多发性骨髓瘤U266细胞株中侧群细胞的生物学特性与耐药性的关系

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.29.010

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (29): 4648-4653.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.29.010

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多发性骨髓瘤U266细胞株中侧群细胞的生物学特性与耐药性的关系

保秋萍¹，李惠民²，李晓进³，鄢艳红⁴

¹曲靖市第一人民医院肿瘤科，云南省曲靖市 655000；²昆明医学院第一附属医院血液科，云南省昆明市 650100；³云南省第二人民医院血液科，云南省昆明市 650021；⁴蚌埠医学院第一附属医院，安徽省蚌埠市 233000

修回日期:2017-05-18 出版日期:2017-10-18 发布日期:2017-11-08
通讯作者: 李惠民，硕士，主任医师，昆明医学院第一附属医院血液科，云南省昆明市 650100
作者简介:李惠民，硕士，主任医师，昆明医学院第一附属医院血液科，云南省昆明市 650100
基金资助:
云南省自然科学基金(2007C0037R)

Biological characteristics of side population cells in multiple myeloma U266 cell line in relation to drug resistance

Bao Qiu-ping¹, Li Hui-min², Li Xiao-jin³, Yan Yan-hong⁴

¹Department of Oncology, the First People’s Hospital of Qujing, Qujing 655000, Yunnan Province, China; ²Department of Hematology, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650100, Yunnan Province, China; ³Department of Hematology, the Second People’s Hospital of Yunnan Province, Kunming 650021, Yunnan Province, China; ⁴First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, Bengbu 233000, Anhui Province, China

Revised:2017-05-18 Online:2017-10-18 Published:2017-11-08
Contact: Li Hui-min, Master, Chief physician, Department of Hematology, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650100, Yunnan Province, China
About author:Li Hui-min, Master, Chief physician, Department of Hematology, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650100, Yunnan Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Yunnan Province, No. 2007C0037R

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
侧群细胞：多发性骨髓瘤U266细胞株中存在一小群肿瘤干细胞样细胞亚群，即侧群细胞，这群细胞具有自我更新、多向分化、无限增殖的潜能，具有肿瘤干细胞的生物学特性，有较强的克隆形成能力，说明这群细胞具有较强的体外生存能力和较高的体外成瘤特性，虽然侧群细胞占总数比例较小，但在促使肿瘤增殖中可能起到了重要的作用。
多药耐药性：肿瘤的发生是一个长期、多阶段、多基因改变积累的过程，具有基因控制和多因素调节的复杂性。研究表明：肿瘤多药耐药是导致肿瘤化疗失败的主要原因。肿瘤的耐药性涉及细胞内药物的浓度降低，药物靶分子的改变，代谢解毒，DNA损伤修复功能失衡等多种机制。

摘要
背景：研究表明，肿瘤干细胞是导致肿瘤难以根治，化疗失败和疾病复发的基础和主要原因。因此，针对肿瘤干细胞耐药性的研究成为干细胞领域的研究热点。
目的：研究多发性骨髓瘤U266细胞株中侧群细胞的生物学特性及其与耐药性的关系。
方法：利用流式细胞仪检测U266细胞株中侧群细胞比例，并采用流式细胞分选方法分离侧群细胞和非侧群细胞，进一步比较2个细胞亚群的细胞周期、耐药蛋白、甲基纤维素克隆生长情况；使用RT-PCR方法检测2个细胞亚群ABCG2、MDR1基因的表达。
结果与结论：①U266细胞株中侧群细胞比例为(2.46±0.35)%，绝大多数细胞都处于G₀期，G₀/G₁比例分别达(81.50±5.42)%，高于非侧群细胞(39.85±3.21)%，差异有显著性意义(P < 0.05)；②侧群细胞中耐药蛋白P-gp，ABCG2阳性表达率高于非侧群细胞，差异有显著性意义(P < 0.05)；③侧群细胞的体外克隆形成能力较强，集落形成率高于非侧群细胞，差异有显著性意义(P < 0.05)；④侧群细胞中ABCG2、MDR1基因的表达明显高于非侧群细胞(P < 0.05)；⑤结果表明，U266细胞株中存在肿瘤干细胞样侧群细胞亚群，绝大多数侧群细胞处于G₀期，其ABCG2、MDR1基因表达明显增强，在骨髓瘤干细胞的耐药性机制形成中发挥重要作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-5790-0235(保秋萍)

