盐酸四环素对大鼠骨髓间充质干细胞的成骨诱导分化活性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.29.003

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (29): 4605-4610.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.29.003

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 上一篇下一篇

盐酸四环素对大鼠骨髓间充质干细胞的成骨诱导分化活性

张珏¹，薛斯亮²，罗媛³，智伟⁴

¹遵义医药高等专科学校药学系，贵州省遵义市 563006；²四川大学华西医院皮肤科，四川省成都市 610041；³贵州省骨科医院药剂科，贵州省贵阳市 550004；⁴西南交通大学材料先进技术教育部重点实验室材料科学与工程学院，四川省成都市 610041)

修回日期:2017-06-13 出版日期:2017-10-18 发布日期:2017-11-08
通讯作者: 智伟，博士，工程师，西南交通大学材料先进技术教育部重点实验室材料科学与工程学院，四川省成都市 610041
作者简介:张珏，女，1981年生，汉族，贵州省遵义市人，2012年四川大学华西药学院毕业，硕士，执业药师，副教授，主要从事干细胞、药物的生物筛选与评价方面的研究。共同第一作者：薛斯亮，男，1980年生，汉族，四川省成都市人，2010年四川大学华西临床医学院毕业，博士，主治医师，主要从事皮肤干细胞方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(31400809)；贵州省科技厅科学技术基金项目 [2012]2366号；中央高校基本科研业务费专项资金(2682015CX006)

Tetracycline hydrochloride induces the osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells

Zhang Jue¹, Xue Si-liang², Luo Yuan³, Zhi Wei⁴

¹Department of Pharmacy, Zunyi Medical and Pharmaceutical College, Zunyi 563000, Guizhou Province, China; ²Department of Dermatology, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China; ³Department of Pharmacy, Guizhou Province Osteological Hospital, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; ⁴Key Laboratory of Advanced Technologies of Materials, Ministry of Education, School of Materials Science and Engineering, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China

Revised:2017-06-13 Online:2017-10-18 Published:2017-11-08
Contact: Zhi Wei, Doctor, Engineer, Key Laboratory of Advanced Technologies of Materials, Ministry of Education, School of Materials Science and Engineering, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
About author:Zhang Jue, Master, Associate professor, Department of Pharmacy, Zunyi Medical and Pharmaceutical College, Zunyi 563000, Guizhou Province, China; Xue Si-liang, M.D., Attending physician, Department of Dermatology, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China Zhang Jue and Xue Si-liang contributed equally to this work.
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31400809; the Science and Technology Foundation of Guizhou Science and Technology Department, No. [2012]2366; the Fundamental Research Funds for the Central Universities, No. 2682015CX006

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
盐酸四环素的药理作用：口服吸收不完全。本品可透入胎盘和进入乳汁。盐酸四环素是广谱抗生素，起抑菌作用，其抗菌谱包括许多革兰阳性和阴性菌、立克次体、支原体、衣原体、放线菌等。盐酸四环素现主要用于立克次体病、布氏杆菌病、淋巴肉芽肿、支原体肺炎、螺旋体病、衣原体病，也可用于敏感的革兰阳性菌或革兰阴性菌所引起的轻症感染。
碱性磷酸酶(ALP或AKP)：是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶。这种酶能催化核酸分子脱掉5'磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5'-P末端转换成5’-OH末端。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。目前已发现有AKP1、AKP2、AKP3、AKP4、AKP5与AKP6六种同功酶。其中第1、2、6种均来自肝脏，第3种来自骨细胞，第4种产生于胎盘及癌细胞，而第5种则来自小肠绒毛上皮与成纤维细胞。

