NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3炎性小体在低氧诱导骨骼肌线粒体损伤中的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.28.014

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (28): 4512-4517.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.28.014

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NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3炎性小体在低氧诱导骨骼肌线粒体损伤中的作用

张子怡¹，薄海²，杨爽¹，袁瑶²，张勇¹

¹天津体育学院天津市运动生理学与运动医学重点实验室，天津市 300381；²武警后勤学院军事训练医学教研室，天津市 300309

修回日期:2017-08-07 出版日期:2017-10-08 发布日期:2017-11-10
通讯作者: 张勇，博士，教授，天津体育学院天津市运动生理学与运动医学重点实验室，天津市 300381
作者简介:张子怡，女，1984年生，天津市人，汉族，天津体育学院在读博士，实验师，主要从事运动氧化应激研究。
基金资助:
国家自然科学基金(31571224，81370454，31110103919)；天津市自然科学基金(14JCZDJC36600)；武警后勤学院研究基金(WHB201507)

Role of NOD-like receptor family, pyrin domain containing 3 inflammasome in the hypoxia-induced skeletal muscle mitochondrial dysfunction

Zhang Zi-yi¹, Bo Hai², Yang Shuang¹, Yuan Yao², Zhang Yong¹

¹Tianjin Key Laboratory of Exercise Physiology & Sports Medicine, Tianjin University of Sport, Tianjin 300381, China; ²Department of Military Training Medicine, Logistics University of Chinese People's Armed Police Force, Tianjin 300162, China

Revised:2017-08-07 Online:2017-10-08 Published:2017-11-10
Contact: Zhang Yong, M.D., Professor, Tianjin Key Laboratory of Exercise Physiology & Sports Medicine, Tianjin University of Sport, Tianjin 300381, China
About author:Zhang Zi-yi, Studying for doctorate, Experimentalist, Tianjin Key Laboratory of Exercise Physiology & Sports Medicine, Tianjin University of Sport, Tianjin 300381, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31571224, 81370454, and 31110103919; the Natural Science Foundation of Tianjin, No. 14JCZDJC36600; the Science Foundation of Logistics University of Chinese PAPF, No. WHB201507

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
NLRP3炎性小体：是机体固有免疫系统的重要成员，由识别蛋白NOD样受体NLR、衔接蛋白ASC和效应蛋白caspase-1共同组成。识别蛋白NLR感知应激源后聚集为NLRP3寡聚体，通过ASC募集并激活caspase-1，活化的caspase-1切割炎症因子白细胞介素1β，使之成熟和释放，参与炎症反应。
线粒体：线粒体历来被誉为真核细胞的“动力站”，通过氧化磷酸化作用的能量偶联产生ATP，为机体提供90%以上的能量。此外，线粒体呼吸链产生的自由基占细胞中活性氧总量的95%。线粒体对调节细胞能量态、氧化还原态、信号转导等的调控具有重要作用，构成多种重要细胞信号转导通路的整合中心。

摘要
背景：NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor family, pyrin domain containing 3，NLRP3)炎性小体是否参与低氧对骨骼肌线粒体的损伤，及其相关机制尚不清楚。
目的：观察NLRP3炎性小体特异性阻断剂VX-765对慢性低氧大鼠骨骼肌线粒体功能的影响，以探讨NLRP3炎性小体在低氧诱导骨骼肌线粒体损伤中的作用。
方法：将30只SD大鼠随机分为常氧组、低氧组和低氧+VX-765组。低氧干预为低氧帐篷暴露，氧浓度设定为11.3%；VX-765干预为每日腹腔注射VX-765溶液1次，注射剂量为50 mg/kg，干预持续4周。
结果与结论：VX-765显著抑制低氧暴露大鼠骨骼肌NLRP3和凋亡相关斑点样蛋白表达，降低caspase-1活性及白细胞介素1β含量，上调过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α和细胞色素C氧化酶亚基Ⅳ表达，提高线粒体ATP合成活力和膜电位，抑制线粒体H₂O₂产生速率。结果表明，低氧可通过活化NLRP3炎性小体和损伤线粒体功能导致骨骼肌功能障碍，线粒体损伤产生大量活性氧，继而活化NLRP3炎性小体以促进白细胞介素1β等炎症因子的产生，而炎症因子可通过下调过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α进一步造成线粒体损伤, NLRP3炎性小体活化和线粒体损伤之间形成恶性循环。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-2781-9436(张勇)

