周期性机械拉伸促进C2C12细胞成肌过程中microRNA表达谱分析

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.28.013

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (28): 4505-4511.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.28.013

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周期性机械拉伸促进C2C12细胞成肌过程中microRNA表达谱分析

何玉童¹，张马辉²，宋晨¹，叶根澜¹，余磊¹，邱小忠¹，王乐禹¹

¹南方医科大学人体解剖学教研室，广东省组织构建与检测重点实验室，广东省广州市 510515；²南方医科大学珠江医院神经内科，广东省广州市 510515)

修回日期:2017-06-09 出版日期:2017-10-08 发布日期:2017-11-10
通讯作者: 王乐禹，博士，副教授，南方医科大学人体解剖学教研室，广东省组织构建与检测重点实验室，广东省广州市 510515
作者简介:何玉童，女，1991年生，四川省遂宁市人，汉族，南方医科大学在读硕士，主要从事心肌组织工程方面的研究。共同第一作者：张马辉，男，1982年生，汉族， 2014年南方医科大学毕业，硕士，主要从事骨骼肌组织工程方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(31100700)；广东省医学科学技术研究基金(A2015412)

MicroRNA expression profile in the process of cyclic mechanical stretch promoting C2C12 myogenesis

He Yu-tong¹, Zhang Ma-hui², Song Chen¹, Ye Gen-lan¹, Yu Lei¹, Qiu Xiao-zhong¹, Wang Le-yu¹

¹Department of Human Anatomy, Southern Medical University, Guangdong Provincial Key Laboratory of Construction and Detection in Tissue Engineering, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China; ²Department of Neurology, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China

Revised:2017-06-09 Online:2017-10-08 Published:2017-11-10
Contact: Wang Le-yu, M.D., Associate professor, Department of Human Anatomy, Southern Medical University, Guangdong Provincial Key Laboratory of Construction and Detection in Tissue Engineering, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
About author:He Yu-tong, Studying for master’s degree, Department of Human Anatomy, Southern Medical University, Guangdong Provincial Key Laboratory of Construction and Detection in Tissue Engineering, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China; Zhang Ma-hui, Master, Department of Neurology, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China He Yu-tong and Zhang Ma-hui contributed equally to this work.
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31100700; the Guangdong Provincial Medical Research Foundation, No. A2015412

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
microRNA：是一类内源的、长度为20-24个核苷酸的小RNA，其在细胞内具有多种重要的调控作用。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。
成肌调节因子：成肌调节因子家族主要包括Myf5，myogenin, MRF4和MyoD等成员。其中成肌调节因子分子是通过对细胞水平进行调节进而对骨骼肌的再生过程中起着非常重要的作用，成肌调节因子的表达激发成肌过程的发生。最近有学者提出在成肌细胞成熟的过程中成肌调节因子起着非常重要的作用，对成肌细胞进行调节的多种信号通路最后都殊途同归，可能都是通过成肌调节因子途径或当前尚未知晓的非成肌调节因子途径来起作用的。

摘要
背景：近年来，骨骼肌损伤的发生率越来越高，但骨骼肌本身的修复能力有限，研究骨骼肌损伤修复的分子机制对于骨骼肌损伤的治疗具有积极的作用。
目的：探讨microRNA在骨骼肌再生中的作用。
方法：Flexcell-5000拉伸装置周期性体外拉伸C2C12成肌细胞，选取合适的拉伸频率促进成肌发生；高通量测序检测对照组和拉伸组C2C12细胞中差异microRNA的表达；并对这些差异microRNA进行生物信息学分析。
结果与结论：①10%形变、0.125 Hz拉伸频率可促进C2C12成肌细胞增殖，并可提高C2C12细胞中成肌因子MyoD和Myogenin的表达；②0.125 Hz拉伸组和对照组比较共有10个差异microRNA，包括上调的miR-340-5p/449c-5p/1941-3p和下调的miR-500-3p/1934-5p/31-3p/378a-5p/3473b/331-3p/5097；③这些microRNA可能通过多种的调节机制对C2C12成肌细胞的成肌过程进行调节，其中较为重要的通路有MAPK信号通路；④结果表明，低频率周期性力学刺激可能通过microRNA的变化引起成肌因子的表达升高最终引起成肌发生，其中可能参与的信号通路是MAPK信号通路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-9124-4817(何玉童)