摘要
背景：盐酸四环素不仅具有促进骨髓间充质干细胞增殖的作用，还具有极强的骨亲活性。研究盐酸四环素诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，可为获得骨组织工程细胞提供新方法。
目的：观察体外盐酸四环素对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的作用。
方法：骨髓全血细胞贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，通过细胞形态和骨髓间充质干细胞标志物CD34、CD45、CD90、CD29流式检测对骨髓间充质干细胞进行鉴定；取第3代骨髓间充质干细胞与盐酸四环素共培养，以含体积分数10%FBS的L-DMEM的完全培养基培养做对照组。通过检测碱性磷酸酶活性、Ⅰ型胶原和骨钙素免疫组织化学染色、茜素红矿化钙结节组织化学染色、Ⅰ型胶原蛋白和骨钙素的RT-PCR的基因表达，研究盐酸四环素对骨髓间充质干细胞的成骨诱导分化活性。
结果与结论：①盐酸四环素能够持续促进骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性增加，与对照组比较具有显著性差异；②盐酸四环素诱导培养骨髓间充质干细胞 21 d，Ⅰ型胶原蛋白和骨钙素染色表达阳性，茜素红染色出现红色钙结节，RT-PCR检测Ⅰ型胶原蛋白和骨钙素基因表达；对照组程阴性表达；③结果表明，盐酸四环素具有明显促进骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-3084-1682(张珏)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 盐酸四环素, 骨髓间充质干细胞, 诱导分化, 成骨细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Tetracycline hydrochloride not only promotes the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs), but also has a strong bone activity. Studies on the osteogenic differentiation of BMSCs induced by tetracycline hydrochloride will provide a new cell source for bone tissue engineering.
OBJECTIVE: To observe the induction and differentiation activity of BMSCs into osteoblasts cultured by tetracycline hydrochloride in vitro.
METHODS: BMSCs were separated and expanded by whole bone marrow adherent method and identified by cell morphology and BMSCs cell markers CD34, CD45, CD90, CD29. Passage 3 BMSCs were collected and cultured with tetracycline hydrochloride (experimental group) or cultured in L-DMEM containing 10% fetal bovine serum (control group). Osteogenic induction and differentiation activity of BMSCs cultured by tetracycline hydrochloride were detected by alkaline phosphatase activity detection, collagen I and osteocalcin immunohistochemistry staining, alizarin red staining of mineralized calcium nodules, and detection of collagen I and osteocalcin gene expression by RT-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Tetracycline hydrochloride continuously promoted alkaline phosphatase activity in the BMSCs, significantly different from that in the control group. After 21 days of culture, positive expression of collagen I and osteocalcin proteins, red calcium nodules shown by alizarin red staining, and mRNA expression of collagen I and osteocalcin were observed in the experimental group, while the negative expression was found in the control group. In conclusion, tetracycline hydrochloride has a significant role to promote the osteogenic differentiation of BMSCs.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Tetracycline Hydrochloride, Mesenchymal Stem Cells, Osteoblasts

中图分类号:

R394.2

张珏，薛斯亮，罗媛，智伟. 盐酸四环素对大鼠骨髓间充质干细胞的成骨诱导分化活性[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(29): 4605-4610.

Zhang Jue, Xue Si-liang, Luo Yuan, Zhi Wei. Tetracycline hydrochloride induces the osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(29): 4605-4610.

图/表（结果） 1

2.1 骨髓间充质干细胞的分离培养及表面标记物检测结果 骨髓间充质干细胞经体积分数10%FBS的L-DMEM完全培养基培养24 h后贴壁，呈棱形、圆形或多角形；6 d后细胞数目明显增多，以梭形细胞为主，涡旋状排列，八九天后细胞融合达90%，且间边界不清，呈纺锤形。

流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标记物抗原CD34阴性表达率99.7%(图1A)，CD45阴性表达率99.4%(图1B)，CD90阳性表达率99.2%(图1C)，CD29阳性表达率99.8%(图1D)，符合SD大鼠骨髓间充质干细胞的特征。

2.2 碱性磷酸酶活性检测结果 随着培养时间的延长，对照组和盐酸四环素诱导组细胞的碱性磷酸酶活性均持续增高。盐酸四环素诱导组细胞在各时间点碱性磷酸酶活性均高于对照组，差异有显著性意义(t 检验，P < 0.05，表1)。