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 多发性骨髓瘤, 侧群细胞, 耐药性, 云南省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that tumor stem cells are the basis and the main cause of tumor recurrence and chemotherapy failure. Therefore, the research on the drug resistance of tumor stem cells has become a hotspot in the field of stem cell research.
OBJECTIVE: To analyze the biological characteristics of side population (SP) cells in the U266 cell lines in relation to drug resistance.
METHODS: Flow cytometry was used to monitor the percentage of SP cells in the U266 cell lines. Fluorescence-activated cell sorter (FACS) analysis was used to isolate SP and non-SP (NSP) cells from the U266 cell lines. Further analyses of the cell cycle, multidrug resistant protein, methyl cellulose cloning assay of SP cells and NSP cells were performed. Real-time quantitative PCR was used to determine the expression of ABCG2 and MDR1 genes.
RESULTS AND CONCLUSION: There were (2.46±0.35)% SP cells in U266 cells, which were most in the G₀ phase. The ratio of G₀/G₁ in SP cells was (81.50±5.42)%, which was significantly higher than that in NSP cells [(39.85±3.21)%; P < 0.05]. The positive expression rates of P-gp and ABCG2 in SP cells were signficantly higher than those in NSP cells (P < 0.05). The cloning efficiency of SP cells was significantly higher than that of NSP cells (P < 0.05). The mRNA expression of ABCG2 and MDR1 was also significantly higher in SP cells than in NSP cells (P < 0.05). To conclude, a small subpopulation of the isolates of U266 cell lines belong to tumor stem cell-like SP cell subset, most of which are at the G₀ phase. ABCG2 and MDR1 genes are highly expressed in SP cells, which particularly plays a important role in the multidrug resistance of multiple myeloma stem cell lines.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Neoplastic Stem Cells, Multiple Myeloma, Multidrug Resistance-Associated Proteins, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

保秋萍，李惠民，李晓进，鄢艳红. 多发性骨髓瘤U266细胞株中侧群细胞的生物学特性与耐药性的关系[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(29): 4648-4653.

Bao Qiu-ping, Li Hui-min, Li Xiao-jin, Yan Yan-hong. Biological characteristics of side population cells in multiple myeloma U266 cell line in relation to drug resistance[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(29): 4648-4653.

图/表（结果） 1

2.1 U266细胞及其亚群细胞周期的分析 未分选的U266细胞株中侧群细胞比例为(2.46±0.35)%，其中S/G₂/M期细胞比例居中，占(53.09±5.96)%，而分选后的侧群细胞多数处于静止期，G₀/G₁比例达(81.50±5.42)%，明显高于非侧群细胞比例(39.85±3.21)%；侧群细胞S/G₂/M比例仅为(18.32±3.61)%，明显低于非侧群细胞S/G₂/M期细胞所占比例(56.40±3.25)%，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图1，表1。

2.2 U266细胞株分选前后各细胞亚群耐药蛋白的表达 在U266细胞株分选前P-gp和ABCG2表达均较低，分别为(10.96±0.42)%，(16.10±0.50)%，而分选后各细胞亚群中P-gp，ABCG2均为高表达，P-gp阳性表达率在侧群亚群中为(77.74±0.70)%，非侧群亚群中为(53.0±1.09)%，ABCG2阳性表达率在侧群亚群中为(53.0±1.09)%，非侧群亚群中为(36.23±0.75)%。

侧群细胞亚群中耐药蛋白ABCG2，P-gp表达都明显高于非侧群细胞亚群，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2，表2。

