LncRNA-Braveheart促进骨髓间充质干细胞在体外向心肌样细胞分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.29.001

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (29): 4593-4599.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.29.001

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LncRNA-Braveheart促进骨髓间充质干细胞在体外向心肌样细胞分化

侯婧瑛，龙会宝，周长青，吴浩，郭天柱，钟婷婷，伍权华，汪蕾，郑韶欣，王彤

中山大学孙逸仙纪念医院急诊科，广东省广州市 510120

修回日期:2017-04-25 出版日期:2017-10-18 发布日期:2017-11-08
通讯作者: 王彤，博士，博士生导师，教授，主任医师，研究员，中山大学孙逸仙纪念医院急诊科，广东省广州市 510120
作者简介:侯婧瑛，女，1985年生，安徽省庐江县人，汉族，2012年中山大学孙逸仙纪念医院毕业，硕士，主治医师，主要从事干细胞与心血管疾病方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81070125)；国家自然科学基金(81270213)；国家自然科学基金(81670306)；广东省科技计划项目(2014A020211002)；广东省科技计划项目(2010B031600032)；高校基本科研业务费中山大学青年教师重点培育项目(13ykzd16)；广东省医学科研基金(A2016264)

LncRNA-Braveheart promotes the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in vitro into cardiomyocyte-like cells

Hou Jing-ying, Long Hui-bao, Zhou Chang-qing, Wu Hao, Guo Tian-zhu, Zhong Ting-ting, Wu Quan-hua, Wang Lei, Zheng Shao-xin, Wang Tong

Department of Emergency, Sun Yat-Sen Memorial Hospital of Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China

Revised:2017-04-25 Online:2017-10-18 Published:2017-11-08
Contact: Wang Tong, M.D., Doctoral supervisor, Professor, Chief physician, Researcher, Department of Emergency, Sun Yat-Sen Memorial Hospital of Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China
About author:Hou Jing-ying, Master, Attending physician, Department of Emergency, Sun Yat-Sen Memorial Hospital of Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81070125, 81270213, 81670306; the Science and Technology Plan Projects of Guangdong Province, No. 2014A020211002, 2010B031600032; Fundamental Research Fund for Universities-Young Teacher Training Project of Sun Yat-Sen University, No. 13ykzd16; the Medical Research Fund of Guangdong Province, No. A2016264

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)：是一类转录本长度超过200个核苷酸的功能性RNA分子，其能够从不同层面实现对基因表达的调节。lncRNAs被证实在心脏发育和心血管疾病的病理生理过程中扮演重要角色，其参与了心脏稳态的维持和再生。lncRNA在干细胞的自我更新及谱系分化中具有明确的调控作用，现阶段一些与心脏谱系特异性密切相关的lncRNAs已相继被报道。
lncRNA-Bvht：是Klattenhoff 等在小鼠胚胎向心脏发育过程中发现的一种新型 lncRNA分子，它在胚胎时期的心血管谱系定向分化中发挥着重要的调控作用。lncRNA-Bvht能够通过上调心脏转录因子及心肌细胞分化相关基因的表达而促进心血管祖细胞向心肌细胞分化。

摘要
背景：课题组前期研究发现骨髓间充质干细胞移植能够改善大鼠心肌梗死后心功能，但整体效果并不太理想，骨髓间充质干细胞在体内局部梗死微环境中的分化效率低下，其向心肌细胞分化的能力极其有限。
目的：采用lncRNA-Bvht体外转染骨髓间充质干细胞，观察其对骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响。
方法：构建含lncRNA-Bvht的病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1-lncRNA-Bvht，对骨髓间充质干细胞进行lncRNA-Bvht转染并检测转染效率。分离培养C57BL/6小鼠的骨髓间充质干细胞，并将第3代细胞分为3组：骨髓间充质干细胞组、空载体组和lncRNA-Bvht组。各组细胞培养48 h后用5-氮杂胞苷进行诱导分化24 h再进行正常培养2周，荧光显微镜观察骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化情况，免疫荧光染色、Western blot、qRT-PCR检测心肌分化标记物肌钙蛋白T和肌节蛋白的表达。
结果与结论：①诱导分化后细胞形态发生改变，细胞之间形成连接，排列方向趋于一致；②免疫荧光检测结果显示lncRNA-Bvht组肌钙蛋白T和肌节蛋白表达呈现强阳性；肌钙蛋白T阳性细胞的比例显著增加；③qRT-PCR和Western blot检测结果显示lncRNA-Bvht组肌钙蛋白T和肌节蛋白的表达较空载体组和骨髓间充质干细胞组均明显升高(P < 0.01)；④结果提示，lncRNA-Bvht转染能够有效促进骨髓间充质干细胞在体外向心肌样细胞发生分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-0492-2216(侯婧瑛)