2.3 胶原蛋白免疫组织化学染色结果 盐酸四环素诱导组行Ⅰ型胶原蛋白免疫组织化学染色后，绝大多数细胞呈现阳性反应，即细胞胞浆内有较多棕黄色颗粒出现(图2A)，这说明细胞中有大量Ⅰ型胶原蛋白表达。细胞核苏木精染色呈蓝色；对照组胞核呈蓝色，胞浆不着色，表明Ⅰ型胶原蛋白几乎不表达，反应阴性(图2B)。

2.4 骨钙素免疫组织化学染色结果 盐酸四环素诱导组行骨钙素免疫组织化学染色后，绝大多数细胞呈现阳性反应，即细胞胞浆内有较多棕黄色颗粒出现(图3A)，这说明细胞中有大量骨钙素表达。对照组细胞胞浆不着色，核呈蓝色(图3B)。

2.5 茜素红矿化钙结节组织化学染色结果 盐酸四环素诱导组细胞培养第16 d可见细胞呈集落式生长，呈团状向四周放射，形成钙结节(图4A)，21 d经茜素红染色钙结节呈红色，结节边缘光滑，立体感强。茜素红对钙离子特征性红染，当骨向分化的细胞进入分化末期时，细胞停止增殖，大量分泌类骨质掩埋自己，并释放骨钙素促进钙磷沉积，最终成为骨细胞(图4B)；对照组细胞培养随时间延长聚集生长，21 d染色未见钙结节出现(图5A、图5B)。

2.6 Ⅰ型胶原蛋白和骨钙素的RT-PCR鉴定结果 盐酸四环素诱导组可见大小为328 bp的Ⅰ型胶原蛋白条带和221 bp的骨钙素条带及692 bp的β-actin条带；对照组中未见Ⅰ型胶原蛋白条带和骨钙素条带(图6)。

参考文献

[1] Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science.1999; 284: 143-147.

[2] Derval N, Barandon L, Dufourcq P, et al.Epicardial deposition of endothelial progenitor and mesenchymal stem cells in a coated muscle patch after myocardial infarction in a murine model.Eur J Cardiothorac Surg.2008;34:248-254.

[3] Song K, Yang Z, Liu T, et al.Fabrication and detection of tissue-engineered bones with bio-derived scaffolds in a rotating bioreactor. Biotechnol Appl Biochem. 2006;45(Pt 2): 65-74.

[4] 殷晓雪,陈仲强,郭昭庆,等.人骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞及其鉴定[J]. 中国修复重建外科杂志,2004,18(2): 88-91.

[5] Riew KD,Wright NM,Cheng S,et al.Induction of bone formation using a recombinant adenoviral vector carrying the human BMP-2 gene in a rabbit spinal fusion model. Calif Tissue Int.1998;63(4):357-360.

[6] Locklin RM,Williamson MC,Beresfird JN, et al. In vitro effects of growth factors and dexamethasone on rat marrow stromal cells.Clin Orthop Relat Res.1995;(313):27-35.

[7] Golub LM, Lee HM, Lehrer G ,et al.Minocycline reduces gingival collagenolytic activity during diabetes:preliminary observations and a proposed new mechanism of action. J Periodontal Res.1983;18(5):516-526.

[8] Golub LM,Ramamurthy NS,McNamara TF,et al.Tetracyclines inhibit tissue collagenase activity:a new mechanism in the treatment of periodontal disease.J Periodontal Res.1984;19: 651-655.

[9] Golub LM, Goodson JM, Lee HM,et al. Locally and lowdose systemically administered tetracycline inhibitt issue collagenase activity:potential new approaches in the treatment of periodontal disease.J Periodontol.1985;56: 93-97.

[10] Golub LM,Wolf M,Lee HM,et al.Further evidence that Tetracyclines inhibit collagenase activity in human crevicular fluid and from other mammalian source.J Periodont Res.1985; 20:12 -23.

