其对关节软骨修复的有效性。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学实验和动物实验。
1.2 时间及地点细胞学实验于2018年8月至2019年5月在上海葆年生物科技有限公司完成；动物实验于2018年7月至2019年6月在基尔顿生物科技(上海)有限公司完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物成年雄性新西兰白兔45只，体质量(2.5±0.5) kg，来源于上海甲干生物科技有限公司。
1.3.2 实验试剂与仪器 PE Anti-Human CD44、CD90、CD73、CD105、CD14、CD19、CD34、CD45和PerCP Anti-Human HLA-DR(BD，美国)；FAR-RED染液(Invitrogen，美国)；植物血凝素刺激物(Sigma，美国)；CD4-FITC/CD8-PE流式抗体(BD，美国)；白细胞介素1β和白细胞介素2 (近岸蛋白，上海)；CD3单克隆抗体和CD28单克隆抗体(ebioscience，美国)；CD4+T细胞分离试剂盒(Stem cell，加拿大)；转化生长因子β (R&D，美国)；小鼠抗人CD4-FITC、CD25-APC、FoxP3-PE抗体，小鼠IgG1-FITC isotype control、小鼠IgG1κ-APC isotype control和小鼠IgG1κ-PE isotype control抗体(BD，美国)；玻璃酸钠注射液(阿尔治，生化学工业株式会社，日本)；柱式动物基因组DNA抽提试剂盒(生工生物工程，上海)；SG Fast qPCR Master Mix(2X)(生工生物工程，上海)；石蜡、甲醛、二甲苯、无水乙醇、体积分数为30%过氧化氢(上海国药集团)；广谱二抗(上海长岛生物技术有限公司)；辣根过氧化物酶标记山羊抗大鼠IgG(H+L) (碧云天生物技术有限公司，上海)；DAB浓缩型试剂盒(上海长岛生物技术有限公司)；苏木精、伊红(珠海贝索生物技术有限公司)；中性树脂、番红O-固绿软骨染色液(索莱宝，北京)；小鼠抗兔Ⅱ型胶原抗体(Abcam，美国)；小鼠抗兔基质金属蛋白酶13抗体(Abcam，美国)；小鼠抗人线粒体抗体(Millipore，美国)；恒温烘箱(上海恒一科学仪器有限公司)；摊片机、石蜡切片机(徕卡，德国)；脐带间充质干细胞成脂、成软骨诱导分化培养基(Cyagen，苏州)；血清替代物(Helios，美国)；α-MEM(Gibco，美国)；二氧化碳培养箱(Thermo，美国)；台式离心机(Eppendorf，德国)；生物安全柜(Thermo Fisher，美国)；倒置显微镜(Olympus，日本)；流式细胞仪(BD，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 人脐带间充质干细胞及表型鉴定实验所用脐带标本来源于产妇捐献，捐献者已签署知情同意书。采用组织贴块法培养人脐带间充质干细胞[28]，完全培养基为含5%血清替代物的α-MEM培养基。

采用流式细胞仪检测细胞表型，使用流式抗体PE Anti-Human CD44、CD90、CD73、CD105、CD19、CD34、CD45，FITC Anti-Human CD14和PerCP Anti-Human HLA-DR。