关键词: 组织构建, 组织工程, 低氧, 骨骼肌, NLRP3炎性小体, 线粒体, 氧化应激, 过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Whether NOD-like receptor family, pyrin domain containing 3 (NLRP3) inflammasome is involved in hypoxia-induced skeletal muscle mitochondrial dysfunction, and the underlying mechanism remain unclear.
OBJECTIVE: To observe the effect of NLRP3 inflammasome inhibitor VX-765 on skeletal muscle mitochondrial function, and to explore the role of NLRP3 inflammasome in hypoxia-induced mitochondrial dysfunction.
METHODS: Thirty Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups: normoxia, hypoxia, and hypoxia plus VX-765 groups. The rats in the hypoxia group were subjected to hypoxia exposure in normobaric hypoxic tent with 11.3% O₂. The hypoxia plus VX-765 group rats were given the intraperitoneal injection of VX-765 (50 mg/kg) daily. All of the interventions lasted for 4 weeks.
RESULTS AND CONCLUSION: VX-765 in hypoxia markedly inhibited the expression of NLRP3 and apoptosis-associated speck-like protein, attenuated caspase-1 activity and interleukin-1β content, and suppressed mitochondrial H₂O₂ generation. In addition, VX-765 in hypoxia markedly enhanced the expression of mitochondrial peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1-α and cyclooxygenase IV, elevated mitochondrial membrane potent and ATP synthetase activity. These results indicate that hypoxia induces skeletal muscle dysfunction through activating NLRP3 inflammasome and impairing mitochondrial function. The hypoxia-induced mitochondrial dysfunction enhances reactive oxygen species generation and further triggers interleukin-1β production via the NLRP3 inflammasome activation. In turn, interleukin-1β further impairs mitochondrial function through suppresseing peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1α, resulting in a vicious circle between NLRP3 inflammasome activation and mitochondrial dysfunction.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Mitochondria, Aoxia, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

张子怡，薄海，杨爽，袁瑶，张勇. NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3炎性小体在低氧诱导骨骼肌线粒体损伤中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(28): 4512-4517.

Zhang Zi-yi, Bo Hai, Yang Shuang, Yuan Yao, Zhang Yong. Role of NOD-like receptor family, pyrin domain containing 3 inflammasome in the hypoxia-induced skeletal muscle mitochondrial dysfunction[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(28): 4512-4517.

图/表（结果） 2

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引言

低氧是高原病的主要致病因素，也是呼吸系统疾病、心血管系统疾病、血液系统疾病的重要病理生理表征，表现为细胞氧供应不足或氧利用不足^[1]。骨骼肌是机体主要的氧耗器官。研究表明，长期低氧暴露造成骨骼肌细胞物质代谢异常、蛋白降解途径过度活化、凋亡通路活化，导致肌纤维数量、体积和收缩力降低，严重影响机体劳动能力和生活质量^[2-3]。探讨骨骼肌低氧损伤的病理机制并针对性开发防护措施具有重要价值。

炎症反应是低氧损伤的重要病理机制之一^[4]。NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor family, pyrin domain containing 3，NLRP3)炎性小体是机体固有免疫系统的重要成员，由识别蛋白NOD样受体(NOD-like receptor，NLR)、衔接蛋白ASC和效应蛋白天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶1(Caspase-1)共同组成^[5]。识别蛋白NLR感知应激源后聚集为NLRP3寡聚体，通过凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis speck protein with CARD，ASC)募集并激活Caspase-1，活化的Caspase-1切割炎症因子白细胞介素1β，使之成熟和释放，参与炎症反应^[6]。NLRP3炎性小体活化可被微生物、毒素、缺血等多种应激源活化^[7]。研究表明，低氧状态下骨骼肌NLRP3炎性小体活性及其调控的白细胞介素1β含量明显升高^[8]。提示NLRP3炎性小体活化是机体应答低氧的重要环节。

小分子非肽类化合物VX-765可选择性拮抗NLRP3炎性小体中Caspase-1 活性，从而下调白细胞介素1β合成和分泌^[9]。作者拟利用在大鼠低氧暴露同时给予VX-765干预，以探讨NLRP3炎性小体活化在骨骼肌低氧损伤中的角色。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年3至6月在武警后勤学院天津市职业与环境危害生物标志物重点实验室完成。

1.3 材料

实验动物：健康雄性SPF级SD大鼠30只，体质量205-233 g，购于北京华阜康生物科技公司，动物许可证号：SCKK(京)2009-0002。实验中对大鼠的处理遵照2006年科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》^[10]。

主要试剂及仪器：荧光素酶，VX-765，二氯荧光素购自Sigma公司；过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α、细胞色素C氧化酶亚基Ⅳ(cytochrome c oxidase IV， COXⅣ)、NLRP3、ASC、β-actin抗体购自ABCOM公司；线粒体膜电位检测试剂盒，白细胞介素1β ELISA检测试剂盒购自碧云天生物技术公司；微量荧光酶标仪购自Bio-Tek公司；常压低氧帐篷购自Hypoxic system公司。