关键词: 干细胞, 骨髓间充质干细胞, 长链非编码RNA-Braveheart, 心肌样细胞, 心肌梗死, ；国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Our previous work demonstrated that bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) transplantation could improve cardiac function in rats with myocardial infarction. However, the overall efficacy was unsatisfactory, and there was a low efficiency of BMSCs differentiating into cardiomyocytes in the local infarct myocardium.
OBJECTIVE: To transfect long non-coding RNA-Braveheart (lncRNA-Bvht) into BMSCs in order to observe whether it could promote cardiomyocyte differentiation of BMSCs in vitro.
METHODS: pLVX-IRES-ZsGreen1-lncRNA-Bvht vector was constructed and applied to transfect lncRNA-Bvht into bMSCs, and then, the transfection efficiency was detected. BMSCs were obtained from C57BL/6 mice and cultured in vitro. Passage 3 cells were divided into three groups: BMSCs group, null vector group and lncRNA-Bvht group. All cells in the three groups were cultured in the normal condition for 48 hours and cardiomyocytes differentiation was induced by 5-azacytidine for another 24 hours followed by 2-week culture under normal conditions. Cardiomyocyte differentiation of BMSCs was observed under fluorescence microscopy and expression of cardiac specific cell markers including troponin T and myosin were examined using immunofluorescent staining, western blot assay, and qRT-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Cell morphological changes could be observed in all the groups 2 weeks after the induction. Interconnected cells arranged consistently in all the three groups. Immunofluorescent staining results showed that the expression of troponin T and myosin was notably positive, and the proportion of troponin T positive cells was significantly increased. qRT-PCR and western blot assay results indicated that there were significantly increased levels of troponin T and myosin in the lncRNA-Bvht group as compared with the BMSCs and null vector groups (P < 0.01), suggesting that lncRNA-Bvht could efficiently promote cardiomyocyte differentiation of BMSCs in vitro.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Myocardial Infarction, Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Myocytes, Cardiac, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

侯婧瑛，龙会宝，周长青，吴浩，郭天柱，钟婷婷，伍权华，汪蕾，郑韶欣，王彤. LncRNA-Braveheart促进骨髓间充质干细胞在体外向心肌样细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(29): 4593-4599.

Hou Jing-ying, Long Hui-bao, Zhou Chang-qing, Wu Hao, Guo Tian-zhu, Zhong Ting-ting, Wu Quan-hua, Wang Lei, Zheng Shao-xin, Wang Tong. LncRNA-Braveheart promotes the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in vitro into cardiomyocyte-like cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(29): 4593-4599.

图/表（结果） 2

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引言

急性心肌梗死及伴随其而来的心力衰竭，是严重威胁人类健康的心血管疾病之一^[1]。目前已有多种综合防治措施用于针对心肌梗死后心力衰竭的治疗，尽管如此，均未能够从根本上解决心肌细胞的缺失问题。近年来，干细胞移植已逐渐成为心血管疾病治疗中的研究热点。基础研究和临床试验均已证实干细胞移植治疗能够实现心肌和血管再生，缩小梗死面积及改善心功能，从而为受损心脏的细胞重建及衰竭心脏的功能修复提供一种全新的可供选择的治疗方案^[2]。