[11] 陈旭,杨志明,解慧琪,等.WO-1对成骨细胞的生物学效应研究[J].中国修复重建外科杂志,2005,19(10):822-825

[12] 李莉,黄永灿,常丽,等.盐酸四环素缓释微球的制备[J].华西药学杂志,2008,23(4):391-393.

[13] 张珏,陈晓和,李莉,等.盐酸四环素缓释微球对大鼠成骨细胞活性的影响[J].华西药学杂志,2010,25 (1):1-3.

[14] 张珏,邓媛媛,曾富佳.盐酸四环素缓释微球对成骨细胞增殖作用的研究[J].中国民族民间医药杂志,2013,22(18):19-20.

[15] 隋珂. DDR2基因缺失对小鼠骨髓间充质干细胞生物学特性影响的研究[D].陕西:第四军医大学(西安),2014:13.

[16] Undale AH,Westendorf JJ,Yaszemski MJ,et al.Mesenchymal stem cells for bone repair and metabolic bone diseases. Mayo Clin Proc. 2009;84(10):893-902.

[17] Wagner W,Wein F,Seckinger A,et al.Comparative characteristics of mesenchymal stemcells from human bone marrow,adipose tissue,and umbilical cord blood.Exo Hematlo. 2005 ;33(11):1402-1416.

[18] 柯金勇,林艳娟.骨髓间充质干细胞生物学特性的研究[J].医学综述,2008,14(15):2241-2244

[19] 马威,时惠英,刘宝林,等.成骨细胞在微弧氧化处理后纯钛表面的附着、增殖及ALP活性[J].实用口腔医学杂志,2005,21(1)：106-110.

[20] Alborzi A,Mac K,Glackin CA,et al.Endochondral and intramembranous fetal bone development：osteoblastic cell prolifcration and expression of alkaline phosphatasc, intwist,and histone H4.J Craniofac Gent Dev Biol.1996;6(2): 94-106．

[21] 段智霞,郑启新,郭晓东,等.骨形成蛋白2活性多肽体外定向诱导骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的剂量依赖性研究[J].中国修复重建外科杂志,2007,21(10):1118-1121.

[22] Roehlecke C,Witt M,Kasper M,et al.Synergis tic effect of titanium alloy and collagen type I on cell adhes ion, proliferation and differentiation of os teoblas t-like cells.Cells Tis sues Organs.2001;168(3):178-187.

[23] 李灵芝,翁玲玲,张文亮.四环素-哌嗪雌酚酮对小鼠骺板I型胶原表达的影响[J].四川大学学报:医学版,2003,34(1):86-88.

[24] 祁洁.骨组织工程中成骨细胞与生物材料相互作用的分子机制[D] .成都:四川大学,2005.

[25] 马慧萍,贾正平,陈克明,等.含淫羊藿总黄酮大鼠血清对成骨细胞发育的影响[J].中国中药杂志,2008,33(8): 928-9301

[26] Gunberg CM, Nishimoto SK.Vitamin K-Dependent Proteins of Bone and Cartilage. Dynamics of Bone and Cartilage Metabolism. San Diego, Academic Press.1999:45-53.

[27] 周昆鹏,陈晓禾,常丽,等.成骨细胞条件培养液对BMSCs的诱导分化作用[J].中国修复重建外科杂志,2009,23(2):145-150.