2.3 U266细胞株中侧群细胞，非侧群细胞的甲基纤维素克隆实验结果 将U266细胞株及分选后的细胞分别等量接种在甲基纤维素半固体培养基中，培养箱中静置培养2周后观察。实验结果表明，U266细胞的集落形成率为(9.28±3.61)%，而U266细胞株中侧群细胞的体外克隆形成能力较强，在甲基纤维素半固体培养基中培养可见有多个大簇状的集落形成，与之相反，非侧群细胞甲基纤维素半固体培养基中只形成较小而且少的细胞团。统计分析显示，侧群细胞的集落形成率为(39.45±4.02)%，显著高于非侧群细胞(8.21±3.85)%，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3。

2.4 ABCG2，MDR1基因表达的差异 见图4和表3。

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引言

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一种以浆细胞恶性增殖为主的B细胞克隆源性疾病，目前发病率呈逐年上升趋势，其主要表现为多发性骨质破坏，对现有的治疗方法效果不佳，属于难治性恶性血液疾病，不可治愈，严重威胁着人类的健康。多发性骨髓瘤的治疗效果差，治疗后复发及转移，主要与其中部分病变细胞的多药耐药性有密切的关系。

侧群细胞概念的提出为研究肿瘤干细胞的生物学特性提供了新思路，并为肿瘤的临床治疗提供了新的靶点。肿瘤干细胞样侧群细胞是存在肿瘤组织中具有干细胞样特性而又为数极少的细胞群体，它们具有自我更新、分化成不同成熟状态肿瘤细胞的能力，这些处于静止期的肿瘤干细胞不能被细胞增殖周期性化疗药物杀灭，是导致肿瘤难以根治，化疗失败和疾病复发的的基础和主要原因^[1-6]。研究表明，多发性骨髓瘤干细胞是一群能够长期自我更新、多向分化、无限增殖的细胞，具有较强的体外克隆形成能力和成瘤性，并具有多重复杂的多药耐药机制，在多发性骨髓瘤发展过程中起着举足轻重的作用，与疾病的治疗、耐药及复发密切相关^[7-9]。肿瘤的多药耐药，一直是肿瘤研究领域中难以攻克的问题。

目前与耐药有关的ABC转运蛋白主要有P-糖蛋白(P-gp/ABCB1)、多药耐药相关蛋白(MRP/ABCC1)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP/ABCG2)，分别由ABCB1，ABCC1和ABCG2基因编码^[10-11]。如果肿瘤干细胞高表达这类分子，可以将化疗药物泵出细胞，降低细胞内的药物浓度，导致肿瘤化疗后少数肿瘤干细胞仍然存活，这可能是肿瘤耐药、复发以及转移的重要机制。ABCG2参与了肿瘤细胞的原发多药耐药性的形成及肿瘤干细胞样细胞侧群表型的形成^[12]，P-gp也可能在肿瘤的多药耐药中发挥一定的作用，而更多的是与获得性多药耐药相关联，但其具体的耐药机制，是直接参与获得性耐药的形成，还是通过ABCG2共同作用来介导肿瘤的原发性多药耐药性还有待进一步研究。

最新研究认为肿瘤是一种干细胞疾病，是由具有成瘤能力的细胞增殖发育而成的异常组织。肿瘤细胞中仅有极少数的细胞具有干细胞特征，能无限增殖和发生不对称分裂，故称之为肿瘤干细胞^[13-15]。这些细胞在肿瘤的形成和生长过程中起到了决定性作用。目前的研究显示，肿瘤干细胞的生物学特性为其耐药的基础，并在耐药过程中发挥着重要作用。为此，实验以多发性骨髓瘤细胞株U266为研究对象，探讨多发性骨髓瘤细胞株中侧群细胞的生物学特性及其与耐药性的关系，为多发性骨髓瘤的临床治疗提供理想的靶点^[16-19]。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2009年5月至2010年6月在云南省肿瘤医院肿瘤研究所完成。