关键词: 组织构建, 组织工程, microRNA, C2C12成肌细胞, MAPK 信号通路, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: In recent years, the incidence of skeletal muscle injury becomes higher and higher, but the skeletal muscle repair ability is limited; therefore, studies on the molecular mechanism of skeletal muscle repair play a positive role in the treatment of skeletal muscle injury.
OBJECTIVE: To explore the role of microRNA in skeletal muscle regeneration.
METHODS: C2C12 myoblasts were cyclic stretched in vitro by the Flexercell-5000 flexible device, and the appropriate stretch condition which could induce myogenesis was selected. The microRNA expression alteration during mechanical stretch-induced myoblast myogenesis was explored using high-throughout sequencing, and the differentially expressed microRNAs were further studied by the bioinformatics analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: 10% deformation, 0.125 Hz cyclic mechanical stretch could promote myoblast proliferation and increase MyoD and Myogenin expressions in C2C12 myoblasts. MicroRNA expression profile alteration, including the downregulated miR-500-3p/1934-5p/31-3p/378a-5p/3473b/331-3p/5097 and upregulated miR-340-5p/449c-5p/1941-3p, were all involved in the stretch-mediated myoblast myogenesis, and the MAPK signal pathway seemed to participate in this process. These results suggest that the low frequency of the cyclic mechanical stretch can upregulate the expression levels of myogenic regulatory factors through the alteration of MicroRNA expression, further inducing myogenesis, which the MAPK signal pathway may be involved in.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: MicroRNAs, Myoblasts, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

何玉童，张马辉，宋晨，叶根澜，余磊，邱小忠，王乐禹. 周期性机械拉伸促进C2C12细胞成肌过程中microRNA表达谱分析[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(28): 4505-4511.

He Yu-tong, Zhang Ma-hui, Song Chen, Ye Gen-lan, Yu Lei, Qiu Xiao-zhong, Wang Le-yu. MicroRNA expression profile in the process of cyclic mechanical stretch promoting C2C12 myogenesis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(28): 4505-4511.

图/表（结果） 4

2.1 10%形变、0.125 Hz拉伸频率可促进C2C12细胞增殖 不同频率拉伸组对C2C12细胞进行周期性拉伸4 d后，流式细胞检测的细胞周期如图1，各组相对应的增殖指数见表2。由图1可看出，0.125 Hz拉伸组的C2C12细胞处于增殖期(S期或G2期)的细胞明显比对照组增多，而0.25 Hz和 0.5 Hz拉伸组的细胞周期与对照组比较无明显差异。由公式换算为细胞的增殖指数后，表2可见，0.125 Hz拉伸组的C2C12细胞的增殖指数细胞比对照组升高，而0.25 Hz和 0.5 Hz拉伸组的细胞增殖指数与对照组比较差异无显著性意义。

2.2 10%形变、0.125 Hz拉伸频率可促进C2C12细胞myoD和myogenin基因表达升高 由图2所示，0.125 Hz拉伸频率的C2C12细胞myoD和myogenin基因的表达与对照组比较显著升高(P < 0.05)；0.25 Hz拉伸频率的C2C12细胞中成肌因子的表达与对照组比较差异无显著性意义；0.5 Hz拉伸频率的C2C12细胞中myoD和myogenin基因的表达与对照组比较显著降低(P < 0.05)。

2.3 10%形变、0.125 Hz拉伸C2C12成肌细胞后microRNA表达谱的变化 通过高通量测序检测，0.125 Hz的拉伸组对照组C2C12成肌细胞比较其表达有明显差异且P < 0.05的共有10个microRNA。其中拉伸组有7个下调的microRNA，分别是miR-331-3p， miR-5097，miR-500-3p，miR-3473b，miR-1934-5p，miR-31-3p，miR-378a-5p。而有3个是拉伸组上调的microRNA，分别是miR-1941- 3p，miR-340-5p，miR-449c-5p(表3)。

2.4 生物信息学结果分析(GO分析，KEGG分析) 从GO富集分析的结果显示，拉伸组与对照组表达有差异的microRNA预测靶点的分子，其功能在金属离子结合，锌离子结合，蛋白结合，离子结合等方面富集较为显著。因此预测靶点所在的位置应在细胞内，细胞内部分，胞内有界膜细胞器，有界膜细胞器，细胞器等条目富集显著。预测靶点参与的生命活动在刺激反应调节，信号调节，细胞新陈代谢过程调节，信号传导调节，细胞正分组成等方面富集显著，而P值越小越有理由说明在该条目富集越显著(图3)。