引言

骨髓间充质干细胞强大的自我复制能力和多向分化潜能备受瞩目，其在特定的诱导条件下，能够向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、骨髓基质细胞、肌腱、血管内皮细胞及神经星状细胞等分化^[1]，可用于多种组织缺损的修复。由于骨髓间充质干细胞来源广、易于分离扩增和诱导分化，在临床、科研上有很大的潜在的应用价值。在组织工程中，骨髓间充质干细胞可与不同的生物材料结合，修复缺损的组织^[2-3]，被公认为是理想的组织工程种子细胞来源，也成为构建组织工程骨的重要细胞。

近期骨组织工程研究中，对骨髓间充质干细胞进行改造，使其在保持快速生长和活性的同时向成骨方向分化是研究热点。在体外促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的主要的方法为使用生长因子(如：骨形态发生蛋白2、转化生长因子β等)和诱导剂(地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸等)进行诱导^[4-6]，但因不能真实模拟体内环境、昂贵的价格等缺点限制了实际应用。已经证实，盐酸四环素是具有骨靶向性，且廉价易得的药物。研究表明低剂量盐酸四环素不仅具有促进体外培养的人胚成骨细胞活性及增殖^[7-10]，增加并且加强细胞合成Ⅰ型胶原、骨钙素等基质的表达^[11]，而且所制备的盐酸四环素缓释微球具有促进成骨细胞增殖和提高碱性磷酸酶活性的作用^[12-14]。

实验拟将具有骨靶向性且能促进骨髓间充质干细胞增殖的盐酸四环素，用于骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的研究，通过检测碱性磷酸酶、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白等成骨标志物的活性，来探讨盐酸四环素对骨髓间充质干细胞的成骨诱导分化能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞检测对比观察实验。

1.2 时间及地点 于2015年3月至12月在西南交通大学材料先进技术教育部重点实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 SD大鼠，健康3-7 d龄，体质量20-30 g，雌雄不限，四川大学动物中心提供。

1.3.2 试剂 盐酸四环素(美国Sigma)；胰蛋白酶(美国Gibco)；兔抗大鼠Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)(武汉博士德生物科技有限公司)；兔抗大鼠骨钙素(BPG)单克隆抗体(武汉博士德生物科技有限公司)；碱性磷酸酶(ALP)试剂盒(南京生物建成物工程研究所)；SP免疫组织化学试剂盒(北京中杉公司)；DAB显色剂(北京中杉公司)；RT-PCR试剂盒(大连宝生物工程公司)；细胞总RNA提取试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)；大鼠骨钙素和Ⅰ型胶原蛋白基因的引物参照文献[7]，并与美国生物技术信息中心Gene Bank公布的cDNA完整的序列核对无误，骨钙素和Ⅰ型胶原蛋白基因序列引物由捷倍思基因技术有限公司合成。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的原代培养、传代和鉴定 ①采用骨髓全血细胞贴壁法获取原代骨髓间充质干细胞，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂饱和湿度细胞培养箱中进行培养；②间隔3 d换液1次；③待细胞融合至80%-90%后，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，并按1∶2比列进行传代培养；④流式仪检测骨髓间充质干细胞表面标志物CD34、CD45、CD90、CD29鉴定细胞。

1.4.2 实验分组 将实验分为对照组(用含体积分数10%FBS的L-DMEM的完全培养基培养)和盐酸四环素诱导组(用含体积分数10%FBS和10 mg/L盐酸四环素的L-DMEM培养液培养)，并进行如下实验。

1.4.3 碱性磷酸酶活性测定 ①取生长良好的P3代骨髓间充质干细胞按实验分组要求用对应的培养液分别培养后于第3，6，9，12，15天分别收集两组细胞；②制成细胞浓度为1×10⁹ L^-¹的细胞悬液，以1.2×10³ r/min离心5 min；弃上清，加入600 μL 0.1% Triton X-100细胞裂解液，4 ℃冰箱中放置12 h，吸管反复吹打裂解液，倒置相差显微镜下观察细胞结构全部破坏后按碱性磷酸酶试剂盒说明书测定碱性磷酸酶活性。实验重复3次。