1.3 材料 多发性骨髓瘤细胞株U266由解放军第二军医大学附属长征医院血液科侯健教授惠赠。胎牛血清购自Hyclone公司；RPMI-1640、青霉素、链霉素购自 Gibco公司；二甲基亚砜、Hoechst33342、Verapamil购自Sigma公司；碘化丙啶、抗CD138抗体、小鼠抗人P-gp单克隆抗体、小鼠抗人ABCG2单克隆抗体均购自Beckman Coulter公司。引物由上海生物工程技术有限公司合成。

1.4 方法

1.4.1 细胞活力测定 U266细胞以2×10⁸ L^-¹的细胞浓度接种于含体积分数为15%灭活的胎牛血清、100 U/mL青霉素、链霉素的RPMI 1640培养基，置于37 ℃、体积分数为5%的CO₂孵箱中培养。每两三天传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

细胞融合度达到80%-95%时，加入锥虫蓝染色，在显微镜下直接计数或拍照后计数，就可对细胞存活率进行精确的定量。实验前经锥虫蓝拒染法检测细胞活力，拒染率95%以上，方可进行下一步实验。

1.4.2 U266细胞中侧群细胞比例的测定及各组细胞周期的检测 取对数生长期的U266细胞悬液，进行细胞计数调至细胞浓度1×10⁹ L^-¹并分组，分别使用5 mg/L Hoechst 33342，5 mg/L Hoechst33342+50 mg/L或100 mg/L维拉帕米进行后续处理；最后加入PI至终质量浓度为2 mg/L，使用流式细胞仪检测侧群细胞的比例。

取细胞浓度为1×10⁹ L^-¹的U266细胞悬液约40 mL，分装到无菌干燥标准流式上样管(毎管分装1 mL细胞悬液)，按上述步骤染色过程细致准备，ALTRA流式细胞仪更换鞘液为乙醇进行清洗后换为双蒸水；分别使用含Hoechst33342管和含Hoechst33342+维拉帕米管进行检测，设置左右收集的细胞群；换上偏振板，调整参数，使偏振板在最佳位置的液滴上，打开左、右分选，使左右两条液流分开，开始分选；并用玻片在左边收集，观察里面是否含有微球；在电脑中选择侧群方案，接受上面的分选参数，以对侧群及非侧群细胞进行分选。在U266细胞及以上收集的侧群细胞、非侧群细胞悬液中，同时加入PI及透膜剂，室温孵育20 min，10 g/L多聚甲醛固定，采用流式细胞仪进行上机检测。激发光波长为488 nm，检测光波长为635-670 nm，观察二倍体峰，四倍体峰，记录并分析各种细胞中G₀/G₁，S和G₂/M期比例的差异性。

1.4.3 耐药蛋白的检测 收集U266细胞、侧群细胞及非侧群细胞的单细胞悬液，加入荧光素FITC标记的anti-p-gp(p170)，PE标记的anti-ABCG2鼠抗人单克隆抗体，室温孵育20 min，10 g/L多聚甲醛固定30 min，上EPICS-XL检测，激发光波长为488 nm，标记PE、FITC荧光素的检测波长分别为576 nm、520 nm。以不加抗体作为荧光表达阴性对照，记录各组细胞阳性表达率，统计学分析各细胞样本耐药蛋白P-gp、ABCG2表达差异。

1.4.4 软琼脂克隆形成实验 甲基纤维素细胞克隆是一种旨在模拟活体内细胞外基质的半固体生长环境，进行活体外探测评价和定量分析细胞纯系化集落生长的潜力和生物学特性的常用细胞生长介质和权威而经典的技术方法。从-20 ℃冰箱里取出甲基纤维素细胞克隆液，置于4 ℃冰箱24 h完全解冻后，摇混，在室温下静置至少30 min，放进37 ℃恒温水槽15 min，移出4.5 mL克隆液到25 mL锥形离心管(避免带有气泡)，调整细胞浓度为2×10⁶ L^-¹，加入0.5 mL U266细胞、侧群细胞及非侧群细胞的细胞悬液，即1×10³个细胞数，混匀在室温下静置20 min，移入25 cm²细胞培养瓶培养，每组各3瓶，放进37 ℃细胞培养箱培养2周后，通过倒置显微镜观察集落形成数目及大小。按照公式计算集落形成率，集落形成率＝形成集落的数目/接种细胞的数目×100%。

