三种携带GFP慢病毒转染兔骨髓间充质干细胞的效果

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.29.009

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (29): 4642-4647.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.29.009

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三种携带GFP慢病毒转染兔骨髓间充质干细胞的效果

肖渝，李彦林，王坤，李龙滕，闫祥甲，蒙旭晗

昆明医科大学第一附属医院运动医学科，云南省昆明市 650000

修回日期:2017-05-13 出版日期:2017-10-18 发布日期:2017-11-08
通讯作者: 李彦林，博士，主任医师，昆明医科大学第一附属医院运动医学科，云南省昆明市 650000
作者简介:肖渝，男，1990年生，云南省昆明市人，汉族，在读硕士，主要从事骨与关节疾病研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81460340)；云南省骨关节疾病诊疗省创新团队项目(2014HC1018)；医疗卫生内设机构研究项目(2014NS161)

Transfection efficiency of three different lentiviruses with green fluorescent protein gene to transfect rabbit bone marrow mesenchymal stem cells

Xiao Yu, Li Yan-lin, Wang Kun, Li Long-teng, Yan Xiang-jia, Meng Xu-han

Department of Sport Medicine, the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650000, Yunnan Province, China

Revised:2017-05-13 Online:2017-10-18 Published:2017-11-08
Contact: Li Yan-lin, M.D., Chief physician, Department of Sport Medicine, the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650000, Yunnan Province, China
About author:Xiao Yu, Studying for master’s degree, Department of Sport Medicine, the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650000, Yunnan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81460340; the Yunnan Provincial Innovation Team Project for Diagnosis and Treatment of Bone and Joint Disease, No. 2014HC1018; the Research Project of Medical and Health Institutions, No. 2014NS161

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
绿色荧光蛋白：发现于维多利亚水母，是由238个氨基酸组成，经紫外光激发后可发出峰值为509 nm的绿色荧光，广泛用于基因工程中的基因表达检测、细胞示踪等。经过改良，研制出了增强型绿色荧光蛋白及其他颜色的荧光蛋白变体。
慢病毒：属反转录病毒，具有长期潜伏能力，可以持续感染。目前发现有5种亚型，每种亚型对应的易感物种不同。实验研究所用慢病毒多为HIV-1型，是去毒性后的载体病毒，在基因序列上有一段开放阅读框，允许剪切、插入目的基因，在基因工程、示踪方面有广泛的应用。