1.4.4 Ⅰ型胶原蛋白组织化学染色 ①取生长良好的P3代骨髓间充质干细胞消化收集并制成细胞悬液，按2×10⁴•cm^-²/孔细胞分别接种于置有血盖片的6 孔培养板中，加入实验分组的培养液分别培养；②每隔3 d全量换液1次，7 d取出两组细胞爬片；③PBS洗5 min，共3次，冷丙酮固定1 h，自然晾干，甲醇与体积分数30%H₂O₂以体积比50∶1闭光封闭20 min；④PBS冲洗2次，每次5 min，加入羊血清于37 ℃封闭30 min；⑤加入兔抗大鼠Ⅰ型胶原一抗(Col I)，37 ℃孵育2 h。PBS冲洗2次，5 min/次；⑥加入生物素二抗，37 ℃孵育40 min。弃多余液体，PBS浸洗2次，5 min/次；⑦加辣根过氧化酶亲和素于37 ℃孵育30 min，PBS浸洗(5 min×2次)；⑧DAB 显色，镜下控制显色时间，自来水终止显色；⑨苏木精复染，常规分色，促蓝，脱水，透明封固；⑩显微镜下观察Ⅰ型胶原抗原的表达情况。

1.4.5 骨钙素免疫组织化学染色 方法同Ⅰ型胶原蛋白组织化学染色，诱导时间为10 d。

1.4.6 茜素红矿化钙结节组织化学染色 ①选取P3代骨髓间充质干细胞，制成单细胞悬液，计数后，以1×10⁵/孔的细胞密度接种于6孔板上；②对照组用含体积分数10%FBS的L-DMEM完全培养基进行培养；③盐酸四环素组用含10%FBS和10 mg/L盐酸四环素的L-DMEM培养液进行诱导培养，每隔3 d全量换液1次；④21 d行茜素红染色，观察结果。

1.4.7 Ⅰ型胶原蛋白和骨钙素的RT-PCR鉴定 ①分别从盐酸四环素诱导组和对照组中取培养21 d的细胞，PBS冲洗；②用细胞总RNA提取试剂盒提取各组细胞总mRNA，RT-PCR试剂盒进行RT-PCR反应；③PCR循环条件为94 ℃、30 s，56 ℃、45 s，72 ℃、90 s，共35个循环。④骨钙素基因序列：上游5’-AGC GAC TCT GAG TCT GAC AAA-3’，下游5’-AAC GGT GGT GCC ATA GAT GCG-3’，大小221 bp。Ⅰ型胶原蛋白基因序列：上游5’- TCC TGC CGA TGT CGC TAT -3’，下游5’-AGA TTG GGA TGG AGG GAG TT-3’，大小382 bp。内参大鼠β-actin基因引物：上游5’-CAC CAC ACC TTC TAC AAT GAG C-3’，下游5’-GTG ATC TCC TTC TGC ATC CTG T-3’，大小692 bp。

1.5 主要观察指标 ①骨髓间充质干细胞的分离培养及表面标记物检测结果；②碱性磷酸酶活性检测结果；③Ⅰ型胶原蛋白免疫组织化学染色结果；④骨钙素免疫组织化学染色结果；⑤茜素红矿化钙结节组织化学染色结果；⑥Ⅰ型胶原蛋白和骨钙素的RT-PCR鉴定结果。

1.6 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析和t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

骨髓间充质干细胞由Friendenstein等人在1976年发现并命名为骨髓间充质干细胞。其易于从骨髓中分离培养，增殖和分化能力强大，免疫原性低，被认为是最有再生潜力的种子细胞，非常适用于科学和临床研究^[15]。实验证明，骨髓间充质干细胞具有组织特异性，当机体某部位出现损伤或疾病时，骨髓间充质干细胞能够趋集于受伤部位，分化为相应组织修复所需要的细胞，促进愈合。有学者研究并证实了骨髓间充质干细胞的成骨特性可以用于治疗骨质疏松和促进骨折愈合^[16]。