KEGG通路分析的结果显示，显著富集的通路共有29条，而其中与骨骼肌的损伤修复有关的通路有：T细胞受体信号通路，磷脂酰肌醇信号通路，肌萎缩侧索硬化，肌动蛋白细胞骨架调节通路，B细胞受体信号通路，MAPK信号通路，转化生长因子β信号通路，趋化因子信号通路，黏附连接，磷酸盐和亚磷酸盐代谢通路，统计学分析显示P < 0.05为显著富集，且P值越小，说明在该条目越富集(图4)。

参考文献

[1] Kook SH, Lee HJ, Chung WT, et al. Cyclic mechanical stretch stimulates the proliferation of C2C12 myoblasts and inhibits their differentiation via prolonged activation of p38 MAPK. Mol Cells. 2008;25(4): 479-486.

[2] Khalsa PS, Ge W, Uddin MZ, et al. Integrin alpha2beta1 affects mechano-transduction in slowly and rapidly adapting cutaneous mechanoreceptors in rat hairy skin. Neuroscience. 2004;129(2): 447-459.

[3] Cachaço AS, Pereira CS, Pardal RG, et al. Integrin repertoire on myogenic cells changes during the course of primary myogenesis in the mouse. Dev Dyn. 2005;232(4):1069-1078.

[4] Rauch C, Loughna PT. Static stretch promotes MEF2A nuclear translocation and expression of neonatal myosin heavy chain in C2C12 myocytes in a calcineurin- and p38-dependent manner. Am J Physiol Cell Physiol. 2005;288(3): C593-605.

[5] Dias P, Dilling M, Houghton P. The molecular basis of skeletal muscle differentiation. Semin Diagn Pathol.1994;11(1): 3-14.

[6] Kumar A, Murphy R, Robinson P, et al. Cyclic mechanical strain inhibits skeletal myogenesis through activation of focal adhesion kinase, Rac-1 GTPase, and NF-kappaB transcription factor. FASEB J. 2004;18(13): 1524-1535.

[7] Wang H, Sun H, Guttridge DC. microRNAs: novel components in a muscle gene regulatory network. Cell Cycle. 2009;8(12): 1833-1837.

[8] Bernstein E, Kim SY, Carmell MA, et al. Dicer is essential for mouse development. Nat Genet. 2003;35(3): 215-217.

[9] Li J, Wang G, Jiang J, et al. Dynamical Expression of MicroRNA-127-3p in Proliferating and Differentiating C2C12 Cells. Asian-Australas J Anim Sci. 2016;29(12): 1790-1795.

[10] Hua W, Zhang M, Wang Y, et al. Mechanical stretch regulates microRNA expression profile via NF-kappaB activation in C2C12 myoblasts. Mol Med Rep. 2016;14(6): 5084-5092.

[11] Ma Z, Sun X, Xu D, et al. MicroRNA, miR-374b, directly targets Myf6 and negatively regulates C2C12 myoblasts differentiation. Biochem Biophys Res Commun. 2015;467(4): 670-675.

[12] Zhang Y, Yang L, Gao YF, et al. MicroRNA-106b induces mitochondrial dysfunction and insulin resistance in C2C12 myotubes by targeting mitofusin-2. Mol Cell Endocrinol. 2013; 381(1-2): 230-240.

[13] O'Rourke JR, Georges SA, Seay HR, et al. Essential role for Dicer during skeletal muscle development. Dev Biol. 2007; 311(2): 359-368.

[14] Wang LY, Wang HY, Ouyang J, et al. Low concentration of lipopolysaccharide acts on MC3T3-E1 osteoblasts and induces proliferation via the COX-2-independent NFkappaB pathway. Cell Biochem Funct, 2009. 27(4): 238-242.

[15] Otis JS, Burkholder TJ, Pavlath GK. Stretch-induced myoblast proliferation is dependent on the COX2 pathway. Exp Cell Res. 2005;310(2): 417-425.

[16] Wazir R, Luo DY, Dai Y, et al. Expression and proliferation profiles of PKC, JNK and p38MAPK in physiologically stretched human bladder smooth muscle cells. Biochem Biophys Res Commun. 2013;438(3): 479-482.

[17] Mok GF, Sweetman D. Many routes to the same destination: lessons from skeletal muscle development. Reproduction. 2011;141(3): 301-312.

