人血红素加氧酶1过表达大鼠骨髓间充质干细胞对缺血缺氧环境损伤的耐受能力

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.29.005

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (29): 4617-4622.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.29.005

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人血红素加氧酶1过表达大鼠骨髓间充质干细胞对缺血缺氧环境损伤的耐受能力

邓宁波¹，韩腾龙²，曾元清³，蒋知新²

¹广东省中医院珠海医院，广东省珠海市 519015；²解放军第305医院，北京市 100017；³郴州市第一人民医院，湖南省郴州市 423000

修回日期:2017-06-06 出版日期:2017-10-18 发布日期:2017-11-08
通讯作者: 蒋知新，硕士，主任技师，解放军第305医院，北京市 100017
作者简介:邓宁波，1990年生，湖南省郴州市人，汉族，2017年南方医科大学毕业，硕士，主要从事冠心病及急性心肌梗死方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(30971235)；军队“十二五”医学科研基金(2013XL010)

Tolerance of rat bone marrow mesenchymal stem cells overexpressing human heme oxygenase 1 to ischemia/hypoxia injury

Deng Ning-bo¹, Han Teng-long², Zeng Yuan-qing³, Jiang Zhi-xin²

¹Zhuhai Hospital of Guangdong Provincial TCM Hospital, Zhuhai 519015, Guangdong Province, China; ²the 305 Hospital of PLA, Beijing 100017, China; ³the First People’s Hospital of Chenzhou, Chenzhou 423000, Hunan Province, China

Revised:2017-06-06 Online:2017-10-18 Published:2017-11-08
Contact: Jiang Zhi-xin, Master, Chief technician, the 305 Hospital of PLA, Beijing 100017, China
About author:Deng Ning-bo, Master, Zhuhai Hospital of Guangdong Provincial TCM Hospital, Zhuhai 519015, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 30971235; the Medical Research Fund of PLA during the Twelfth Five-Year Plan Period, No. 2013XL010

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
人血红素加氧酶1：是一类内源性细胞保护因子，是血红素分解代谢中的限速酶，可借助多种保护性信号通路的激活、旁分泌细胞保护因子及调节线粒体功能，减轻由炎症因子、内毒素等介导的氧化应激损伤，具有良好的抗氧化、抗凋亡作用。
人血红素加氧酶1酶促反应及产物的功能意义：可催化对细胞有毒性的氧自由基、导致DNA损伤及脂质过氧化的蛋白质发生变性，可催化血红素代谢生成胆绿素、一氧化碳和游离铁。胆绿素和胆红素在体内具有良好的抗氧化剂作用，内源一氧化碳具有抑制炎性细胞因子表达，扩张血管和减少血小板聚集等作用，保持微循环的稳定性。

