抑癌基因WWOX促进卵巢癌干细胞的凋亡及机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.29.012

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (29): 4660-4665.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.29.012

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抑癌基因WWOX促进卵巢癌干细胞的凋亡及机制

王祎祎¹，张向宁²，董浩³，高蕾¹，崔晓榕¹，王春燕¹，马瑞琳¹

¹山东大学临床医学院，山东省济南市 250012；²山东大学齐鲁医院妇产科，山东省济南市 250012；³滨州医学院消化内科，山东省滨州市 256603

修回日期:2017-04-30 出版日期:2017-10-18 发布日期:2017-11-08
通讯作者: 张向宁，博士，主任医师，山东大学齐鲁医院妇产科，山东省济南市 250012
作者简介:王祎祎，女，1991年生，山东省威海市人，在读硕士，主要从事妇科肿瘤与微创研究。

Pro-apoptotic effect of a tumor suppressor gene WWOX on ovarian cancer stem cells and its mechanism

Wang Yi-yi¹, Zhang Xiang-ning², Dong Hao³, Gao Lei¹, Cui Xiao-rong¹, Wang Chun-yan¹, Ma Rui-lin¹

¹Shandong University Clinical Medical School, Jinan 250012, Shandong Province, China; ²Department of Gynecology and Obstetrics, Qilu Hospital, Shandong University, Jinan 250012, Shandong Province, China; ³Department of Digestion, Binzhou Medical University, Binzhou 256603, Shandong Province, China

Revised:2017-04-30 Online:2017-10-18 Published:2017-11-08
Contact: Zhang Xiang-ning, M.D., Chief physician, Department of Gynecology and Obstetrics, Qilu Hospital, Shandong University, Jinan 250012, Shandong Province, China
About author:Wang Yi-yi, Studying for master’s degree, Shandong University Clinical Medical School, Jinan 250012, Shandong Province, China

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
Hedgehog信号通路：Hedgehog信号通路参与机体内细胞的多种生物学功能的发挥过程，由分泌型糖蛋白受体(Hedgehog)、跨膜蛋白受体(Ptch)、跨膜蛋白(SMO)和核转录因子(Gli)组成，与肿瘤的发生有关，在多种肿瘤组织中异常激活，参与肿瘤细胞的增殖和凋亡。
抑癌基因WWOX：WW结构域氧化还原酶基因WWOX，是近年发现的新的抑癌基因，定位于人的普通染色体脆性位点FRA16D(16q23.3-24.1)，在多种肿瘤中表达下调或缺失，与WWOX作用相关的蛋白均处于信号转导途径的关键点，对WWOX基因的深入研究，将可能为肿瘤治疗提供新的思路和理论依据。

摘要
背景：研究表明，WWOX能够影响卵巢癌干细胞的生长，其作用机制是否与Hedgehog信号通路有关则未见相关报道。
目的：研究过表达WWOX对卵巢癌干细胞凋亡的作用及机制。
方法：转染WWOX过表达载体pcDNA3.1-WWOX(pcDNA3.1-WWOX组)和pcDNA4.0-WWOX (pcDNA4.0-WWOX组)至卵巢癌干细胞中，同时转染空载体pcDNA3.1(pcDNA3.1组)和pcDNA4.0(pcDNA4.0组)，设置未转染组(只加入转染试剂Lipofectamine2000)。培养48 h后，Western blot检测细胞中WWOX水平，MTT检测细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞凋亡情况，Western blot检测细胞中Hedgehog信号通路相关蛋白SHH、PTCH1、Gli-1、SMO和凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3的表达水平。用Hedgehog信号通路抑制剂环巴胺作用于未转染的卵巢癌干细胞(环巴胺组)和转染WWOX过表达载体的卵巢癌干细胞(WWOX+环巴胺组)，培养48 h后，再进行MTT、流式细胞术、Western blot检测。
结果与结论：①pcDNA4.0-WWOX组细胞中WWOX表达水平明显高于pcDNA3.1-WWOX组(t=27.84，P=0.00)。后期选用转染pcDNA4.0-WWOX的卵巢癌干细胞过表达WWOX；②过表达WWOX能够抑制卵巢癌干细胞增殖，促进卵巢癌干细胞凋亡；③过表达WWOX能够抑制卵巢癌干细胞中SHH、PTCH1、Gli-1、SMO表达，促进Cleaved Caspase-3表达；④环巴胺能够抑制SHH、PTCH1、Gli-1、SMO表达，促进Cleaved Caspase-3表达。环巴胺对Hedgehog信号通路具有明显的抑制作用；⑤环巴胺能够增强过表达WWOX诱导的卵巢癌干细胞凋亡，增强过表达WWOX对卵巢癌干细胞增殖的抑制作用；⑥结果表明，WWOX对卵巢癌干细胞的增殖抑制作用和促凋亡作用可能与抑制Hedgehog信号通路有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-6579-8939(王祎祎)