骨髓间充质干细胞因来源广泛、易于取材和扩增、具有较强的自我更新能力和多向分化潜能、免疫原性低、易进行基因修饰、能够向心血管细胞分化、且不涉及伦理问题等优势，已成为细胞移植治疗心血管疾病的理想种子细胞^[3]。课题组的前期研究及他人的研究均证实骨髓间充质干细胞移植能够改善心肌梗死后心力衰竭^[4-5]。然而，骨髓间充质干细胞移植的疗效仍不够理想，其中一个重要的因素就是骨髓间充质干细胞在体内局部梗死微环境中的分化效率低下，其向心肌细胞分化的能力极其有限。因此，寻找促进骨髓间充质干细胞向心肌细胞高效分化的方法并探索其向心肌细胞定向分化的相关机制，对于提高其移植治疗心肌梗死后心力衰竭的疗效意义重大。

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类转录本长度超过200个核苷酸的功能性RNA分子，研究发现lncRNA能够从不同层面实现对基因表达的调节^[6]。lncRNA已被证实在干细胞的自我更新及谱系分化中具有明确的调控作用。现阶段一些与心脏谱系特异性密切相关的lncRNA已被报道。采用高通量技术对处于分化阶段的人心脏祖细胞中差异表达的lncRNA分子进行筛选，结果显示上百种lncRNA能够作为竞争性内源性RNA(competitive endogenous RNAs，ceRNA)调节心脏谱系特异性和分化^[7]。增强子衍生而来的lncRNA (enhancer-derived lncRNAs，edRNA)在小鼠的心脏前体细胞及人的心脏祖细胞中表达^[8-10]，并在心脏谱系特异性和分化中发挥调控功能^[11]。长链非编码RNA-Braveheart (lncRNA-Bvht)是Klattenhoff等在小鼠胚胎向心脏发育过程中发现的一种新型lncRNA分子，它在胚胎时期的心血管谱系定向分化中发挥着重要的调控作用^[12]。lncRNA-Bvht能够通过上调心脏转录因子及心肌细胞分化相关基因的表达而促进心血管祖细胞向心肌细胞分化^[12]。lncRNA-Bvht在心血管再生医学中的相关研究仍然甚少，最近有研究表明lncRNA-Bvht能够以明确的RNA模式与细胞核酸结合蛋白相互作用进而调节胚胎干细胞的心血管谱系分化^[13]。目前有关lncRNA-Bvht的研究所涉及对象均为胚胎干细胞，而lncRNA-Bvht在成体干细胞心血管谱系分化中作用如何值得进一步探索。

实验以调控胚胎心血管谱系定向分化的lncRNA-Bvht作为研究对象，体外探讨lncRNA-Bvht对骨髓间充质干细胞向心肌样细胞发生分化的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 于2015年8月至2016年3月在中山大学孙逸仙纪念医院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 SPF级雄性C57BL/6小鼠10只，3周龄，体质量10 g，由中山大学实验动物中心提供，许可证号SCXK(粤) 2014-0011，用于骨髓间充质干细胞分离、培养、鉴定、转染和分化。

1.3.2 主要仪器及试剂 超净工作台、恒温CO₂培养箱、酶标仪(multiscan MK3)(Thermo，美国)；台式常温高速离心机、微量移液器(Eppendorff，德国)；电热恒温水槽(上海深信实验仪器有限公司)；高温灭菌器(樱花牌NSS-20，日本)；倒置荧光显微镜(Leica，德国)；定量PCR用SYBR、定量PCR仪ABI PRISM®7500(Invitrogen，美国)；紫外分光光度计(HP，美国)；巴氏吸管(美国JET BIOFIL公司)；普通培养箱(HERACELL150i)(美国Thermo Scientific公司)；胎牛血清、DMEM培养基、双抗、胰蛋白酶、PBS(Hyclone公司)；cTnT兔多克隆抗体、α-SA兔多克隆抗体(Abcam，英国)；一抗及二抗稀释液(Millipore，美国)；辣根过氧化物酶连接的二抗(Southern Biotech，美国)；发光液(北京中杉金桥生物技术有限公司)；苯巴比妥钠、PKH26、BCA法蛋白含量检测试剂盒(Abcam，英国)；TRIZOL RNA 提取试剂盒(Santa Cruz，美国)；5-氮杂胞苷(Sigma，美国)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定 课题组已形成成熟的培养方法^[3-4^，^14-15]，采用全骨髓法分离培养。培养出的骨髓间充质干细胞采用流式细胞仪进行鉴定，表现为CD44阳性，CD29阳性，CD34阴性^[14-15]，选取第3代骨髓间充质干细胞用于后续转染以及分化等实验研究。