1.4.2 人脐带间充质干细胞的免疫调节作用

对T淋巴细胞增殖的影响：复苏并计数脐血单个核细胞[脐血标本来源于产妇捐献，已签署知情同意书，采用Ficoll Pague PLUS(GE Healthcare Life Sciences #17-1440-02)分离脐血单个核细胞]，加入FAR-RED染液染色。取第5代人脐带间充质干细胞接种于24孔板，接种密度为2×105/孔，加入1 mL完全培养基，标记为实验组，放入37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱培养4 h，去掉实验组间充质干细胞培养上清液，每孔加入1×106脐血单个核细胞，阴性对照组和阳性对照组24孔板未接种间充质干细胞，每孔加入1×106脐血单个核细胞y阳性对照组和实验组每孔加入6 μL植物血凝素刺激物，混匀。4 d后收集3组细胞，加入CD4-FITC/CD8-PE流式抗体5 μL ，使用流式细胞仪进行样本数据收集和分析。
对调节性T细胞的影响：取第5代人脐带间充质干细胞，加入白细胞介素1β(终质量浓度10 μg/L)孵育1 d。CD4+ T细胞分选前1 d，用1 mg/L CD3单克隆抗体包被24孔板，4 ℃过夜备用。采用CD4+T细胞分离试剂盒从脐血单个核细胞中分选CD4+T细胞，向CD3单克隆抗体包被的24孔板中分别加入1×106 CD4+T细胞、1.0 g/L CD28单克隆抗体(终质量浓度3 mg/L)、100 mg/L白细胞介素2(终质量浓度100 μg/L)、5 mg/L转化生长因子β(终质量浓度5 μg/L)培养2 d。白细胞介素1β激活的人脐带间充质干细胞与培养2 d的CD4+T细胞按1∶10比例共培养(每孔1×105人脐带间充质干细胞)，设空白对照组、阳性对照组、样本实验组和同型对照组，其中空白对照组和阳性对照组不加人脐带间充质干细胞，3 d后收集CD4+T细胞，向阳性对照组和样本实验组的CD4+T细胞中加入抗体：小鼠抗人CD4-FITC、CD25-APC；向同型对照组的CD4+T细胞中加入抗体：小鼠IgG1-FITC isotype control、小鼠IgG1κ -APC isotype control。破膜后，向阳性对照组和样本实验组的CD4+T细胞中加入小鼠抗人FoxP3-PE抗体，向同型对照组的CD4+T细胞中加入小鼠IgG1κ-PE isotype control抗体。使用流式细胞仪进行样本数据收集和分析。
1.4.3 玻璃酸钠对人脐带间充质干细胞成脂分化的影响第5代人脐带间充质干细胞(2×107)与玻璃酸钠混合(2.5 mL)，放置72 h后，从玻璃酸钠中分离出人脐带间充质干细胞，进行成脂和成软骨诱导实验，未处理人脐带间充质干细胞作为对照组。人脐带间充质干细胞按照1×104/cm2的细胞密度接种在6孔板中，每孔加入3 mL完全培养基，将细胞置于37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱中进行培养。脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基按照说明书进行配制。细胞培养1-3 d，细胞融合度达到80%左右，小心吸出间充质干细胞完全培养基，加入3 mL人脐带间充质干细胞成脂分化完全培养基，每隔三四天换液1次，持续诱导28 d。成脂诱导分化结束后，吸出人脐带间充质干细胞成脂分化培养基，1×PBS冲洗一两次，每孔加入2 mL体积分数为4%中性甲醛溶液，固定30 min，吸出中性甲醛溶液，1×PBS冲洗2次，每孔加入1 mL油红O染料工作液染色20 min(工作液配制方法：油红O贮存液∶蒸馏水=1∶1，混匀后用中性滤纸过滤)，吸出油红O染液， 1×PBS冲洗两三次，将培养板置于显微镜下观察成脂染色效果。
1.4.4 玻璃酸钠对人脐带间充质干细胞成软骨分化的影响按人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化培养基试剂盒说明书进行试剂预混和诱导培养基配制。第5代人脐带间充质干细胞(8.0×105)转移到15 mL离心管中，室温下150×g离心5 min，弃上清，清洗沉淀，室温下150×g离心5 min，吸弃上清，再次按照7.5×108 L-1的细胞浓度重悬细胞，室温下150×g离心5 min，吸弃上清，细胞沉淀用成软骨诱导分化完全培养基按照5.0×108 L-1的密度进行重悬，吸取0.5 mL细胞悬液转移到15 mL离心管中，室温下150×g离心5 min，拧松离心管盖以便于气体交换，将其放置于37 ℃，体积分数为5% CO2培养箱中培养，24 h之内不要摇动离心管，当细胞团出现聚拢现象时，轻弹离心管底部使软骨球脱离管底悬浮在液体中，每隔两三天换液1次，换液之后轻弹离心管底部使软骨球脱离管底悬浮在液体中，稍加拧松离心管盖放入37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱中继续诱导培养，持续诱导28 d后，送第三方检测公司(艾迪康)对软骨球进行甲醛溶液固定和石蜡包埋切片，最后进行阿尔新蓝染色。
1.4.5 动物实验
分组：将成年雄性新西兰白兔随机分为正常对照组(n=5)，假手术组(n=10)，玻璃酸钠组(n=10)，人脐带间充质干细胞组(n=10)，人脐带间充质干细胞+玻璃酸钠组(n=10)。