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 卵巢癌, 凋亡, 信号通路, 增殖, 环巴胺, 包含ww域的氧化还原酶

Abstract:

BACKGROUND: WWOX, a tumor suppressor gene, can affect the growth of ovarian cancer stem cells; however, there is no report on whether its mechanism of action is related to Hedgehog signaling pathway.
OBJECTIVE: To investigate the effect and mechanism of overexpression of WWOX on the apoptosis of ovarian cancer stem cells.
METHODS: pcDNA3.1-WWOX (pcDNA3.1-WWOX group) and pcDNA4.0-WWOX (pcDNA4.0-WWOX group) were transferred into ovarian cancer stem cells, respectively; and meanwhile, pcDNA3.1 (pcDNA3.1 group) and pcDNA4.0 (pcDNA4.0 group) were transferred into the cells. A non-transfection group (only with Lipofectamine2000) was set up. After cultured 48 hours, the levels of WWOX in the pcDNA3.1-WWOX group and pcDNA4.0-WWOX group were detected using western blot assay, and the cell proliferation and apoptosis were detected using MTT assay and flow cytometry, respectively. Western blot assay was also used to detect the levels of Hedgehog signaling pathway associated proteins, SHH, PTCH1, Gli-1, SMO and apoptosis-related protein Cleaved Caspase-3 in the cells. Cyclopamine, Hedgehog signaling pathway inhibitor, was used in ovarian cancer stem cells without transfection (cyclopamine group) and after the transfection of WWOX overexpression vector (WWOX+cyclopamine group) followed by 48 hours of culture, and then MTT, flow cytometry and western blot detections were performed.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The expression level of WWOX in the pcDNA4.0-WWOX group was significantly higher than that in the pcDNA3.1-WWOX group (t=27.84, P=0.00). The ovarian cancer stem cells which were transfected with pcDNA4.0-WWOX were used to overexpress WWOX in the late experiment. (2) Overexpression of WWOX could inhibit the proliferation of ovarian cancer stem cells and promote the apoptosis of ovarian cancer stem cells. (3) Overexpression of WWOX could inhibit the expression of Gli-1, PTCH1, SMO and SHH in ovarian cancer stem cells, and promote the expression of Cleaved Caspase-3. (4) Cyclopamine could inhibit the expression of SHH, PTCH1, Gli-1, SMO, and promote the expression of Cleaved Caspase-3. Cyclopamine had obvious inhibitory effect on Hedgehog signaling pathway. (5) Cyclopamine could enhance the apoptosis induced by overexpression of WWOX in ovarian cancer stem cells , and enhance the inhibition of proliferation of ovarian cancer stem cells induced by overexpression of WWOX. To conclude, WWOX effects on proliferation and apoptosis of ovarian cancer stem cells may be related to the inhibition of Hedgehog signaling pathway.

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Key words: Neoplastic Stem Cells, Ovarian Neoplasms, Hedgehog Proteins, Apoptosis, Cell Proliferation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

王祎祎，张向宁，董浩，高蕾，崔晓榕，王春燕，马瑞琳. 抑癌基因WWOX促进卵巢癌干细胞的凋亡及机制[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(29): 4660-4665.