细胞表面分子是多种细胞分化和定型的标志。已有研究表明，骨髓间充质干细胞表面表达CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CDl24等，而不表达CD14、CD31、CD34、CD45等细胞表面抗原，大多数研究者通过骨髓间充质干细胞表达CD44、CD90和CD29等抗原，不表达CD14、CD34及CD45等抗原标志，对骨髓间充质干细胞进行初步鉴定^[17-18]。实验用流式细胞仪选择测定细胞表面抗原结果显示：CD34和CD45表达阴性，CD29和CD90表达阳性，说明所培养的细胞是骨髓间充质干细胞。

碱性磷酸酶活性是成骨细胞分化成熟的早期标志物和成骨细胞功能的重要指标之一，在体内钙化过程中起关键性作用。碱性磷酸酶的活性可以间接反映出成骨细胞的成熟状况、活性和功能^[19]。一般碱性磷酸酶活性越高，表明骨髓间充质干细胞向成骨细胞功能分化的程度越高^[20]。碱性磷酸酶活性实验结果表明：随着骨髓间充质干细胞培养时间(6，9，12，15 d)的延长，盐酸四环素诱导组与对照组的碱性磷酸酶活性均逐渐增强；在相同时间点，诱导组碱性磷酸酶活性明显高于对照组，且有显著性差异。这说明盐酸四环素促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的能力程度更强，加强基质和骨矿化的能力也更强。

成骨细胞主要功能是合成和分泌有机类骨基质，调节骨质矿化(主要由Ⅰ型胶原构成)。Ⅰ型胶原是骨组织中成骨细胞合成分泌的细胞外基质蛋白，Ⅰ型胶原蛋白的分泌可作为成骨细胞成熟后功能活动的标志性产物^[21]。同时，Ⅰ型胶原蛋白可作为骨黏附分子和骨特异性生长因子的良好载体，其与基质材料复合构建的支架材料有良好的促进新骨组织形成的能力^[22]，在体外培养条件下，四环素能够提高骨中Ⅰ型胶原蛋白的表达水平^[23]。

骨钙素(BGP/OCN)又称C-羧基谷氨酸蛋白，是成骨细胞合成、分泌的主要非胶原蛋白，参与钙代谢的调节，主要的生理功能是维持骨的正常矿化速率、抑制异常的羟基磷灰石结晶的形成。是成骨细胞合成和分泌的特异性产物，和Ⅰ型胶原蛋白一样，为成骨细胞分化成熟的标志，反映成骨细胞的成骨功能^[24-26]。Ⅰ型胶原蛋白和骨钙素免疫组织化学染色实验结果显示，盐酸四环素诱导组培养的骨髓间充质干细胞表达Ⅰ型胶原蛋白、骨钙素，对照组不表达，说明了盐酸四环素培养的骨髓间充质干细胞具有成骨细胞的特性，骨髓间充质干细胞在盐酸四环素的作用下，向成骨细胞分化。

矿化结节的形成经历胶原的沉积和基质的矿化两个步骤，是成骨细胞分化的最后阶段。矿化结节的形成是成骨细胞体外成骨的早期标志^[27]。骨髓间充质干细胞用盐酸四环素诱导培养16 d可见细胞堆积并逐渐形成结节，为了得到稳定的钙结节，作者在21 d对细胞爬片行钙结节茜素红染色，可见盐酸四环素诱导组培养的骨髓间充质干细胞呈现大小、形态不一的红色阳性结节，对照组无钙结节出现。

碱性磷酸酶活性测定、Ⅰ型胶原蛋白和骨钙素免疫组织化学染色、钙结节茜素红化学染色，盐酸四环素诱导组出现的阳性结果，可以初步确认盐酸四环素诱导骨髓间充质干细胞21 d后骨髓间充质干细胞已经分化为成骨样细胞，具有成骨细胞的特性。

为了进一步验证盐酸四环素对骨髓间充质干细胞的成骨诱导分化作用，采用RT-PCR检测盐酸四环素诱导骨髓间充质干细胞前后细胞内Ⅰ型胶原蛋白和骨钙素的mRNA表达情况。结果发现：盐酸四环素诱导组的骨髓间充质干细胞表达Ⅰ型胶原蛋白和骨钙素的mRNA，对照组骨髓间充质干细胞不表达。再次说明盐酸四环素诱导后的骨髓间充质干细胞已具有成骨细胞特征，已向成骨细胞转化。