造模：在全麻和无菌的条件下，行右膝前交叉韧带切断术和内侧半月板切除术[20]。

治疗：术后第6，9和12周给予治疗，治疗方式为关节内注射。正常对照组：不做任何处理；假手术组：注射0.15 mL生理盐水；玻璃酸钠组：注射0.15 mL生理盐水+ 0.15 mL玻璃酸钠；人脐带间充质干细胞组：注射0.15 mL人脐带间充质干细胞(2.5×106)；人脐带间充质干细胞+玻璃酸钠组：注射0.15 mL人脐带间充质干细胞(2.5×106)+0.15 mL玻璃酸钠。
1.4.6 移植细胞的组织分布术后第16周，取新西兰兔的心、肝、脾、肺、肾、脑、关节腔周围肌肉和膝关节，每组取3只动物，用qPCR方法检测人特异基因FOXP2。按照柱式动物基因组DNA抽提试剂盒提取新西兰白兔组织DNA，提取人脐带间充质干细胞DNA，将人DNA稀释至33 mg/L，体积200 μL；新西兰白兔正常组DNA稀释至33 mg/L，体积500 μL。
按照表1配制标准品各梯度。采用SG Fast qPCR Master Mix(2X)进行qPCR反应。

1.4.7 组织病理学检测术后第16周处死全部新西兰白兔，取股骨髁用于大体观察、组织学和免疫组化分析。

大体观察：采用ICRS评分[29]评价软骨修复情况，总分12分，得分越高说明软骨修复效果越好，越低说明软骨修复效果越差。
组织学分析：股骨髁用40 g/L多聚甲醛固定，含EDTA的盐溶液脱钙，标本被切成4份，标本石蜡包埋，切片厚6 μm，苏木精-伊红染色采用Pineda评分评估一般形态，番红O/固绿染色采用OARSI评分评估蛋白聚糖/胶原含量[30]。OARSI总分6分，得分越高关节软骨缺损越严重，得分越低关节软骨越完整。
免疫组化：所有的切片经脱蜡、水化，在37 ℃下胃蛋白酶消化20 min，过氧化氢溶液封闭15 min，Ultra V封闭液封闭5 min，分别加入一抗：小鼠抗兔Ⅱ型胶原抗体(1∶200)，小鼠抗兔基质金属蛋白酶13抗体(1∶200)，4 ℃孵育过夜，滴加HRP标记广谱二抗，湿盒孵育，DAB染色，观察到切片有颜色改变时，立即用自来水洗去染色液，苏木精复染3 min，然后显微镜下观察。
1.5 主要观察指标 ①股骨髁软骨修复情况；②Ⅱ型胶原和基质金属蛋白酶13蛋白表达水平；③玻璃酸钠对人脐带间充质干细胞成脂和成软骨分化的影响。
1.6 统计学分析采用GraphPad 7.0对软骨损伤修复的ICRS评分、OARSI评分、Pineda评分进行数据分析，计量资料数据以x±s表示，采用单因素方差分析检验，评估组间差异。P < 0.05和P < 0.01为差异有显著性意义。