Wang Yi-yi, Zhang Xiang-ning, Dong Hao, Gao Lei, Cui Xiao-rong, Wang Chun-yan, Ma Rui-lin. Pro-apoptotic effect of a tumor suppressor gene WWOX on ovarian cancer stem cells and its mechanism[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(29): 4660-4665.

图/表（结果） 2

2.1 转染后细胞中WWOX表达水平 pcDNA3.1-WWOX组、pcDNA4.0-WWOX组细胞中WWOX表达水平均明显高于未转染组。pcDNA3.1组、pcDNA4.0组细胞中WWOX表达水平与未转染组相比差异无显著性意义。pcDNA4.0-WWOX组细胞中WWOX表达水平明显高于pcDNA3.1-WWOX组，差异有显著性意义，见图1。后期选用转染pcDNA4.0-WWOX的卵巢癌干细胞继续研究。

2.2 WWOX对细胞增殖凋亡的影响 转染pcDNA4.0-WWOX的卵巢癌干细胞存活率与未转染组相比明显下降，而凋亡率明显升高，差异均有显著性意义(t=18.74，P=0.00；t=21.56，P=0.00)。过表达WWOX能够促进卵巢癌干细胞凋亡，抑制卵巢癌干细胞增殖，见图2。

2.3 WWOX对卵巢癌干细胞中SHH、PTCH1、Gli-1、SMO、Cleaved Caspase-3水平的影响 过表达WWOX的卵巢癌干细胞中SHH、PTCH1、Gli-1、SMO水平与未转染组相比均明显下降，而Cleaved Caspase-3水平明显升高。WWOX可能通过抑制Hedgehog信号通路促进卵巢癌干细胞凋亡，见图3。

2.4 Hedgehog信号通路抑制剂对细胞中SHH、PTCH1、Gli-1、SMO、Cleaved Caspase-3水平的影响 与对照组相比，WWOX+环巴胺组细胞中SHH、PTCH1、Gli-1、SMO水平下降，Cleaved Caspase-3水平升高。与对照组相比，环巴胺组细胞中SHH、PTCH1、Gli-1、SMO表达水平明显下降，Cleaved Caspase-3水平明显升高。WWOX+环巴胺组细胞中SHH、PTCH1、Gli-1、SMO表达水平明显低于环巴胺组，Cleaved Caspase-3水平明显高于环巴胺组，见图4。环巴胺能够有效抑制卵巢癌干细胞中Hedgehog信号通路的激活，过表达WWOX和环巴胺对卵巢癌干细胞中Hedgehog信号通路的激活均具有抑制作用。

2.5 Hedgehog信号通路抑制剂对WWOX诱导的细胞增殖凋亡的影响 环巴胺组和WWOX+环巴胺组细胞存活率下降，凋亡率增高。WWOX+环巴胺组细胞存活率明显低于环巴胺组，而凋亡率明显高于环巴胺组，见图5。环巴胺能够增强WWOX诱导的卵巢癌干细胞凋亡作用，增强WWOX诱导的卵巢癌干细胞增殖抑制作用。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞体外实验。

1.2 时间及地点 于2013年12月至2015年8月在山东大学齐鲁医院实验室完成。

1.3 材料 卵巢癌干细胞由山东大学齐鲁医院实验室筛选并保存。pcDNA3.1-WWOX真核表达载体、pcDNA4.0-WWOX真核表达载体均由山东大学齐鲁医院实验室构建并保存。SHH，PTCH1，Gli-1，SMO多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)；Cleaved Caspase-3单克隆抗体，β-actin单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)；表皮生长因子、成纤维生长因子(美国PeproTech公司)；Lipofectamine 2000转染试剂(美国Invitrogen公司)；流式细胞仪(美国Thermo公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养 人卵巢癌干细胞培养于含表皮生长因子(20 μg/L)、成纤维生长因子(10 μg/L)的细胞培养液中，置于37 ℃，饱和湿度，体积分数为5% CO₂培养箱中培养，用0.25%胰蛋白酶消化细胞^[13]。