1.4.2 载体构建 lncRNA-Bvht扩增引物序列由苏州金唯智公司合成，lncRNA-Bvht引物序列： F：5’-ccg CTC GAG GAT CTC TGC CCC TCA GAG TCC-3’(XhoⅠ限制性酶切位点)，pre-lncRNA-Bvht引物序列： R：5’-cgc GGA TCC AAC ATT TAT TTT TAA AGT TTA-3’(BamHⅠ限制性酶切位点)，PCR扩增后进行产物回收，再进行载体双酶切，将酶切回收的PCR产物与pLVX-IRES-ZsGreen1载体进行连接。将5 µL连接产物分别加入至50 µL DH5α感受态细胞中，轻轻旋转混匀，冰浴30 min。42 ℃水浴热休克90 s。快速将管转移至冰浴中，冰浴2 min。加入200 µL LB培养基，混匀，37 ℃、200 r/min振荡培养1 h。于超净工作台中，将菌液均匀涂布于含氨苄青霉素(100 mg/L)的LB平板上，室温下放置，至液体吸收。倒置平板，转移入37 ℃生化培养箱过夜培养。从平板上挑取若干单克隆于3 mL LB管中摇床过夜培养；质粒提取并酶切鉴定所提取质粒。酶切产物以含溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶电泳分离，UVP凝胶成像系统成像，测序结果进行Blast比对确认lncRNA-Bvht已成功克隆至pLVX-IRES-ZsGreen1载体中。

1.4.3 lncRNA-Bvht转染 按Invitrogen公司Lipofectamine 2000使用说明进行转染。转染前2 h，将细胞培养基更换为无双抗完全培养基，每皿7 mL。将40 μL Lipofectamine 2000和1.46 mL OptiMEM培养基加入到15 mL离心管中轻轻温和混匀，在另一1.5 mL EP管中加入OptiMEM培养基，重组质粒24 μg (pLVX-IRES-ZsGreen1 lncRNA Bvht)加入到1.5 mL OptiMEM培养基中，两管各静置5 min。将后者DNA沉淀液缓缓地逐滴加入到前管，轻轻混匀室温静置20 min，将沉淀混合物逐滴均匀加入到10 cm细胞培养皿中，轻轻晃动，放入37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中培养，转染后8 h更换为完全培养基。

1.4.4 骨髓间充质干细胞的诱导分化 取骨髓间充质干细胞组(即单纯的骨髓间充质干细胞空白对照)、空载体组和lncRNA-Bvht组细胞，均以10⁴-10⁵个/孔细胞密度接种于6孔培养板，置于正常条件下培养，24 h后用5-氮杂胞苷(10 μmol/L)进行诱导分化，每孔加入含10 μmol/L 5-氮杂胞苷的诱导培养液20 μL，然后继续按正常培养条件培养2周，荧光显微镜观察骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化情况。

1.4.5 免疫荧光染色 细胞室温处于半干状态后，40 g/L多聚甲醛固定15 min；抗原修复以充分暴露抗原，提高抗原的检测率；滴加体积分数为10%正常山羊血清室温下封闭30 min，用于吸附组织中的非特异性位点，以免造成后续结果的假阳性。滴加一抗(cTnT 1∶100；α-SA 1∶100)4 ℃孵育过夜；PBS洗涤3次，每次5 min；滴加荧光标记二抗(1∶1 000)室温湿盒避光孵育1 h；PBS洗涤3次，每次5 min；DAPI染色，室温下湿盒避光孵育5 min；PBS洗1次，5 min；滴加抗荧光淬灭剂封固；荧光显微镜下观察表达情况并拍照。