[18] Yu B, Zhou S, Qian T, et al. Altered microRNA expression following sciatic nerve resection in dorsal root ganglia of rats. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2011;43(11): 909-915.

[19] Zhou J, Gao J, Zhang X, et al. microRNA-340-5p Functions Downstream of Cardiotrophin-1 to Regulate Cardiac Eccentric Hypertrophy and Heart Failure via Target Gene Dystrophin. Int Heart J. 2015;56(4): 454-458.

[20] Greco S, De Simone M, Colussi C, et al. Common micro-RNA signature in skeletal muscle damage and regeneration induced by Duchenne muscular dystrophy and acute ischemia. FASEB J. 2009;23(10):3335-3346.

[21] Cacchiarelli D, Incitti T, Martone J, et al. miR-31 modulates dystrophin expression: new implications for Duchenne muscular dystrophy therapy. EMBO Rep. 2011;12(2):136-141.

[22] Crist CG, Montarras D, Buckingham M. Muscle satellite cells are primed for myogenesis but maintain quiescence with sequestration of Myf5 mRNA targeted by microRNA-31 in mRNP granules. Cell Stem Cell. 2012;11(1):118-126.

[23] Hou X, Tang Z, Liu H, et al. Discovery of MicroRNAs associated with myogenesis by deep sequencing of serial developmental skeletal muscles in pigs. PLoS One.2012;7(12): e52123.

[24] Dmitriev P, Barat A, Polesskaya A, et al. Simultaneous miRNA and mRNA transcriptome profiling of human myoblasts reveals a novel set of myogenic differentiation-associated miRNAs and their target genes. BMC Genomics. 2013;14: 265.

[25] Huang Z, Xie X. [Chemerin induces insulin resistance in C2C12 cells through nuclear factor-kappaB pathway-mediated inflammatory reaction]. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. 2015;31(6): 725-729.

[26] Zhao M, Zhang ZF, Ding Y, et al. Astragalus polysaccharide improves palmitate-induced insulin resistance by inhibiting PTP1B and NF-kappaB in C2C12 myotubes. Molecules. 2012;17(6):7083-7092.

[27] Kemaladewi DU, de Gorter DJ, Aartsma-Rus A, et al. Cell-type specific regulation of myostatin signaling. FASEB J. 2012;26(4): 1462-1472.

[28] Xie Q, Deng Y, Huang C, et al. Chemerin-induced mitochondrial dysfunction in skeletal muscle. J Cell Mol Med. 2015;19(5): 986-995.

[29] Tabandeh MR, Hosseini SA, Hosseini M, et al. Ginsenoside Rb1 exerts antidiabetic action on C2C12 muscle cells by leptin receptor signaling pathway. J Recept Signal Transduct Res. 2017;37(4): 370-378.

[30] Bloch SA, Lee JY, Syburra T, et al. Increased expression of GDF-15 may mediate ICU-acquired weakness by down-regulating muscle microRNAs. Thorax. 2015;70(3): 219-228.

[31] Kim SH, Hwang JT, Park HS, et al. Capsaicin stimulates glucose uptake in C2C12 muscle cells via the reactive oxygen species (ROS)/AMPK/p38 MAPK pathway. Biochem Biophys Res Commun. 2013;439(1): 66-70.

[32] Tarabees R, Hill D, Rauch C, et al. Endotoxin transiently inhibits protein synthesis through Akt and MAPK mediating pathways in C2C12 myotubes. Am J Physiol Cell Physiol. 2011;301(4): C895-902.

[33] Dimchev GA, Al-Shanti N, Stewart CE. Phospho-tyrosine phosphatase inhibitor Bpv(Hopic) enhances C2C12 myoblast migration in vitro. Requirement of PI3K/AKT and MAPK/ERK pathways. J Muscle Res Cell Motil. 2013;34(2): 125-136.

[34] Gan L, Liu Z, Zhang Z, et al. SOCS2 inhibited mitochondria biogenesis via inhibiting p38 MAPK/ATF2 pathway in C2C12 cells. Mol Biol Rep. 2014;41(2): 627-637.

[35] Zbinden-Foncea H, Deldicque L, Pierre N, et al. TLR2 and TLR4 activation induces p38 MAPK-dependent phosphorylation of S6 kinase 1 in C2C12 myotubes. Cell Biol Int. 2012;36(12): 1107-1113.