本研究发现，盐酸四环素能持续促进间充质干细胞的碱性磷酸酶活性增加，而碱性磷酸酶被认为是细胞外基质成熟的早期标志，碱性磷酸酶能使局部磷酸含量增高，促使基质矿化。这说明盐酸四环素可能是通过促进间充质干细胞源性的成骨细胞分泌的细胞外基质成熟，且持续促使基质矿化来诱导间充质干细胞骨向分化的。并且分子生物学实验表明，盐酸四环素诱导组Ⅰ型胶原蛋白和骨钙素阳性表达，这两个基因分别是成骨细胞增殖期和分化期的特征性表达基因，这就提示，盐酸四环素也可能同时通过骨髓间充质干细胞骨向分化阶段的细胞增殖和细胞分化来调控细胞的生物学行为。

结论：研究证实盐酸四环素具有诱导骨髓来源间充质干细胞向成骨细胞分化的能力。该结果验证了盐酸四环素对骨系细胞的亲和性和靶向性。并为深入研究骨系细胞成骨分化的机制提供了新途径。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

盐酸四环素对大鼠骨髓间充质干细胞的成骨诱导分化活性

Tetracycline hydrochloride induces the osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 1

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	王景, 熊山, 曹金, 冯林伟, 王信. 白细胞介素3在骨代谢中的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1260-1265.
[2]	肖豪, 刘静, 周君. 脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1266-1271.
[3]	安维政, 何萧, 任帅, 刘建宇. 肌源干细胞在周围神经再生中的潜力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1130-1136.
[4]	范一鸣, 刘方煜, 张洪宇, 李帅, 王岩松. 脊髓损伤后室管膜区内源性神经干细胞反应的系列问题[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1137-1142.
[5]	田川, 朱向情, 杨再玲, 鄢东海, 李晔, 王严影, 杨育坤, 何洁, 吕冠柯, 蔡学敏, 舒丽萍, 何志旭, 潘兴华. 骨髓间充质干细胞调控猕猴卵巢的衰老[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 985-991.
[6]	胡伟, 谢兴奇, 屠冠军. 骨髓间充质干细胞来源外泌体改善脊髓损伤后血脊髓屏障的完整性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 992-998.
[7]	惠小珊, 白京, 周思远, 王阶, 张金生, 何庆勇, 孟培培. 中医药调控干细胞诱导分化的理论机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1125-1129.
[8]	侯婧瑛, 郭天柱, 于萌蕾, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理通过激活MALAT1靶向抑制miR-195促进骨髓间充质干细胞的生存和血管形成[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1005-1011.
[9]	周颖, 张幻, 廖松, 胡凡琦, 易静, 刘玉斌, 靳继德. 去铁胺联合干扰素γ预处理对人牙髓干细胞的免疫调节作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1012-1019.
[10]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
[11]	王继芳, 鲍祯, 乔亚红. miR-206调控小细胞肺癌干细胞EVI1基因表达及细胞生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1027-1031.
[12]	刘峰, 彭宇环, 罗良平, 吴本清. 植物源性碱性成纤维细胞生长因子维持人胚胎干细胞的生长与分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1032-1037.
[13]	闻丹丹, 李强, 沈才齐, 纪哲, 金培生. 外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架提高脂肪间充质干细胞活性修复糖尿病创面[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1038-1044.
[14]	朱兵兵, 邓江华, 陈晶晶, 慕晓玲. 白细胞介素8受体可提高脐带间充质干细胞迁移和向损伤内皮的黏附[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1045-1050.
[15]	罗小玲, 张丽, 杨茂桦, 徐洁, 徐晓梅. 柚皮素干预人牙周膜干细胞的成骨分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1051-1056.