摘要
背景：骨髓间充质干细胞移植后在宿主恶劣的缺血缺氧微环境中生存率过低，限制了其治疗急性心肌梗死的疗效。
目的：探讨人血红素加氧酶1基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞对缺血缺氧环境损伤的耐受能力。
方法：人血红素加氧酶1重组腺病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞，Western blot法确定人血红素加氧酶1蛋白表达的最佳时间；以缺氧无血清条件模拟体内缺血缺氧微环境培养人血红素加氧酶1基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞，采用CCK-8试剂盒和锥虫蓝染色法检测缺血缺氧培养12，24，48，72 h的细胞存活率，流式细胞术检测缺血缺氧培养24 h的细胞凋亡情况。
结果与结论：①在转染后第4天人血红素加氧酶1蛋白表达量最多；②锥虫蓝染色法和CCK-8法检测人血红素加氧酶1组缺血缺氧培养12，24，48，72 h的细胞生存率均高于对照组(P < 0.05)；③流式细胞术检测人血红素加氧酶1组缺血缺氧培养24 h的生存率高于对照组(P < 0.05)；④结果表明，人血红素加氧酶1修饰的大鼠骨髓间充质干细胞对缺血缺氧环境损伤的耐受能力明显增强。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-1164-7403(邓宁波)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 血红素加氧酶1, 骨髓间充质干细胞, 腺病毒, CCK-8, 锥虫蓝, ；流式细胞术, 缺血缺氧, 凋亡, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Under ischemia/hypoxia microenvironment, very low survival rate of transplanted bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) in the host limits its efficacy in the treatment of acute myocardial infarction.
OBJECTIVE: To explore the tolerance of human heme oxygenase 1 (hHO-1) gene modified rat BMSCs to ischemia/hypoxia injury.
METHODS: The rat BMSCs were transfected with hHO-1 recombinant adenovirus. Western blot assay was used to determinate the optimal time of hHO-1 protein expression. hHO-1 modified rat BMSCs were cultured in hypoxia and serum-free conditions that simulated ischemia/hypoxia microenvironment in vivo. Cell counting kit-8 and trypan blue staining were performed to detect the survival rate of BMSCs at 12, 24, 48, 72 hours after culture under the ischemia/hypoxia microenvironment. Flow cytometry was used to detect apoptosis in BMSCs at 24 hours after culture under the ischemia/hypoxia microenvironment.
RESULTS AND CONCLUSION: The expression of hHO-1 protein was highest at 4 days after transfection. Under the ischemia/hypoxia microenvironment for 12, 24, 48, 72 hours, the survival rates of transfected BMSCs were significantly higher as compared with the untransfected cells (P < 0.05), shown by the cell counting kit-8 and trypan blue staining. In addition, the results from flow cytometry showed that there was a higher survival rate of transfected BMSCs than untransfected cells at 24 hours of culture under the ischemia/hypoxia microenvironment (P < 0.05). To conclude, hHO-1 modified rat BMSCs have stronger tolerance to the ischemia/hypoxia microenvironment.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Heme Oxygenase-1, Adenoviridae Infections, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

邓宁波，韩腾龙，曾元清，蒋知新. 人血红素加氧酶1过表达大鼠骨髓间充质干细胞对缺血缺氧环境损伤的耐受能力[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(29): 4617-4622.

Deng Ning-bo, Han Teng-long, Zeng Yuan-qing, Jiang Zhi-xin. Tolerance of rat bone marrow mesenchymal stem cells overexpressing human heme oxygenase 1 to ischemia/hypoxia injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(29): 4617-4622.

图/表（结果） 1

2.1 骨髓间充质干细胞鉴定结果 经流式细胞仪检测，结果显示第3代骨髓间充质干细胞的特异性表面标志物CD45阴性，阳性率为0.5%(图1A2)；CD29阳性，阳性率为98.0%(图1A3)；CD90阳性，阳性率为99.2%(图1A4)。

成脂诱导3周后，骨髓间充质干细胞有脂滴形成，油红O染色呈红色(图1B2)，成骨诱导3周后，骨髓间充质干细胞有钙结节形成，茜素红染色呈红色(图1C2)。

2.2 hHO-1蛋白表达 空白组(未转染腺病毒)及对照组(转染空载质粒腺病毒)未见明显条带，HO-1组(转染hHO-1重组腺病毒)随着时间延长目的蛋白的表达量增加，在第4天达到最大表达量(图2)。

2.3 锥虫蓝染色法检测细胞存活率 正常培养条件下的对照组和HO-1组的生存率分别为(98.02±0.78)%，(98.33± 0.77)%(n=30，t=-1.535，P=0.130)，差异无显著性意义。缺血缺氧培养12，24，48，72 h的对照组和HO-1组的生存率分别为(70.37±2.28)% vs. (82.32±1.61)%(n=30，t=-23.358，P=0.000)，(49.41±3.27)% vs. (60.90±2.58)% (n=30，t=-15.107，P=0.000)，(20.93±2.67)% vs. (25.17± 2.61)%(n=30，t=-6.182，P=0.000)，(13.60±2.21)% vs. (15.20±1.74)%(n=30，t=-3.121，P=0.003)，差异有显著性意义(图3)。