讨论

膝骨关节炎的发病机制目前尚未完全明确，主要认为是在年龄、肥胖、创伤、炎症等机械性和生物性因素共同作用下，导致软骨细胞、细胞外基质、软骨下骨的分解和合成代谢失衡，造成软骨细胞凋亡，并引起滑膜周围的免疫炎症反应[31]。膝骨关节炎实验动物模型分为诱发模型和自发模型2种，诱发模型方法包括关节机械制动、破坏关节局部血液循环、手术改变关节应力、药物关节腔内注射等，可建立膝骨关节炎动物诱发模型；自发模型指的是一些动物随着增龄而出现软骨退变[32]，常用膝骨关节炎造模为Hulth手术方法：切断前后交叉韧带、切断内侧副韧带、切除内侧半月板，造成关节应力改变，但该方法膝关节极不稳定[32]。有研究采用Ⅱ型胶原酶关节腔注射的方式诱导大鼠骨关节炎模型[15]，但该方法与膝骨关节炎的发病机制不相吻合。MURPHY等[33]采用单侧膝关节前交叉韧带横断术和内侧半月板切除术6周诱导山羊骨关节炎模型；WANG等[20]同样采用前交叉韧带横断术和内侧半月板切除术6周诱导兔骨关节炎模型。该研究采用右膝前交叉韧带切断术和内侧半月板切除术诱导新西兰白兔骨关节炎模型，在造模6周后取材观察显示右膝关节红肿；术后第16周造模关节面不平整，软骨变薄。
间充质干细胞具有炎症免疫调节、组织损伤修复和多向分化能力等特性，为各种炎症反应、自身免疫病等疾病提供了潜在的治疗应用前景[34]。SAULNIER等[24]采用马脐带华通胶间充质干细胞治疗兔膝骨关节炎，滑膜均可见细胞浸润，早期细胞处理组的滑膜在第56天可见基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13表达降低。体外实验显示脐带华通胶间充质干细胞条件培养基对促炎预处理的滑膜细胞有抗炎和抗分解代谢作用。WU等[35]采用脐带间充质干细胞和4%玻璃酸钠治疗小型猪骨关节炎，大体和组织学观察透明软骨再生有显著改善。MATAS等[36]采用人脐带间充质干细胞单次或多次关节腔内注射治疗膝骨关节炎患者，无严重不良事件，患者疼痛和功能明显改善，特别是多次注射治疗组优于对照组。这些研究表明人脐带间充质干细胞对膝骨关节炎治疗具有一定效果。该研究中人脐带间充质干细胞的特异性表面抗原和分化潜能均符合国际细胞治疗协会(International Society for Cellular Therapy，ISCT)制定的间充质干细胞标准；人脐带间充质干细胞具有抑制T淋巴细胞增殖和上调调节性T细胞比例的作用。有研究表明T细胞能诱导骨关节炎滑膜中基质金属蛋白酶的释放，从而破坏软骨[37]；调节性T细胞具有抗炎和维持自身免疫耐受特性[38]。抑制T淋巴细胞增殖和上调调节性T细胞比例，对膝骨关节炎的治疗具有潜在作用。
玻璃酸钠是一种天然的非硫酸糖胺聚糖，可为关节液提供黏弹性[39]，关节内注射玻璃酸钠可提高关节内玻璃酸钠浓度和抑制平均分子质量分布的下降[39-41]。玻璃酸钠的治疗机制包括软骨保护、缓解疼痛、蛋白聚糖合成、软骨基质改善、减震、关节润滑、抗炎作用等[42]。玻璃酸钠(及其衍生物)因其具有生物相容性、生物降解性和凝胶形成特性而被用作组织工程中的水凝胶[43]。文献研究中联合间充质干细胞促进软骨修复的分子和材料包括：转化生长因子β3、去端肽胶原、三维培养系统(纳米纤维支架、胶原水凝胶、聚己内酯/胶原纳米支架等)[44-48]。
该研究观察了预混玻璃酸钠的人脐带间充质干细胞依然具有向脂肪和软骨分化的能力。通过动物实验观察人脐带间充质干细胞联合玻璃酸钠修复关节软骨的能力，术后第6，9和12周给予人脐带间充质干细胞或/和玻璃酸钠治疗，结果发现：与单纯玻璃酸钠治疗或单纯人脐带间充质干细胞治疗相比，人脐带间充质干细胞联合玻璃酸钠组关节面较平整光滑，ICRS评分显著升高，苏木精-伊红染色Pineda评分明显降低，软骨厚度增加，软骨全层含较多蛋白聚糖，关节软骨Ⅱ型胶原表达增加，基质金属蛋白酶13的分泌减少。关节软骨主要由Ⅱ型胶原和蛋白聚糖组成[49]；基质金属蛋白酶13是软骨破坏的关键调节因子，它在骨关节炎患者中表达增加，基质金属蛋白酶13基因表达与关节软骨损伤和退变具有相关性[26]。新西兰白兔关节腔注射人脐带间充质干细胞10周后，心、肝、脾、肺、肾、脑、关节腔周围肌肉中人特异基因FOXP2全部为阴性，表明心、肝、脾、肺、肾、脑、关节腔周围肌肉没有移植细胞分布；治疗组与正常组和假手术组间体质量差异无显著性意义，表明人脐带间充质干细胞移植无明显不良作用。
该研究的不足之处：首先，膝骨关节炎的病理特征不仅包括关节软骨退化，还包括滑膜、软骨下骨和关节囊的改变，该研究未观察滑膜、软骨下骨和关节囊的改变；其次，人脐带间充质干细胞参与损伤组织修复的方式主要有分化为损伤细胞[50]、旁分泌效应(包括间充质干细胞源性外泌体)等 [51-52]，该研究未进行软骨修复机制研究。后续研究中将增加MRI影像[53]、炎症因子等检测和详细的细胞示踪。
总之，该研究显示人脐带间充质干细胞联合玻璃酸钠注射液治疗在关节软骨组织学修复方面优于单纯玻璃酸钠注射液治疗或单纯人脐带间充质干细胞治疗，在后续研究中将进一步完善相关指标检测及其机制研究，为人脐带间充质干细胞应用于膝骨关节炎临床研究提供基础支持。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程