摘要
背景：研究不同慢病毒对同一骨髓来源间充质干细胞的转染效果，筛选合适的细胞转染工具。
目的：探究3种慢病毒对兔骨髓间充质干细胞转染效果的差异。
方法：选择2周龄日本大耳白兔，髂骨穿刺抽取骨髓液，采用密度梯度离心法提取骨髓间充质干细胞，流式细胞仪检测细胞表面标志物表达。分别用pTomo-GFP慢病毒、Ad-GFP慢病毒、lenti-GFP慢病毒转染骨髓间充质干细胞，流式细胞仪检测3种慢病毒的转染率。CCK-8法检测转染前后细胞生长活力变化。
结果与结论：①培养出的细胞CD44阳性率为75.64%，CD34、CD45阳性率分别为6.14%、9.48%；②pTomo-GFP慢病毒转染后GFP表达率为2.64%、Ad-GFP慢病毒转染后GFP表达率为16.72%、lenti-GFP慢病毒转染后GFP表达率为45.24%；③各慢病毒对细胞生长存在一定影响。pTomo-GFP、Ad-GFP在第1-8天对细胞生长潜伏期和对数生长期存在影响，可能对前期细胞活性造成一定干扰。短期内lenti-GFP对细胞生长影响不大，但第12天时出现了细胞生长情况变化，考虑对细胞远期活力存在影响；④选用lenti-GFP慢病毒转染兔骨髓间充质干细胞能够在保证细胞正常生长的情况下提供最大的转染效率，适用于兔骨髓间充质干细胞的示踪及基因转染等相关研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-3349-6359(肖渝)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 绿色荧光蛋白, 间充质干细胞, 骨髓间充质干细胞, 慢病毒, 转染, 转染率, 生长曲线, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: We explore the transfection effects of different lentiviruses on bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) from the same source in order to screen out appropriate cell transfection tools.
OBJECTIVE: To explore the difference in the transfection efficiency of three different lentiviruses carrying green fluorescent protein (GFP) to transfect the rabbit BMSCs.
METHODS: Bone marrow samples were extracted from the ilium of 2-week-old Japan white rabbits, and then the BMSCs were separated, purified and extended using density gradient centrifugation. Cell surface markers were identified using flow cytometry. pTomo-GFP lentivirus, Ad-GFP lentivirus and lenti-GFP lentivirus were used to transfect the BMSCs, and the transfection efficiency was tested using flow cytometry. The cell viability was detected using cell counting kit-8 before and after transfection.
RESULTS AND CONCLUSION: As the positive rates of CD44, CD34 and CD45 were 75.64%, 6.14% and 9.48%, respectively, the cultured cells were identified as BMSCs by the flow cytometry. The expression levels of GFP after transfection by pTomo-GFP, Ad-GFP and lenti-GFP were 2.64%, 16.72% and 45.24%, respectively. The cell growth curve showed that pTomo-GFP lentivirus, Ad-GFP and lenti-GFP lentivirus showed certain effects on cell growth. pTomo-GFP and Ad-GFP had an effect on cell growth at incubation period and logarithmic growth phase at 1-8 days after transfection, which may cause some interference to the viability of early cells. lenti-GFP had little effect on cell growth in the short term, but there was a change in cell growth at day 12 after lenti-GFP transfection, and a long-term effect of lenti-GFP on cell viability was considered. Therefore, lenti-GFP lentivirus could highly transfect the BMSCs and could not impact the normal growth of BMSCs, indicating that lenti-GFP lentivirus is suitable for BMSCs tracing and gene transfection.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Lentivirus, Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Green Fluorescent Proteins, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

肖渝，李彦林，王坤，李龙滕，闫祥甲，蒙旭晗. 三种携带GFP慢病毒转染兔骨髓间充质干细胞的效果[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(29): 4642-4647.

Xiao Yu, Li Yan-lin, Wang Kun, Li Long-teng, Yan Xiang-jia, Meng Xu-han. Transfection efficiency of three different lentiviruses with green fluorescent protein gene to transfect rabbit bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(29): 4642-4647.

图/表（结果） 2

2.1 骨髓间充质干细胞的分离培养结果 骨髓液经Percoll离心液分离后可见浅红色上层与透明中层之间有一层薄薄的云雾状单核细胞层，骨髓间充质干细胞大部分就在这一层内。提取并接种于培养瓶内培养，3 d后在显微镜下可见有细胞贴壁，形态呈梭形，7 d可见细胞梭形生长，漩涡样分布，10 d后细胞基本铺满培养瓶底。经传代后细胞生长较快，形态均一稳定，见图1。

2.2 骨髓间充质干细胞表面标记物鉴定结果 流式细胞仪检测提示第3代骨髓间充质干细胞高表达CD44，几乎不表达CD34、CD45，证实所培养细胞为骨髓间充质干细胞，见图2。

2.3 骨髓间充质干细胞分化潜能鉴定结果 经成脂诱导培养，油红O染色后观察发现细胞内出现大小不等圆形红色脂滴(图3A)，证实其具有成脂分化潜能；经成骨诱导培养，茜素红染色后观察发现细胞中出现圆形红染钙结节颗粒(图3B)，证实其具有成骨分化潜能；经成软骨诱导培养，阿利新蓝染色后观察发现细胞质呈现蓝色(图3C)，证实其具有成软骨分化潜能。