1.4.6 Western blot检测 按1 mL裂解液加10 μL PMSF(100 mmol/L)和10 μL Cocktail，摇匀置于冰上，每管细胞加100 μL含PMSF和Cocktail的裂解液，于冰上裂解30 min，裂解后4 ℃下14 000 r/min离心10 min，取上清组织中总蛋白。采用BCA法测定各样品蛋白浓度，常规SDS-PAGE电泳及蛋白电转，转膜后的PVDF膜，用5%脱脂奶粉溶液室温封闭1 h或4 ℃过夜；TBST洗膜5 min，3次；滴加相应的一抗(cTnT 1∶1 000；α-SA 1∶1 000)稀释液4 ℃过夜或37 ℃孵育2 h；TBST洗膜5 min，3次；滴加相应二抗即辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG (H+L)(1∶20 000)稀释液37 ℃孵育1 h；TBST洗膜5 min，3次；蒸馏水漂洗膜2 min，弃去液体，共洗3次；将总体积为0.125 mL/cm²膜面积的发光液均匀加到膜的表面，室温孵育5 min，小心吸去膜表面多余的发光液，放至暗盒后显影。

1.4.7 qRT-PCR检测 收集细胞，加入1 mL Trizol溶液提取总 RNA。使用核酸蛋白分析仪和1.6%琼脂糖电泳对所提取的总RNA进行分析。取总RNA液8 μL，70 ℃水浴5 min，加入反转录反应液17 μL，42 ℃孵育60 min后终止反应，留取产物待用。qRT-PCR扩增参数：95 ℃ 10 min (1个循环)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s(40个循环)；72 ℃延伸10 min。反应结束后，由软件自动计算出定量结果，具体引物设计见表1。

1.5 主要观察指标 lncRNA-Bvht转染后骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化情况和心肌分化标记物的表达。

1.6 统计学分析 统计学处理由独立的与实验无关的统计人员实施。数据用x(_)±s表示，采用SPSS 13.0 for windows软件处理，3组间的样本比较采用单因素方差分析，组间比较采用双尾Bonferroni检验，检验水准a=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

骨髓间充质干细胞是一组来源于骨髓并具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，其所具有的心血管再生潜能为心血管疾病的治疗带来了广阔的应用前景^[3-4]。目前他人的研究及课题组的前期研究均证实了骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死和心力衰竭后能够通过缩小梗死面积，减缓心室重构及心肌纤维化等改善心功能和预后^[4-5]。然而，现阶段骨髓间充质干细胞移植的效果并不令人满意，其中一个重要因素便是其在局部缺血缺氧心肌微环境中的生存及分化效率低下，实际由骨髓间充质干细胞分化而成的心肌细胞数量较少，导致其修复缺血坏死心肌的能力极其有限。目前在体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的比例仍然较低^[16]，这也是影响骨髓间充质干细胞移植疗效的因素之一。现已有一些方法用于提高骨髓间充质干细胞心肌分化效率^[16-17]，但大多数方法诱导分化的效率低下。因此，如何促进骨髓间充质干细胞向心肌细胞的高效定向分化成为了一个迫切需要解决的关键问题。

lncRNA是一类转录本长度超过200个核苷酸单位的功能性RNA分子，它们缺乏编码蛋白的能力，位于细胞核或胞质内，可以在表观遗传水平、转录水平和转录后水平调控基因的表达，广泛参与机体的生理和病理过程^[18]。目前针对lncRNA与干细胞关系的研究正不断深入。现已发现lncRNA参与了干细胞多能性的维持并调控其谱系分化过程^[18-19]。研究表明lncRNA在胚胎干细胞的种系特异性分化中发挥了重要调节作用。lncRNA-H19在胚胎发育过程中表达，能够通过覆盖多能干细胞转录调控因子Oct3/4促进胚胎干细胞向滋养层细胞分化^[20]；lncRNA-H19还通过产生miR-675-3p和miR-675-5p调控骨骼肌的分化和再生^[21]。lncRNA-ROR在诱导性多能干细胞中显著高表达，并受到多能性转录因子的直接调控，其能够促进诱导性多能干细胞的自我更新和分化^[22]。研究发现lncRNA-malat1促进成肌细胞向肌管分化^[23]。