[36] Lee JO, Kim N, Lee HJ, et al. Visfatin, a novel adipokine, stimulates glucose uptake through the Ca2 +-dependent AMPK-p38 MAPK pathway in C2C12 skeletal muscle cells. J Mol Endocrinol. 2015;54(3): 251-262.

[37] 范衡宇, 佟超, 孙青原. 丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的研究进展[J]. 动物学杂志, 2002, 37(5): 98-102.

[38] Knight JD, Tian R, Lee RE, et al. A novel whole-cell lysate kinase assay identifies substrates of the p38 MAPK in differentiating myoblasts. Skelet Muscle. 2012;2: 5.

[39] Ji G, Liu D, Liu J, et al. p38 mitogen-activated protein kinase up-regulates NF-kappaB transcriptional activation through RelA phosphorylation during stretch-induced myogenesis. Biochem Biophys Res Commun. 2010;391(1): 547-551.

[40] Dimchev GA, Al-Shanti N, Stewart CE. Phospho-tyrosine phosphatase inhibitor Bpv(Hopic) enhances C2C12 myoblast migration in vitro. Requirement of PI3K/AKT and MAPK/ERK pathways. J Muscle Res Cell Motil.2013;34(2):125-136.

引言

近年来，骨骼肌损伤的发病率呈现升高的趋势，然而骨骼肌自身修复的能力却十分有限，有关骨骼肌损伤后的重建、修复和再生的细胞、分子以及其相关力学水平的机制研究也受到了越来越多研究者们的关注。骨骼肌再生修复机制的触发主要是由外在的力学因素与内在的细胞因素二者共同调控完成的一个非常复杂与呈多阶段的过程，同样骨骼肌的发育或再生修复过程中都离不开力学刺激，力学刺激有着不可替代的作用。力学刺激能引起成肌细胞发生多种变化，如细胞增殖、分化、代谢、修复和存活^[1-6]。外部的力学因素是通过某种特定的信号途径把外部的力学信号转变为相关的细胞内信号，但是这种传导机制的确定传导途径目前还不是十分清楚。

microRNA(miRNAs，miRs)在成肌细胞成肌方面的作用以及其相关信号的传递与调控是最近几年研究者们研究的热点，microRNA是由20-25个核苷酸组成的非编码小分子RNA^[7]，其能在转录后调控基因的表达，在调控基因表达中扮演重要的角色。相关的调控机制是无功能的microRNA的前体分子移动到细胞的胞质后，被Dicer核酸酶水解，使前体分子被激活形成有活性功能的microRNA，根据功能化的microRNA与结合上的目标mRNA的匹配程度，当microRNA与结合上的mRNA完全配对时激活后的microRNA能抑制目标mRNA的翻译，microRNA与结合上的mRNA部分配对时促使目标mRNA的裂解^[8-12]。在动物实验中，干扰掉组织特异性的Dicer酶后发现在骨骼肌的生成与其正常形态的维持中都离不开microRNA分子的作用^[13]。然而，在力学刺激引起的成肌过程中有关microRNA表达谱的变化和分析仍未有系统的研究。

实验通过计算机控制的Flexcell-5000加载系统对小鼠C2C12成肌细胞进行周期性机械拉伸，选取合适的拉伸条件促进C2C12成肌细胞进行大量的增殖并提高细胞成肌因子的表达，并通过相关的高通量测序和生物信息学分析对力学拉伸促进C2C12成肌细胞成肌组和对照组进行分析，为研究microRNA在力学刺激中能促进骨骼肌成肌过程中的作用提供一些依据。

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材料方法

1.1 设计 体外细胞学实验。

1.2 时间及地点 于2015年12月至2016年9月在南方医科大学人体解剖教研室组织工程实验室完成。

1.3 材料 小鼠C2C12成肌细胞株购自美国ATCC公司；青霉素、链霉素、DMEM购自GIBCO公司。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养 C2C12成肌细胞培养于含体积分数10%胎牛血清(GIBCO)、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的DMEM(GIBCO)培养基中，放置在37 ℃，体积分数5%CO₂孵箱内培养。

1.4.2 力学加载 C2C12细胞以1×10⁵/孔种在提前包被了Ⅰ型胶原的6孔板中，使C2C12细胞在孔中贴壁培养24 h，然后在由计算机控制下的Flexcell-5000拉伸装置中，进行频率分别为0.125 Hz、0.25 Hz 和0.5 Hz，正弦波幅度为10%的周期性拉伸加载运动，每天进行1次拉伸，每次的拉伸时间为2 h，总共进行拉伸4 d，细胞隔天换液1次。对照组在同一孵箱内培养。