1.4.2 细胞转染 取卵巢癌干细胞，以每孔10⁶个细胞密度接种到6孔细胞培养板中，观察细胞融合度达到80%时，用Lipofectamine 2000将pcDNA3.1-WWOX真核表达载体、pcDNA3.1空载体、pcDNA4.0-WWOX真核表达载体、pcDNA4.0空载体用脂质体转染的方法转染至卵巢癌干细胞中，分别依次命名为pcDNA3.1-WWOX组、pcDNA3.1组、pcDNA4.0-WWOX组、pcDNA4.0组，放于37 ℃，体积分数为5% CO₂培养箱中培养4 h，更换细胞培养液继续培养。同时设置未转染组，只加入Lipofectamine 2000转染试剂作为对照，其他步骤同转染组。

1.4.3 Western blot检测WWOX表达水平 转染后48 h，提取细胞总蛋白。aBCA蛋白浓度试剂盒检测提取的蛋白样品浓度。将蛋白样品与2×Loading buffer等体积混合，煮沸5 min使其充分变性。取变性蛋白样品加入PAEG凝胶(蛋白凝胶分离胶为12%，浓缩胶为6%)上样孔中，每孔80 μg，用60 V/120 V的电压电泳至结束。电泳结束后，4 ℃转膜(电压25 V，转膜120 min)，取出PVDF膜，放在5%脱脂奶粉中在室温下封闭120 min，依次与一抗(1 000倍稀释，4 ℃孵育过夜)、二抗(2 000倍稀释，37 ℃孵育120min)反应后，滴加显色液，曝光后，以β-actin为内参，蛋白图像分析软件分析蛋白相对表达水平。实验重复3次，取均值。

1.4.4 MTT检测细胞增殖 取转染48 h的卵巢癌干细胞，胰蛋白酶消化，PBS洗涤，1 000 r/min离心5 min，倒掉上清液。用细胞培养液调整细胞浓度为5×10⁷ L^-¹，每孔加入100 μL接种于96孔细胞培养板中培养48 h，每孔加入5 g/L MTT溶液10 μL，在37℃环境中孵育4 h。吸除上清，加入二甲基亚砜100 μL，振荡反应10 min。同时设置空白组，空白组中不加入细胞。每组设置5个复孔，实验重复3次。酶标仪检测各孔在490 nm处的吸光度值，计算细胞存活率。细胞存活率=(转染组吸光度值-空白组吸光度值)/(未转染组吸光度值-空白组吸光度值)。

1.4.5 流式细胞术检测细胞凋亡 收集转染后48 h的卵巢癌干细胞，胰蛋白酶消化，转移到EP管中，调整细胞浓度为1×10¹⁰ L^-¹。取1 mL细胞，1 000 r/min离心10 min，加入PBS重悬洗涤细胞2次，1 000 r/min离心10 min，去除上清液，加入500 μL结合缓冲液，依次加入5 μL Annexin V和5 μL PI混匀，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.4.6 Western blot检测细胞中SHH、PTCH1、Gli-1、SMO、Cleaved Caspase-3水平 取转染后48 h的卵巢癌干细胞，按照1.4.3中Western blot法检测细胞中SHH、PTCH1、Gli-1、SMO、Cleaved Caspase-3水平。SHH、PTCH1、Gli-1、SMO、Cleaved Caspase-3一抗均稀释800倍、二抗稀释1 000倍，以β-actin为内参，分析蛋白相对表达水平。

1.4.7 Hedgehog信号通路抑制剂对卵巢癌干细胞的作用 取卵巢癌干细胞，分为3组，依次为对照组，环巴胺组和WWOX+环巴胺组。对照组卵巢癌干细胞加入正常的细胞培养液，环巴胺组细胞培养液中加入5 μmol/L的Hedgehog信号通路抑制剂环巴胺，WWOX+环巴胺组细胞为转染pcDNA3.1-WWOX真核表达载体和pcDNA4.0-WWOX真核表达载体的卵巢癌干细胞，且在细胞培养液中加入5 μmol/L的Hedgehog信号通路抑制剂环巴胺。培养48 h后，MTT检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡，Western blot检测SHH、PTCH1、Gli-1、SMO、Cleaved Caspase-3水平，步骤参照1.4.4、1.4.5、1.4.6。