2.4 三种慢病毒转染骨髓间充质干细胞效果 第3代骨髓间充质干细胞分别用3种病毒转染5 d后流式细胞仪检测GFP表达情况，结果显示在MOI值为50的条件下，pTomo-GFP慢病毒转染后GFP表达率为2.64%、Ad-GFP慢病毒转染后GFP表达率为16.72%、lenti-GFP慢病毒转染后GFP的表达率为45.24%，传代后转染效果、细胞形态无明显改变，见图4。

2.5 生长曲线测定结果 见图5和表1。从生长曲线可以看出，细胞接种后第1-3天处于生长潜伏期，细胞活力不高，生长缓慢；第4-8天细胞进入对数生长期，此时细胞数量增多，活力增高，铺满培养瓶底；第10-12天细胞生长进入平台期。生长曲线大致呈“S”形分布。

各慢病毒在不同时期对细胞生长存在一定影响。pTomo-GFP、Ad-GFP在第1-8天对细胞生长潜伏期和对数生长期存在影响，可能对前期细胞活性造成一定干扰。短期内lenti-GFP对细胞生长影响不大，但第12天时出现了细胞生长情况变化，考虑对细胞远期活力存在影响。

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引言

材料方法

1.1 设计 体外细胞实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年3至5月在昆明医科大学生物医学工程中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 2周龄普通级雄性日本大耳白兔3只，体质量(2.0±0.7) kg，由昆明医科大学实验动物学部提供。实验过程中涉及动物的相关操作遵循2006年中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》^[6]。

1.3.2 实验试剂和仪器 pTomo-GFP慢病毒(中国科学院昆明动物研究所)；Ad-GFP慢病毒(上海汉恒生物有限公司)；lenti-GFP慢病毒(上海源津生物科技有限公司)；低糖DMEM培养基(Hyclone)；胎牛血清(四季青)；0.25%胰酶-EDTA(Gibco)；Percoll细胞分离液(Pharmacia)；标记一抗CD34-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC(北京博奥森生物技术有限公司)；成骨诱导培养基、成脂诱导培养基、成软骨诱导培养基、茜红素染液、油红O染液、阿利新蓝染液(广州Cygen公司)。倒置荧光显微镜(IX-70，Olumpus公司)；流式细胞仪(德国Partec GmbH)；CCK-8(同仁化学研究所)；多通道酶标仪SpectraMax 190(美国Molecular Devices)。

1.4 实验方法

1.4.1 兔骨髓间充质干细胞的分离与培养 2周龄日本大耳白兔3只，10%水合氯醛麻醉，剃除骶髂部兔毛，乙醇、碘伏消毒后严格无菌操作，于髂骨穿刺抽取骨髓液约10 mL，沿离心管壁缓慢注入加有Percoll分离液的50 mL离心管中，2 500 r/min离心30 min，可见离心管内明显分为上中下3层，上层透明呈浅红色，中层透明为Percoll分离液，下层富含红细胞血浆，用移液器吸取上层与中层交界处的骨髓间充质干细胞，加入PBS清洗2次，离心后用含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基重悬，接种于25 cm²培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂、97.5%湿度的培养箱中。24 h后晃动培养瓶，避免红细胞沉底阻碍骨髓间充质干细胞贴壁。72 h半量换液，之后每隔一两天完全换液，待贴壁细胞80%-90%融合，用0.25%胰酶-EDTA消化，按1×10⁹ L^-¹细胞浓度传代。

1.4.2 兔骨髓间充质干细胞的鉴定 选择生长至80%融合的第3代骨髓间充质干细胞进行干细胞表面标记物鉴定。用0.25%胰酶-EDTA消化、离心、收集细胞，分装入3支2 mL EP管内，调整细胞浓度至1×10⁹ L^-¹，分别加入CD34、CD44、CD45标记一抗，避光孵育50 min，PBS清洗3遍，经流式细胞仪检测细胞表面标记表达情况。