2.4 CCK-8法检测细胞存活率 对照组和HO-1组缺血缺氧12 h生存率分别为(79.32±1.26)%，(89.31±2.06)% (n=60，t=-32.030，P=0.000)，缺氧24 h生存率分别为(55.95±2.27)%，(67.73±2.38)%(n=60，t=-27.734，P=0.000)，缺血缺氧48 h生存率分别为(22.69±1.54)%，(27.24±1.80)%(n=60，t=-14.858，P=0.000)，缺血缺氧72 h生存率分别(13.15±1.30)%，(18.06±1.89)% (n=60，t=-16.554，P=0.000)，差异均有显著性意义(图4)。

2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 阴性对照生存率为(97.39±1.15)%(图5A)，缺血缺氧24 h后对照组及HO-1组生存率分别为(52.72±4.66)%，(62.15±3.88)%(n=27，t= -8.076，P=0.000)(图5B，C)，差异有显著性意义。

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引言

急性心肌梗死是当今社会严重威胁人类健康的临床常见危急重症之一，不良的饮食习惯和缺乏有效锻炼致使急性心肌梗死的发病率近年来呈年轻化的上升趋势，全球范围内每年死于冠心病的人数高达1 650万，由此带来的经济负担超过3 201亿美元^[1]。尽管传统的药物治疗、经皮冠状动脉介入治疗以及冠状动脉旁路移植手术等治疗方法能很大程度提高急性心肌梗死患者生存率，但是并不能逆转梗死区病理性重构形成的瘢痕组织，坏死的心肌组织也无法得到再生性修复。

近年来，诸多研究表明，骨髓间充质干细胞移植在心肌细胞修复和再生、心脏功能恢复等方面具有良好的发展潜力^[2-4]。然而移植的骨髓间充质干细胞在宿主恶劣的缺血缺氧微环境中生存率过低，限制了其治疗急性心肌梗死的疗效^[5-6]。因此，增强骨髓间充质干细胞在缺血缺氧微环境中的抗凋亡能力将成为细胞移植治疗技术上一个具有广阔前景的方法^[7-8]。

研究表明，人血红素加氧酶1(human heme oxygenase-1，hHO-1)可借助多种保护性信号通路的激活、旁分泌细胞保护因子及调节线粒体功能，减轻由炎症因子、内毒素等介导的氧化应激损伤，具有良好的抗氧化、抗凋亡作用^[9-11]。通过对骨髓间充质干细胞进行基因修饰的方法，增强HO-1的表达，在理论上对细胞移植治疗具有积极的作用。

基于此，实验使用hHO-1重组腺病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞，在体外模拟的缺血缺氧微环境下培养，探讨hHO-1过表达骨髓间充质干细胞的抗凋亡能力随时间的变化，为其应用于动物实验奠定基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞体外观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年3至9月在解放军总参谋部医学研究中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 清洁级雄性SD大鼠4只，两三周龄，体质量70-75 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

1.3.2 实验仪器和试剂 CO₂培养箱(MCO-18AIC-SC，日本SANYO)；倒置显微镜(Axio Vert.A1，德国Carlzeiss)；流式细胞仪(EPICS^® XL-MCL，美国Beckman Coulter)；缺氧培养箱(AG300，美国Gene Science)；酶标仪(美国Thermo Scientific)；FITC兔抗大鼠CD29抗体、FITC兔抗大鼠CD45抗体、FITC兔抗大鼠CD90抗体(美国Biolegend)；成脂、成骨诱导剂(美国Sigma)；hHO-1重组腺病毒(上海汉恒生物科技有限公司)；抗HO-1单克隆抗体(美国CST)；Cell Count Kit-8(CCK-8)试剂盒(日本Dojindo)；Annexin V-PE/7-AAD凋亡检测试剂盒(美国eBioscience)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞分离、纯化^[12] 采用全骨髓贴壁法，大鼠脱颈处死，提取双侧股骨骨髓，接种于25 cm²培养瓶，培养48 h后首次半量换液，以后每隔3 d换液1次，待细胞接近90%融合时胰酶消化2 min，按1︰2比例传代至100 mm培养皿，传至第3代的所有细胞用于实验。