1.4.5 实时定量PCR检测ABCG2，MDR1基因的表达 收集U266、侧群和非侧群细胞并提取其总RNA，进行RT-PCR反应。ABCG2引物序列，上游：5’-ATG TCC GGG TCT CCC CAG GC-3’，下游5’-CCA CAG GCT GCC TCC TTG CC-3’，扩增产物大小为246 bp；MDR1引物序列，上游：5’-AGC ACA GCC GCT TCG CTC TC-3’，下游5’-CCA TTC CGA CCT CGC GCT CC-3’，扩增产物大小为183 bp。PCR条件：95 ℃10 min，95 ℃15 s，59 ℃ 20 s，68 ℃ 1 min，共40次循环。在PCR反应结束后，以ABL为内参照，按照相对定量公式2^-^??Ct计算目的基因参照管家基因的相对含量，每一样本设置3个平行管，以3个平行管所得Ct值的均值计算，比较ABCG2、MDR1基因的表达情况。由ABI 7300随机软件分析扩增曲线和产物熔解曲线。

1.5 主要观察指标 ①U266细胞及其亚群细胞周期比例；②U266细胞株分选前后各细胞亚群耐药蛋白的表达；③U266细胞株分选前后各细胞亚群的甲基纤维素克隆形成能力；④U266细胞株分选前后各细胞亚群的ABCG2、MDR1基因的表达。

1.6 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行分析，数据以x(_)±s表示，两组间比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

近年来，在血液系统肿瘤和实体瘤中已经证实存在肿瘤干细胞样侧群细胞^[20-25]，如：肺癌、胰腺癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、宫颈癌、白血病等。实验结果显示，多发性骨髓瘤U266细胞株中存在一小群肿瘤干细胞样细胞亚群，即侧群细胞，这群细胞具有自我更新、多向分化、无限增殖的潜能，具有肿瘤干细胞的生物学特性，有较强的克隆形成能力，显示这群细胞具有较强的体外生存能力和较高的体外成瘤特性，也说明虽然侧群细胞占总数比例较小，但在促肿瘤增殖中可能起到了重要的作用。侧群细胞中G₀/G₁细胞比例明显高于非侧群细胞，而且耐药基因P-gp，ABCG2均为高表达，U266侧群细胞中ABCG2，P-gp阳性表达率明显高于非侧群细胞亚群，可能和侧群细胞绝大部分时间处于静止期有关。由此可证实，多发性骨髓瘤中存在肿瘤干细胞样侧群细胞，具有肿瘤干细胞的生物学特性，其特性可能参与骨髓瘤的多种耐药机制的形成，与多发性骨髓瘤的复发及多药耐药机制有密切关系，对临床中化疗药物敏感性、耐药性及分子靶向治疗的研究具有重要的指导意义^[26-30]。多发性骨髓瘤干细胞通过处于G₀期状态，逃离放化疗药物的杀伤，高表达耐药蛋白及高表达凋亡抑制基因发挥抗凋亡作用，从而形成多发性骨髓瘤的多药耐药性机制^[31-40]。

总之，多发性骨髓瘤细胞的耐药机制是非常复杂的，实验显示多种机制在不同的水平以不同的方式共同参与了多发性骨髓瘤干细胞对化疗药物的拮抗，因此，多发性骨髓瘤干细胞的多药耐药具有显著的特点，对临床上化疗方案的制定和耐药逆转剂的研究具有重要的意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

多发性骨髓瘤U266细胞株中侧群细胞的生物学特性与耐药性的关系

Biological characteristics of side population cells in multiple myeloma U266 cell line in relation to drug resistance

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