1.4.3 兔骨髓间充质干细胞分化潜能鉴定 选择生长至80%融合的第3代骨髓间充质干细胞进行干细胞分化潜能鉴定。用0.25%胰酶-EDTA消化、离心、收集细胞，调整细胞浓度至1×10⁹ L^-¹，种植于6孔板，培养融合至90%后，吸去培养基。

成脂诱导：选2孔加入2 mL成脂诱导分化培养基A液；3 d后吸去培养孔中A液，每孔加入2 mL成脂诱导分化培养基B液；24 h后，吸去B液，换A液；A液、B液交替5次，最后继续用B液连续培养4 d。诱导结束后，油红O染液染色，镜下观察。

成骨诱导：选2孔加入2 mL成骨诱导分化培养基；每隔2 d更换成骨诱导分化培养基，诱导4周；诱导结束后，茜红素染液染色，镜下观察。

成软骨诱导：选2孔加入0.5 mL成软骨诱导分化培养基，每隔2 d换液，诱导20 d。诱导结束后，阿利新蓝染液染色，镜下观察。

1.4.4 病毒载体介导GFP基因转染兔骨髓间充质干细胞 选择生长至80%融合的第3代骨髓间充质干细胞进行转染，用0.25%胰酶-EDTA消化、离心、收集细胞，计数调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹，接种于6孔板，24 h后分别加入pTomo-GFP慢病毒、Ad-GFP慢病毒、lenti-GFP慢病毒，统一调控加入的转染复数(multiplicity of infection, MOI)值为50，转染时间24 h。24 h后全量换液，用不含病毒的完全低糖培养基继续培养，隔日在倒置显微镜下观察。5 d后收集转染细胞，制成单细胞悬液，以无病毒转染的第3代骨髓间充质干细胞作为空白对照，用流式细胞仪检测转染效果。

用0.25%胰酶-EDTA消化、离心、收集无病毒转染的第3代骨髓间充质干细胞、pTomo-GFP慢病毒转染的第3代骨髓间充质干细胞、Ad-GFP慢病毒转染的第3代骨髓间充质干细胞和lenti-GFP慢病毒转染的第3代骨髓间充质干细胞，以1 000个/孔细胞密度接种于96孔板，每孔加入100 μL低糖DMEM培养基。取2，4，6，8，10，12 d为检测时间点，每个时间点设3个复孔。检测前2 h加入CCK-8溶液，放入培养箱恒温孵育，然后放入酶标仪，测定450 nm处的吸光度值，建立细胞生长曲线。

1.5 主要观察指标 ①光镜下观察兔骨髓间充质干细胞的分离培养生长情况；②流式细胞仪检测细胞表面标记物；③细胞分化潜能鉴定结果；④倒置相差显微镜下观察细胞转染效果；⑤流式细胞仪检测细胞转染效率；⑥酶标仪检测转染对细胞生长情况的影响。

1.6 统计学分析 实验数据采用x(_)±s表示，以a=0.05为检验水准，使用SPSS 17.0对组间对比结果进行单因素方差分析，使用LSD对数据进行组内对比，P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.001为差异有非常显著性意义。

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讨论

骨髓间充质干细胞是一类骨髓中数量较少，但可以无限增殖并且具有多向分化潜能的非造血骨祖细胞^[7-8]，虽然该类细胞仅占骨髓中所有单核细胞的0.01%^[9]，但一直是骨组织工程研究中重要的种子细胞，受到广泛的关注^[10-11]。从以往的实验经验和结论来看，采用Percoll分离液的密度梯度离心法较红细胞裂解法和全细胞培养法能够获得数量更多、活性更高的骨髓间充质干细胞^[12]，并且Percolll分离液对细胞生长无抑制作用^[13]，因此实验采用密度梯度离心法提取骨髓间充质干细胞。然而需要注意的是，文献中对于离心后液体的分层描述为红细胞血小板层、单核细胞层、分离液淋巴细胞层以及血浆层4层^[14]，骨髓间充质干细胞所在的单核细胞层可呈现明显的白色云雾状^[14-15]，但从作者实验中反复操作的结果来看，白膜层并不明显，这一方面可能是由于骨髓提取液中单核细胞数量较少，另一方面则是由于该物种所使用的分离液密度可在1.073-1.077 g/mL范围内^[16]，缺乏统一标准，因此造成实际白膜层不明显，但是吸取呈淡红色透明的红细胞血小板层和透明的分离液淋巴细胞层交界的细胞确实能够分离提取出骨髓间充质干细胞。