1.4.3 细胞周期检测 细胞周期分析用流式细胞检测来实施。在10%形变、不同频率拉伸的C2C12细胞被胰酶消化、离心收集。收集的细胞重悬在1 mL PBS中，滴加在体积分数70%乙醇中，4 ℃固定过夜。离心收集细胞，PBS洗涤2次，细胞用500 µL 碘化丙啶(100 mg/L)重悬，37 ℃染色30 min后上机检测。相对DNA增殖指数用作者以前报道过的公式[(S%+G₂/M%)/(S%+G₂/M%+G₀/G₁%)]计算^[14]。1.4.4 qRT-PCR实验对照组和拉伸组C2C12细胞的总RNA用TRIzol(Invitrogen)按照说明书上的步骤进行提取。反转录反应用反转录试剂盒(TAKARA)在ABI9700PCR仪上进行。实时定量PCR用实时PCR检测仪(Stratagene Mx3000P实时PCR仪，Agilent)。MyoD和Myogenin引物序列见表1，引物由上海生工合成。PCR为20 µL反应体系，包括2 µL 反转录产物，0.2 µL Taq DNA聚合酶，10 µL 5× PCR 缓冲液，0.6 µL 5 µmol/L 引物和灭菌水。反应条件为95 ℃ 3 min，95 ℃ 12 s，62 ℃ 40-60 s，40个循环进行扩增。相对基因表达量用相对临界循环(2^-??Ct)方法计算，内参为GAPDH。

1.4.5 高通量测序 高通量测序用来检测在对照组和0.125 Hz拉伸组C2C12细胞中差异microRNA表达。在拉伸4 d后，2组C2C12细胞的总RNA用TRIzol提取，提取的总RNA送至基迪奥公司进行MicroRNA基因测序：用聚丙烯酰胺凝胶电泳把小RNAs(18-75 nt)从总RNA中分离，纯化；小RNA被连上5’和3’末端接头，反转录为cDNA。纯化的DNA样品用高通量测序仪(Illumina genome Analyzer IIx)进行micro-RNA基因测序。为筛选有差异表达的microRNA，归一化后的数据进行Panc-1与3T3均值的比值的计算，计算结果显示该比值> 2且t-test(经过Bonferron校正)，P < 0.05则被认为是差异表达microRNA。

1.4.6 生物信息学分析

目的靶基因的预测与分析：对有差异MicroRNA的目的靶基因运用了3个软件：Mireap，miRanda，targetscan进行相关分析以降低目的靶基因预测结果的假阳性，并根据3个结果的交集作为目的靶基因的预测结果。得到的所有的预测基因都向Gene Ontology数据库(http://www. geneontology. org/)进行的各个term映射，然后计算靶基因映射到每个term的数目，再运用超几何检验，寻找与所有参考基因背景相比，在候选靶基因中富集显著的GO条目，将计算得到的P-value用Bonferroni校正之后，以corrected P-value ≤ 0.05作为阈值，将满足此条件的GO term定义为在候选靶基因中富集显著的GO term。进而通过GO功能显著性富集分析确定候选靶基因行使的主要生物学功能。采用GENECODISv 2.0软件(http://genecodis.dacya.ucm.es/) 和DIANA(http://diana.cslab.ece.ntua.gr/pathways/)对KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路进行分析。分别采用KEGGSOAP和TRANSFAC 7.0 public软件对Network和TFBS (Transcription factor binding sites)进行分析。

1.5 主要观察指标 细胞增殖主通过细胞周期的变化来判定，分子水平主要通过高通量测序得出的有统计学差异的microRNA。

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讨论

不同拉伸频率、形变大小以及拉伸周期对成肌细胞的影响不同。合适的外部力学刺激可促进体外培养的成肌细胞增殖^[14-15]。据文献报道15%的形变可明显导致对肌细胞的损伤，而10%形变、1 Hz的周期性拉伸(拉伸1 h，放松23 h)可促进成肌细胞增殖^[12]。本实验根据文献选择与其一致的10%的形变，但拉伸频率及时间有所调整。然而本实验结果显示，当C2C12成肌细胞被10%形变、不同拉伸频率(0.125，0.25及0.5 Hz)的周期性(拉伸2 h，放松22 h，1次/d，共加载4 d)力学加载下，只有0.125 Hz的力学拉伸频率可促进成肌细胞增殖。在相同的形变下，本实验通过较低的拉伸频率使成肌细胞增值速率增加了。相似的实验结果显示5%形变、0.1 Hz的拉伸条件可促使人膀胱平滑肌细胞增殖^[16]。