1.4 方法

1.4.1 实验分组及干预 动物随机分为3组：常氧组、低氧组和低氧+VX-765组，每组10只。

低氧组和低氧+VX-765组进行低氧暴露干预，将大鼠饲养于常压低氧帐篷，氧气浓度设置为11.3%，正常进食进水，光照12 h/d，持续4周。VX-765溶解于二甲基亚砜(DMSO)溶液中，低氧+VX-765组每日上午10：00腹腔注射VX-765溶液1次，注射剂量为50 mg/kg，注射体积为200 μL，持续4周。该注射方式被证明可显著降低癫痫模型大鼠大脑皮质及血清中白细胞介素1β含量^[11]。常氧组和低氧组每日同时间注射等体积DMSO溶液，持续4周。

1.4.2 组织标本制备 各组大鼠于末次注射24 h后断头处死，迅速分离双侧股四头肌，留取2 cm³大小肌肉组织于-80 ℃冻存，用于蛋白表达检测，其余肌肉组织参照本组前期工作，采用差速离心法纯化线粒体，考马斯亮蓝法测定样品蛋白浓度^[12]。

1.4.3 线粒体ATP合成活力测定 采用荧光素酶氧化发光法进行测定^[13]。反应体系为0.5 mL，包括0.5 mmol/L EDTA、10 mmol/L HEPES、5 mmol/L磷酸钾缓冲液、22.5 mmol/L MgCl₂、100 μL荧光素-荧光素酶、0.5 mol/L苹果酸、0.25 mol/L谷氨酸和50 μg线粒体。37 ℃水浴5 min后记录上述体系的荧光强度作为本底，分别加入2 μmol/L和4 μmol/L ADP启动线粒体ATP合成反应，计算荧光强度变化率。

1.4.4 线粒体膜电位测定 200 μg线粒体加入0.9 mL荧光探针JC-1染色工作液，置于荧光分光光度计内37 ℃反应20 min。加入0.5 mmol/L苹果酸和0.25 mmol/L谷氨酸启动线粒体呼吸，于激发波长525 nm，发射波长590 nm下记录红色荧光，于激发波长490 nm，发射波长530 nm下记录绿色荧光，红绿荧光的数值比为线粒体膜电位^[14]。

1.4.5 线粒体H₂O₂产生速率测定 取0.5 mg线粒体加入测定介质中，加入10 mmol/L谷氨酸和5 mmol/L苹果酸启动线粒体呼吸，继而加入5 μmol/L二氯荧光素，避光37 ℃水浴15 min后置于荧光分光光度计(激发波长499 nm，发射波长521 nm)连续测定10 min，计算线粒体H₂O₂产生速率^[15]。

1.4.6 骨骼肌Caspase-1活性测定 参照文献[16]，500 mg骨骼肌组织置于组织裂解液(0.1 mmol/L十二烷基硫酸钠、0.5 mmol/L鹅去氧胆酸钠、10 μmol/L抑酞酶和5 μmol/L苯甲基磺酰氟化物)，裂解1 h后离心(8 000 r/min)，收集上清，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。取200 μg样品蛋白加入50 μL反应介质(组织裂解液+1 mmol/L YVAD-AFC)，避光反应1 h，终产物于微量荧光酶标仪检测。常氧组Caspase-1活性定义为1，低氧组和低氧+VX-765组Caspase-1活性为与常氧组比较的相对活性。

1.4.7 骨骼肌白细胞介素1β含量测定 采用ELISA法检测。严格按照大鼠白细胞介素1β定量酶联检测试剂盒说明书操作，于微量荧光酶标仪检测各组骨骼肌白细胞介素1β含量。

1.4.8 Western blot法检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α、COXⅣ、NLRP3和ASC蛋白表达 以β-actin为内参。将骨骼肌组织匀浆根据浓度不同加入SDS上样缓冲液加热处理5 min。10 µg蛋白样品经SDS-PAGE电泳分离后，湿转于PVDF膜上。1∶2 000对应一抗孵育过夜，洗后1∶1 000辣根过氧化物酶标记二抗孵育1 h，洗涤后ECL试剂盒显影，X射线胶片曝光记录，扫描各条带灰度值。常氧组条带灰度值定义为100%，低氧组和低氧+ VX-765组为与常氧组比较的相对表达量。

1.5 主要观察指标 线粒体H₂O₂产生速率，ATP合成活力，膜电位，骨骼肌Caspase-1活性，白细胞介素1β含量，过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α、COXⅣ、NLRP3和ASC蛋白表达。

1.6 统计学分析 实验所得各组数据均采用x(_)±s表示，由第一作者应用SPSS 13.0统计软件包进行单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