1.4.2 骨髓间充质干细胞鉴定 ①第3代细胞根据试剂厂商实验指南分别与FITC-CD29、PE-CD45、PE-CD90抗体孵育，上流式细胞仪检测，检测结果应用EXPO32 ADC软件进行分析；②接种1×10⁵第3代骨髓间充质干细胞于6孔板中，待融合度近80%时使用含体积分数为10%胎牛血清完全培养基(含成脂诱导剂)、含体积分数为10%胎牛血清完全培养基(含成骨诱导剂)及含体积分数为10%胎牛血清完全培养基培养，每隔3 d换液，连续培养3周，分别用油红O染色、茜素红染色鉴定细胞定向分化结果。

1.4.3 转染骨髓间充质干细胞及基因表达的检测 接种5×10⁵第3代骨髓间充质干细胞于6孔板中，12 h后按照MOI为1︰100分别加入hHO-1重组腺病毒(GFP修饰)及空白载体病毒(GFP修饰)，转染4 h后换液，48 h后倒置荧光显微镜观察荧光表达，分别收集转染后2，3，4，5 d及未转染腺病毒的细胞，提取蛋白，Western blot法检测hHO-1蛋白表达。

1.4.4 骨髓间充质干细胞缺血缺氧处理及细胞生存率、凋亡检测

(1)接种5×10⁵第3代骨髓间充质干细胞于6孔板中，12 h后分别转染空载质粒腺病毒及hHO-1重组腺病毒，待hHO-1蛋白表达量最大时于缺血缺氧(体积分数为5%CO₂，体积分数为95%N₂，无血清)条件及正常培养(体积分数为5%CO₂，体积分数为21%O₂，体积分数为10%胎牛血清，完全培养基)条件下分别培养12，24，48，72 h，收集培养液及胰酶消化下来的细胞，进行锥虫蓝染色，计数。

(2)接种4×10³第3代骨髓间充质干细胞于96孔板中，12 h后分别转染空载质粒腺病毒及hHO-1重组腺病毒，待hHO-1蛋白表达量最大时分别在缺血缺氧条件及正常培养条件下培养12，24，48，72 h，加入CCK-8试剂37 ℃孵育1.5 h，酶标仪读取吸光度值。生存率=缺血缺氧测得的吸光度/正常培养测得的吸光度。

(3)接种5×10⁵第3代骨髓间充质干细胞于6孔板中，12 h后分别转染空载质粒腺病毒及hHO-1重组腺病毒，待hHO-1蛋白表达量最大时在缺血缺氧条件下培养24 h，流式细胞术检测细胞凋亡情况。

1.5 主要观察指标 ①流式细胞术检测骨髓间充质干细胞特异性表面标志物CD29、CD45、CD90的表达以及体外诱导后定向分化能力；②hHO-1重组腺病毒转染骨髓间充质干细胞后hHO-1蛋白的表达；③对照组和HO-1组缺血缺氧培养后细胞生存率和增殖、凋亡情况。

1.6 统计学分析 计量数据采用x(_)±s表示，多组间差异采用单因素方差分析，两组间比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义，用SPSS 19.0统计软件进行分析。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

HO-1是一类内源性细胞保护因子，是血红素分解代谢中的限速酶，它能减轻内毒素及多种细胞炎症因子诱导的氧化应激损伤，并且有研究表明其参与反应的终产物如一氧化碳及胆红素等也具有极强的抗氧化、抗凋亡作用^[13-20]。HO-1能增强骨髓间充质干细胞旁分泌多种细胞保护因子诸如血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等^[9^，^21-22]。Mancuso等^[23]研究表明增加HO-1能抑制黏附分子ICAM-1的表达，从而抑制活性氧介导的白细胞黏附，起到抗炎的作用。因此，hHO-1过表达的大鼠骨髓间充质干细胞有可能增强其在缺血缺氧微环境中的抗凋亡能力，进而改善骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死的疗效。