成肌调节因子的家族主要包括Myf5，myogenin，MRF4和MyoD等成员。其中成肌调节因子分子是通过对细胞水平进行调节进而对骨骼肌的再生过程中起着非常重要的作用，成肌调节因子的表达所激发成肌过程的发生。最近有学者提出在成肌细胞成熟的过程中成肌调节因子起着非常重要的作用，对成肌细胞进行调节的多种信号通路最后都殊途同归，可能都是通过成肌调节因子途径或当前尚未知晓的非成肌调节因子途径来起作用的^[17]。而本实验结果显示，拉伸组的C2C12成肌细胞中Myogenin和MyoD的表达都是显著上调的，说明此拉伸条件可促进成肌过程的发生。

在确定了10%形变、0.125 Hz拉伸频率可促进成肌后，作者用高通量测序方法检测了对照组与0.125 Hz拉伸组C2C12细胞中差异microRNA的表达。实验结果显示，拉伸频率为0.125 Hz拉伸组与对照组相比，microRNA表达有差异的共有10个，其中上调的是：miR-340-5p，miR-1941- 3p，miR-449c-5p，而其中表达下调的是：miR-378a-5p，miR-500-3p，miR-5097，miR-31-3p，miR-3473b，miR- 331-3p，miR-1934-5p。在这些分子中miR-3473b、miR-1934-5p、miR-5097、miR-1941-3p的研究较少。miR- 500-3p在骨骼肌再生方面的作用的相关研究也较少，其却和神经损伤的修复有关，曾有文献报道miR-500-3p在坐骨神经被切除后的神经再生中，miR-500的表达在背根神经节中是下调的^[18]。MiR-340的过表达与心肌肥厚有关^[19]。在对MDX小鼠和杜氏肌萎缩症患者的骨骼肌microRNA变化的研究中发现，miR-449在此两种骨骼肌中的表达是上升的，被称作“再生microRNA”^[20]。以往的研究表明，miR-31的表达被抑制后可以促进杜氏肌萎缩症患者的抗肌萎缩蛋白的合成，增强肌细胞的修复与再生，其可能成为一种有效的治疗方向^[21]；运用miR-31拮抗剂后可以使生肌因子Myf5的表达增强^[22]。在对miR-378的相关研究中，有报道显示miR-378的过表达可通过调节骨形态形成蛋白2与有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)，进而抑制成肌细胞增殖^[23]。关于miR-331，有研究显示miR-331在成肌过程中是上调的^[24]。本实验结果表明，频率为0.125 Hz的拉伸组可能是通过miR-449、MiR-340的表达上调和miR-378、miR-31、miR-331的表达下调后直接或间接的作用，然后促进成肌的发生。本研究还证明了之前甚少报道的miR-1941-3p、miR-1934-5p、miR- 5097、miR-3473b、miR-500、miR-340等6种microRNA也参与了骨骼肌成肌过程。

作者进一步对对照组和0.125 Hz拉伸组的差异microRNA进行生物信息学分析。通过GO富集分析，拉伸组与对照组microRNA的表达有差异的预测靶点参与的生命活动在信号传导调节，刺激反应的调节，细胞新陈代谢过程调节，细胞正分组成，信号调节等条目富集显著。且KEGG的通路分析结果也显示，总共有29条通路富集显著，而其中与骨骼肌的损伤修复有关的通路主要有以下部分：转化生长因子β信号通路，T细胞受体信号通路，肌萎缩侧索硬化，B细胞受体信号通路，磷脂酰肌醇信号系统，MAPK 信号通路，磷酸盐和亚磷酸盐代谢，黏附连接，趋化因子信号通路，肌动蛋白细胞骨架调节，其中MAPK信号通路是报道较多的与骨骼肌修复方面有关的^[25-30]。MAPK (丝裂原活化蛋白激酶)信号通路是多种细胞都广泛存在的一条信号转导途径，其主要由一组级联活化的丝苏氨酸蛋白激酶组成，对于细胞基因表达与细胞周期的运行都具有及其重要的调控作用^[31-36]。MAPK包括多种分子，被激活后会向核内移动，磷酸化包括转录因子在内的核蛋白和膜受体蛋白，进而实现对基因转录和其他生命活动的调节^[37]。MAPK在成肌细胞的分化过程中也起着重要的作用，这种作用一部分是通过磷酸化和调节一些转录因子和染色质重构蛋白来实现的^[38]。Ji等^[39]在2010年的研究中指出，周期性机械拉伸后的骨骼肌生成是通过MAPK的活动来调节核因子κB的转录激活而实现的，它们之间存在交互效应。有文献报道激活MAPK可促进肌祖细胞得迁移，由此而改善肌细胞的合成再生^[40]。而本研究发现，低频率的周期性机械拉伸可促进骨骼肌再生，这种机制可能部分是通过调节MAPK信号通路而实现的。