现已有研究表明lncRNA在骨髓间充质干细胞的谱系分化中亦发挥着同样关键的调节作用。有报道多种lncRNA在骨髓间充质干细胞向成骨分化的过程中呈现出差异性表达^[24]，然而对于lncRNA在骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化中的调控作用如何目前仍尚未见相关研究报道。现有证据表明lncRNA在干细胞向心肌分化中扮演着十分关键的角色。研究显示在胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中出现一系列与增强子相关的lncRNA表达上调，这些lncRNA的敲除会导致特异性靶基因表达下调；功能学研究提示在心脏祖细胞中发现的增强子相关lncRNA不仅与心脏发生和心肌蛋白表达相关，也与心肌不良重构有关^[25]。现已发现了一些与干细胞心肌分化密切相关的lncRNA，如lncRNA-H19的表达下调能够促使孤雌生殖的胚胎干细胞向搏动的心肌细胞分化的比例显著增加^[26]，具体机制尚未明确，可能与其衍生的miR-675作用于中胚层特定基因如MyoD，Myf6和Mier2相关^[26]。超级增强子相关的lncRNA-CARMEN是成体心脏的心脏前体细胞发生心肌分化的一个重要调节子，其通过作用于多梳抑制复合物2(polycomb repressive complex 2，PRC2)的成分SUZ12和EZH2发生作用，参与调节心脏前体细胞分化和心脏稳态^[27]。由上可见，lncRNA在干细胞向心肌分化中具有重要调控作用。目前lncRNA还被证实与心脏发育和心血管疾病的病理生理进程密切相关。最新的一项研究报道了3种新的lncRNA分子：TERMINATOR，ALIEN和PUNISHER，其分别表达于未分化的多能干细胞、心血管祖细胞及分化的血管内皮细胞，并且参与脊柱动物和人的心血管发育^[28]。一些与冠心病发生相关的lncRNA如MIAT、ANRIL以及MIRT1和MIRT2^[29-30]，以及与扩张性心肌病相关的lncRNA如SRA等也已经相继被发现^[30]。通过以上研究可见，lncRNA与干细胞谱系分化(其中包括向心肌分化)、心脏发育和病理性重构等过程均存在密切联系。

lncRNA-Braveheart (lncRNA-Bvht，AK143260)是在小鼠的胚胎向心脏发育过程中发现的一种新型lncRNA分子，它在胚胎时期的心脏发育过程中起重要调控作用^[12]。lncRNA-Bvht不仅诱导胚胎干细胞向心血管谱系定向分化，还参与新生心室肌细胞心肌状态的维持。在lncRNA-Bvht敲除的情况下会出现胚胎干细胞分化中的心肌细胞搏动能力丧失及心脏关键转录因子失活。lncRNA-Bvht的主要作用机制包括作为上游分子上调心血管多能祖细胞分化的主要调控子中胚层后1同源物(mesoderm posterior 1 homolog，MESP1)，从而激活相关心血管基因网络以发挥作用；通过与PRC2的成分SUZ12相互作用调控表观遗传，进而参与心脏祖细胞向心肌细胞分化；通过调节上皮间质转化(epithelial- mesenchymal transition，EMT)过程中相关因子的表达进而调控心血管祖细胞向心肌细胞分化。在本研究中，通过体外对骨髓间充质干细胞转染lncRNA-Bvht并检测骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化情况，结果表明，骨髓间充质干细胞成功转染lncRNA-Bvht后，诱导分化出的细胞具有成熟的心肌细胞表型，心肌分化标记物cTnT和α-SA的表达显著增加，提示lncRNA-Bvht能够有效促进骨髓间充质干细胞在体外向心肌样细胞发生分化。

lncRNA在调控干细胞分化方面的研究目前仍处于起步阶段。实验在体外观察lncRNA-Bvht对骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响，结果表明lncRNA-Bvht转染能够显著促进骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的高效分化，下一步通过相关体内实验验证lncRNA-Bvht在局部梗死微环境中是否同样能够产生促心肌分化的作用。该研究为寻求诱导骨髓间充质干细胞高效分化的方案提供了新的思路，并为lncRNA在改进骨髓间充质干细胞移植治疗心血管疾病疗效中的应用奠定了一定的理论基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

LncRNA-Braveheart促进骨髓间充质干细胞在体外向心肌样细胞分化

LncRNA-Braveheart promotes the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in vitro into cardiomyocyte-like cells

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