骨髓内除了间充质干细胞和造血系干细胞，还含有成骨细胞、破骨细胞、脂肪细胞、基质细胞等组分，想要短时间内获取所需的目的细胞，贴壁筛选法、密度梯度离心法^[17]、红细胞裂解法、免疫磁珠分离法等方法都可作为有效手段^[18]，而不同方法的结合，则可有效提高分离效果，保证细胞纯度。但是如何鉴别骨髓间充质干细胞仍然存在争议。因为缺乏某个或某几个特异的表面标记物作为“金标准”，这也造成了不同实验室对分离出来的细胞采用不同的验证方法，例如有学者仅用定向分化的方法来对细胞进行鉴定^[19]，同时也有部分学者采用细胞表面标记物进行鉴定^[20-22]。针对这一分歧，国际细胞治疗协会提出了以实验室检测为基础的标准明确将细胞表面标记物和体外诱导多分化潜能纳入其鉴定标准^[23]。CD34选择性的表达在哺乳动物的造血系干细胞、髓系祖细胞、粒细胞、巨噬细胞以及血管内皮细胞，是长期以来用作筛选造血系细胞的表面标记物之一^[24-25]；CD44是一种透明质酸纤连蛋白受体，参与干细胞的黏附、增殖和动员，能够趋化间充质干细胞定向迁移^[26-27]；CD45作为造血干细胞的标志^[28]，在白血病中又称为“白血病共同抗原”，是造血系细胞的重要标记物。实验结果显示兔骨髓原代细胞CD44阳性率为75.64%，CD34、CD45阳性率为6.14%和9.48%，且具有多向分化能力，符合骨髓间充质干细胞的鉴定标准。

目前主要常用的基因导入有病毒转染、脂质体转染以及从转基因动物体内直接提取。从细胞示踪的角度上看，虽然有BrdU^[29]、CM-Dil^[30]、DAPI等荧光染料^[31]，还有腺病毒以及Lac-Z基因标记^[32-33]，但是都没有慢病毒所具备的高效、稳定的特点，并且表达时间长，有文献报道GFP慢病毒转染的荧光可在目的细胞内稳定表达6个月以上^[5]，是基因转染和示踪的重要工具。但是从选用的3种慢病毒转染结果来看，转染效果的差异可能是由基因载体的构建原理所决定。病毒载体中的基因最初构建于细菌中的质粒，针对需要表达不同目的基因，基因的构建也会有所差异，这就导致了同样是携带GFP基因的慢病毒，但是最终转染效果不同。另外，转染效果的差别与转染复数值的选择有关，为了达到较高的转染率，根据不同的病毒选择了转染复数从8-100不等的数值^[4]，因此，不同病毒适宜的转染复数是需要通过实际转染效果来测定，因而在一定程度上转染复数值可反映出病毒对细胞的敏感程度。