总之，本研究表明，低频率的周期性机械拉伸可促进骨骼肌再生与修复。通过基因测序技术对周期性机械拉伸组和对照组的microRNA的表达谱进行分析，发现了10种microRNA的表达是有差异的，这些microRNA可能通过多种的调节机制来实现对成肌细胞增殖的调节，结合实验结果与相关文献报道，其中MAPK信号通路是其中较重要机制。MAPK可通过对一些转录因子和染色质重构蛋白和相关蛋白磷酸化进行调节进而实现对成肌细胞功能的调节。这些初步的研究结果为今后的进一步研究外部力学刺激与细胞内的信号调节在骨骼肌损伤修复等生命活动中的相关机制提供一定基础，也为骨骼肌损伤的治疗研究提供了一些理论基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

周期性机械拉伸促进C2C12细胞成肌过程中microRNA表达谱分析

MicroRNA expression profile in the process of cyclic mechanical stretch promoting C2C12 myogenesis

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[1]	姚晓玲, 彭建城, 许岳荣, 杨志东, 张顺聪. 可变角度零切迹前路椎间融合内固定系统治疗脊髓型颈椎病：30个月随访[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1377-1382.
[2]	王琴, 沈呈, 廖静, 杨烨. 达格列净干预改善糖尿病肾病模型大鼠的肾脏损伤[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1216-1222.
[3]	安维政, 何萧, 任帅, 刘建宇. 肌源干细胞在周围神经再生中的潜力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1130-1136.
[4]	张璟琳, 冷敏, 朱博恒, 汪虹. 干细胞源外泌体促进糖尿病创面愈合的机制及应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1113-1118.
[5]	何云影, 李玲婕, 张舒淇, 李雨舟, 杨生, 季平. 聚丙烯酸/琼脂糖三维培养构建细胞球的方法[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 553-559.
[6]	何冠宇, 徐宝山, 杜立龙, 张同星, 霍振鑫, 申力. 天然丝素蛋白构建仿生取向微通道纤维环支架[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 560-566.
[7]	陈晓旭, 罗雅馨, 毕浩然, 杨琨. 脱细胞支架制备及其在组织工程和再生医学中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 591-596.
[8]	康坤龙, 王新涛. 生物支架材料促进骨髓间充质干细胞成骨分化的研究热点[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 597-603.
[9]	沈佳华, 付勇. 基于石墨烯的纳米材料可否在干细胞领域应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 604-609.
[10]	张通, 蔡金池, 袁志发, 赵海燕, 韩兴文, 王文己. 基于透明质酸的复合水凝胶修复骨关节炎软骨损伤：应用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 617-625.
[11]	李辉, 陈良龙. 植骨材料在脊柱结核治疗中的应用与特征[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 626-630.
[12]	高仓健, 杨振, 刘舒云, 李浩, 付力伟, 赵天元, 陈威, 廖志垚, 李品学, 眭翔, 郭全义. 静电纺丝技术在肩袖损伤修复中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 637-642.
[13]	关健, 贾燕飞, 张葆鑫, 赵国中. 4D生物打印在组织工程的应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(3): 446-455.
[14]	曾裕威, 黄闯, 魏建国, 段东明, 王簕. 利用生物发光成像示踪大鼠颅骨缺损中移植的骨髓间充质干细胞[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(25): 3968-3973.
[15]	何琪, 许发亚, 李细艳, 韩磊, 肖雁冰, 涂皎. 人脱细胞羊膜支架的制备及灭菌方法[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(25): 4028-4033.