骨髓间充质干细胞进行研究和应用的前提是首先从供体中分离出骨髓间充质干细胞，目前国内外常用的分离方法有流式细胞仪分选、免疫磁珠分选法、密度梯度离心法、全骨髓贴壁分离法。其中全骨髓贴壁分离法操作简单，对细胞损伤较小，是比较经典的分离方法。实验采用全骨髓贴壁法从幼鼠股骨骨髓中提取骨髓间充质干细胞。关于鉴定骨髓间充质干细胞，2006年细胞疗法国际学会制定的骨髓间充质干细胞鉴定标准具有一定的借鉴意义^[24]。这一点也得到了国内外大部分专家的肯定，是目前比较常用的一种鉴定方式。因此，实验对完成分离纯化的细胞从2个方面进行鉴定：①流式细胞术检测细胞表面分子CD29、CD45、CD90的表达；②成脂、成骨诱导剂诱导骨髓间充质干细胞定向分化为脂肪细胞、骨细胞。实验采用重组腺病毒转染骨髓间充质干细胞，结果表明高效率转染的同时不影响细胞的增殖分化能力。采用Western blot法检测hHO-1蛋白表达，确定转染后第4天目的蛋白表达量达到最大，HO-1的表达与国内外同期研究结果相符^[25-26]，在表达量最高时能有效抵抗缺血缺氧损伤。

实验采用3种方法检测细胞的生存率，不同方法的侧重点不同，锥虫蓝染色法从细胞膜的完整性方面检测细胞生存率，可在一定程度上反映缺血缺氧对细胞膜的损伤作用^[27]；CCK-8法从细胞增殖能力方面检测细胞生存率，反映细胞在缺血缺氧环境中增殖能力的改变^[28]；流式细胞术可区分细胞存活、早期凋亡及晚期凋亡的状态^[29]。3种不同检测方法的实验结果均表明重组腺病毒转染的骨髓间充质干细胞在缺血缺氧环境中的生存率高于对照组，差异有显著性意义，表明经hHO-1修饰的大鼠骨髓间充质干细胞对缺血缺氧环境损伤的耐受能力明显增强。白海等^[30]通过加入HO-1特异性抑制剂的方法证实HO-1在骨髓间充质干细胞中表达并发挥抗细胞凋亡的作用。Hamedi-Asl等^[25]检测过表达HO-1的骨髓间充质干细胞在不同浓度的过氧化氢、缺血清及缺氧微环境中培养24 h的增殖能力及凋亡情况，证实HO-1可有效增强骨髓间充质干细胞的抗氧化、抗凋亡能力。

国内外的研究多以固定的缺血缺氧时间点探讨骨髓间充质干细胞抗凋亡能力^[31-33]，本实验检测了不同时间(12，24，48，72 h)缺血缺氧微环境下骨髓间充质干细胞的增殖能力及凋亡状态，体现骨髓间充质干细胞在缺血缺氧环境下的渐变过程，对研究骨髓间充质干细胞在缺血缺氧微环境中的抗氧化、抗凋亡能力提供更多的实验支持。由于HO-1不仅通过自身反应体系发挥抗氧化应激损伤的作用，同时能借助激活多种化学信号通路的交互影响产生旁分泌细胞因子，保护性信号通路，线粒体功能介导的多重保护作用^[34-36]，实验在体外以缺氧无血清条件模拟体内缺血缺氧微环境探讨HO-1的抗凋亡能力存在一定的局限性，下一步通过移植到大鼠心肌梗死模型的体内实验证明其抗氧化、抗凋亡的能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

人血红素加氧酶1过表达大鼠骨髓间充质干细胞对缺血缺氧环境损伤的耐受能力

Tolerance of rat bone marrow mesenchymal stem cells overexpressing human heme oxygenase 1 to ischemia/hypoxia injury

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