1.5 主要观察指标 ①过表达WWOX的卵巢癌干细胞增殖、凋亡情况；②过表达WWOX的卵巢癌干细胞中Hedgehog信号通路关键蛋白表达；③Hedgehog信号通路抑制剂和WWOX对卵巢癌干细胞增殖、凋亡的作用。

1.6 统计学分析 实验数据均采用SPSS 18.0统计学软件分析，Graphpad Prism 5软件做图，数据以x(_)±s表示，两组数据比较用t 检验，多组数据比较用方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

卵巢癌是女性中常见的恶性肿瘤，寻找靶基因抑制卵巢癌干细胞的增殖是根治卵巢癌的有效手段。WWOX基因由2 264个碱基组成，含有9个外显子，其WW结构域由1-4外显子编码，5-8外显子编码氧化还原酶结构域^[14-15]，其中8外显子在肿瘤中发生断裂^[16]。在多种肿瘤细胞中均发现WWOX基因脆裂点的丢失，其编码的蛋白在肿瘤组织中也出现表达下调甚至缺失的现象^[17-18]。过表达WWOX的胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌细胞的增殖能力受到抑制，凋亡增多^[19-21]。WWOX对卵巢癌干细胞的生物学特性也有明显的调控作用。WWOX能够抑制卵巢癌干细胞的增殖和上皮-间质化，促进卵巢癌干细胞的凋亡^[22]。实验通过细胞转染WWOX过表达载体，发现WWOX能够抑制卵巢癌干细胞的增殖，促进卵巢癌干细胞的凋亡，增加促凋亡蛋白Cleaved Caspase-3的表达水平，这与之前的研究结果一致。

Hedgehog蛋白由Hh基因编码，最初发现于果蝇中，在脊椎动物体内含有sonic hedgehog(SHH)、indian hedgehog(IHH)、desert hedgehog(DHH) 3种同源基因^[23-25]。这3种同源基因都能够激活Hedgehog信号通路，参与肿瘤的发生。Hedgehog信号通路由Hedgehog、Ptch、SMO、Gli 4部分组成^[26-28]。有研究表明，SHH、PTCH1、Gli-1、SMO在肺癌组织中表达上调，同样在人上皮性卵巢癌组织中发现SHH，Gli-1表达水平高于正常对应的卵巢组织^[29-31]。这提示Hedgehog信号通路在癌症组织中异常激活。实验进一步探讨了WWOX对卵巢癌增殖凋亡作用机制是否与Hedgehog信号通路有关。过表达WWOX的卵巢癌干细胞中SHH、PTCH1、Gli-1、SMO表达水平均明显下降，这说明过表达WWOX后卵巢癌干细胞中Hedgehog信号通路受到抑制。环巴胺是Hedgehog信号通路的特异性抑制剂。之前的研究结果表明，5 μmol/L环巴胺能够特异性阻断Hedgehog信号通路的激活^[32]。实验运用环巴胺作用于卵巢癌干细胞，发现环巴胺作用后的过表达WWOX卵巢癌干细胞的增殖受到抑制和凋亡增加。这提示WWOX能够通过抑制Hedgehog信号通路的激活促进卵巢癌干细胞的凋亡，抑制卵巢癌干细胞的增殖。

综上所述，WWOX能够抑制卵巢癌干细胞的增殖，促进卵巢癌干细胞的凋亡，作用机制与Hedgehog信号通路有关。这为进一步研究卵巢癌干细胞在卵巢癌发展中的作用奠定了基础，为根治卵巢癌提供了新思路。实验只在体外研究了WWOX对卵巢癌干细胞的作用，后期将在体内进一步探讨WWOX对卵巢癌的作用。

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抑癌基因WWOX促进卵巢癌干细胞的凋亡及机制

Pro-apoptotic effect of a tumor suppressor gene WWOX on ovarian cancer stem cells and its mechanism

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