线粒体功能异常和炎症反应是低氧损伤的重要病理表现^[17]。研究表明，线粒体损伤且不能被自噬清除时，产生过量活性氧，是NLRP3炎性小体活化因素之一^[18]。作者前期研究证明，长期低氧暴露导致大鼠骨骼肌线粒体稳态异常，包括线粒体空间构象异常、线粒体DNA修复能力降低，线粒体抗氧化机制障碍等^[19]。作者所在团队还发现，诱导线粒体自噬可有效抑制低氧诱导的骨骼肌炎症反应^[20]。实验中，4周低氧暴露显著抑制骨骼肌线粒体能量代谢和生物合成，明显增加活性氧生成量，此外，骨骼肌NLRP3炎性小体中NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表达，同时提高了Caspase-1活性和白细胞介素1β含量。作者前期研究证明，大鼠经低氧暴露同时给予抗氧化剂α-硫辛酸干预，骨骼肌线粒体稳态显著改善，同时炎症因子表达降低^[21]。

Dashdorj等^[22]也证明，线粒体靶向抗氧化剂MitoQ显著抑制结肠炎小鼠模型肠黏膜细胞NLRP3炎性小体活化。以上结果提示，低氧损伤线粒体并促进活性氧产生，继而过度活化NLRP3炎性小体，是低氧损伤骨骼肌的重要机制。

白细胞介素1β是参与炎症反应的一种重要的促炎细胞因子，合成后以无活性前体形式存在，须经白细胞介素1β转化酶水解才能转化为具有生物活性的成熟白细胞介素1β^[23]。作者利用NLRP3炎性小体组件中Caspase-1特异性抑制剂VX-765干预长期低氧暴露大鼠，结果表明，VX-765有效抑制了低氧对骨骼肌NLRP3炎性小体的活化效应。Peake等^[24]报道，白细胞介素1β可通过促进巨噬细胞过度分泌细胞因子参与缺血对骨骼肌的损伤。Ystgaard等^[25]证明，与野生型小鼠比较，NLRP3敲除小鼠脑组织对缺血的抵抗力更强。以上结果表明，NLRP3炎性小体过度活化参与了低氧对骨骼肌的损伤。

值得注意的是，线粒体不仅可通过释放活性氧激活细胞炎症反应，亦是炎症因子作用的主要靶点^[26-27]。实验中4周腹腔注射VX-765明显改善低氧损伤的骨骼肌线粒体功能，包括线粒体膜电位和ATP合成活力明显提高，活性氧产生减少，线粒体生物合成显著增加。Zhuang等^[28]也报道，低内毒素胎牛血清白蛋白孵育肾小管上皮细胞导致线粒体超微结构异常，ATP合成活力和线粒体DNA拷贝数明显降低，而NLRP3 siRNA转染显著改善白蛋白对线粒体的损伤。Mastrocola等^[29]在大鼠心脏离体缺血再灌注模型中发现，NLRP3活性抑制剂INF4E预处理可有效促进心肌缺血再灌注后线粒体生物合成，提高心脏收缩功能。以上结果与本研究一致。研究表明，白细胞介素1β孵育软骨细胞导致线粒体复合体Ⅰ活性抑制，线粒体膜电位及ATP产量明显降低^[30]。以上结果提示NLRP3炎性小体活化可能通过释放白细胞介素1β参与低氧对骨骼肌线粒体的损伤。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α是线粒体稳态的主控因子^[31]。参与调控线粒体生物合成^[32]、呼吸链复合体活性^[33]、线粒体融合、抗氧化酶表达等。4周腹腔注射VX-765明显抑制低氧对骨骼肌过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α蛋白表达的下调效应。研究表明，肝脏细胞中白细胞介素1β可通过激活核因子κB和p38 MAPK两条途径抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α表达^[34]。作者前期证明，长期低氧暴露上调骨骼肌NFκB表达，同时抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α表达^[35]。Feng等^[36]证明，腹腔注射核因子κB抑制剂PDTC抑制了骼肌过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α及其下游线粒体生物合成相关蛋白的表达。以上提示，过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α是低氧状态下NLRP3炎性小体损伤线粒体的通路之一。

综合以上，低氧可通过活化NLRP3炎性小体和损伤线粒体功能导致骨骼肌功能障碍，其中NLRP3炎性小体和线粒体之间存在交互作用，线粒体损伤产生大量活性氧，继而活化NLRP3炎性小体以促进白细胞介素1β等炎症因子的产生，而炎症因子可通过下调过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α进一步造成线粒体损伤。NLRP3炎性小体活化和线粒体损伤之间交互作用形成恶性循环，共同参与低氧的病理改变。抑制NLRP3炎性小体活化和改善线粒体稳态均可成为抑制骨骼肌低氧损伤的有效手段。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3炎性小体在低氧诱导骨骼肌线粒体损伤中的作用

Role of NOD-like receptor family, pyrin domain containing 3 inflammasome in the hypoxia-induced skeletal muscle mitochondrial dysfunction

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