综上，对于合适的病毒载体的选择，是进行基因治疗研究的第一步，也是进行后续病毒转染及基因表达检测的前提，是缩短实验准备时间，提高科研效率的关键。慢病毒是一类免疫缺陷性病毒，能够感染多种细胞，尤其适用于感染较难转染的细胞如原代细胞、干细胞、甚至神经细胞，能够将大段DNA整合入细胞核。虽然慢病毒载体已经过降低细胞毒力等处理，但是对细胞仍然存在一定的毒性作用。从此次实验结果可以看出，与对照组相比，不同慢病毒对细胞不同生长时期存在不同的影响。首先，在细胞生长潜伏期，对细胞的营养物质贮备和适应能力有一定影响；其次，在对数生长期，细胞活力因营养物质供应障碍而受到不同程度改变；同时在细胞生长平台期，慢病毒载体可能在部分程度上促进细胞的衰老和凋亡。由于此次实验仅记录12 d内细胞的生长状态，不能排除12 d后慢病毒载体对细胞衰老和凋亡存在影响。

在相同MOI值条件下，lenti-GFP慢病毒转染兔骨髓间充质干细胞的效果明显优于其他2种病毒，并且传代后的转染效果、细胞形态无明显差异，因此lenti-GFP慢病毒适用于骨髓间充质干细胞，受限于实验时间及动物对象选择，未对鼠、猪、牛、人等来源的骨髓间充质干细胞进行此类研究。而相关其他物种来源骨髓间充质干细胞在国内、外未见相关实验文献报道，可作为进一步研究论证内容。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

三种携带GFP慢病毒转染兔骨髓间充质干细胞的效果

Transfection efficiency of three different lentiviruses with green fluorescent protein gene to transfect rabbit bone marrow mesenchymal stem cells

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[1]	王景, 熊山, 曹金, 冯林伟, 王信. 白细胞介素3在骨代谢中的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1260-1265.
[2]	肖豪, 刘静, 周君. 脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1266-1271.
[3]	安维政, 何萧, 任帅, 刘建宇. 肌源干细胞在周围神经再生中的潜力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1130-1136.
[4]	范一鸣, 刘方煜, 张洪宇, 李帅, 王岩松. 脊髓损伤后室管膜区内源性神经干细胞反应的系列问题[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1137-1142.
[5]	田川, 朱向情, 杨再玲, 鄢东海, 李晔, 王严影, 杨育坤, 何洁, 吕冠柯, 蔡学敏, 舒丽萍, 何志旭, 潘兴华. 骨髓间充质干细胞调控猕猴卵巢的衰老[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 985-991.
[6]	胡伟, 谢兴奇, 屠冠军. 骨髓间充质干细胞来源外泌体改善脊髓损伤后血脊髓屏障的完整性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 992-998.
[7]	惠小珊, 白京, 周思远, 王阶, 张金生, 何庆勇, 孟培培. 中医药调控干细胞诱导分化的理论机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1125-1129.
[8]	侯婧瑛, 郭天柱, 于萌蕾, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理通过激活MALAT1靶向抑制miR-195促进骨髓间充质干细胞的生存和血管形成[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1005-1011.
[9]	周颖, 张幻, 廖松, 胡凡琦, 易静, 刘玉斌, 靳继德. 去铁胺联合干扰素γ预处理对人牙髓干细胞的免疫调节作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1012-1019.
[10]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
[11]	王继芳, 鲍祯, 乔亚红. miR-206调控小细胞肺癌干细胞EVI1基因表达及细胞生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1027-1031.
[12]	刘峰, 彭宇环, 罗良平, 吴本清. 植物源性碱性成纤维细胞生长因子维持人胚胎干细胞的生长与分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1032-1037.
[13]	闻丹丹, 李强, 沈才齐, 纪哲, 金培生. 外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架提高脂肪间充质干细胞活性修复糖尿病创面[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1038-1044.
[14]	朱兵兵, 邓江华, 陈晶晶, 慕晓玲. 白细胞介素8受体可提高脐带间充质干细胞迁移和向损伤内皮的黏附[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1045-1050.
[15]	罗小玲, 张丽, 杨茂桦, 徐洁, 徐晓梅. 柚皮素干预人牙周膜干细胞的成骨分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1051-1056.