二氧化钛纳米管生物透析膜的生物相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.26.012

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

透析膜：是一种以浓度差为推动力的分离膜，根据分离的溶质粒径，要求渗析膜上有相适应的孔径均匀的微孔，膜孔径在1 μm以下的有机高聚物的均质膜，是一类不带电荷的多孔膜，目前主要用于人工肾的纤维素渗析膜。常用的制备材料有铜氨法再生纤维素、醋酸纤维素、聚丙烯腈、乙烯-乙烯醇共聚物以及聚甲基丙烯酸甲酯、聚砜、聚丙烯酰胺等。

溶血实验：是对人体内的红细胞进行红细胞破裂溶解检测，主要用于溶血性贫血的病因诊断。溶血是指红细胞破裂溶解现象，很多理化因素都可以引起溶血，其正常值为24 h不加葡萄糖管溶血率小于4.5%，加葡萄糖或加ATP管溶血率小于0.4%。

背景：传统的透析膜多由有机聚合物材料合成，这些材料虽然能满足治疗需要，但材料孔径尺寸范围较大，微管不均匀，容易造成蛋白质在透析膜上淤塞，难以达到预期的治疗效果。

目的：分析二氧化钛纳米管生物透析膜的血液相容性。

方法：根据阳极氧化法制备高强度的二氧化钛纳米管薄膜，利用HF气体对纳米管底部进行腐蚀，获得两端通透的二氧化钛纳米管阵列薄膜，将LLC-PK1细胞和ECV304细胞分别接种于二氧化钛纳米管阵列薄膜上，获得两种二氧化钛纳米管生物透析膜。①溶血实验：将两种二氧化钛纳米管生物透析膜及聚氨酯材料分别浸泡于生理盐水与蒸馏水中，检测溶血率；②动态凝血时间实验：将涂过兔血的两种二氧化钛纳米管生物透析膜及聚氨酯材料分别与氯化钙混合，计算动态凝血时间；③血小板黏附实验：将富血小板血浆分别滴于两种二氧化钛纳米管生物透析膜及聚氨酯材料上，计算血小板黏附率。

结果与结论：①溶血实验：接种LLC-PK1细胞、ECV304细胞通透二氧化钛纳米管薄膜的溶血率均低于聚氨酯材料(0.30%，0.34%，0.56%，P < 0.05)；②动态凝血时间实验：接种LLC-PK1细胞、ECV304细胞通透二氧化钛纳米管薄膜20，40，70 min的动态凝血时间显著长于聚氨酯材料(P < 0.05)；③血小板黏附实验：接种LLC-PK1细胞、ECV304细胞通透二氧化钛纳米管薄膜的与聚氨酯材料相比差异无显著性意义(P > 0.05)；④结果表明：二氧化钛纳米管生物透析膜具有良好的血液相容性。

ORCID: 0000-0001-9495-0960(高钰寒)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 二氧化钛, 纳米管, 生物透析膜, 阳极氧化法, 溶血实验, 动态凝血时间实验, 血小板黏附实验

Abstract:

BACKGROUND: Traditional dialysis membranes are mostly synthesized by organic polymer materials. Although these materials can meet the needs of treatment, the pore size range is large and the microtubules are not uniform, which can cause protein clogging on the dialysis membrane. Therefore, it is difficult to achieve the expected therapeutic effect.

OBJECTIVE: To study the hemocompatibility of titanium dioxide nanotube bio-dialysis membrane.

METHODS: High-strength titanium dioxide nanotube films were prepared by anodic oxidation method, the bottom of the nanotubes was etched by HF gas, and the LLC-PK1 and ECV304 cells were seeded onto the prepared titanium dioxide nanotube array membranes to construct two kinds of titanium dioxide nanotube bio-dialysis membranes. Hemolysis test, dynamic clotting time test and platelet adhesion test were used to determine the hemocompatibility of the prepared titanium dioxide nanotube bio-dialysis membrane.

RESULTS AND CONCLUSION: In the hemolysis test, the hemolysis rates of the titanium dioxide nanotube array membranes carrying LLC-PK1 and ECV304 cells were lower than that of the polyurethane material (0.30%, 0.34%, 0.56%; P < 0.05). In the dynamic clotting test (20, 40, 70 minutes), the dynamic clotting time of the titanium dioxide nanotube array membranes carrying LLC-PK1 and ECV304 cells were significantly longer compared with the polyurethane material (P < 0.05). In the platelet adhesion test, the platelet adhesion rate showed no significant difference between the polyurethane material and the titanium dioxide nanotube array membranes carrying LLC-PK1 and ECV304 cells (P > 0.05). These findings indicate that the titanium dioxide nanotube bio-dialysis membrane possesses good hemocompatibility.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Renal Dialysis, Hemolysis, Platelet Adhesiveness

中图分类号:

R318

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Biocompatibility of titanium dioxide nanotube bio-dialysis membrane

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图/表（结果） 4

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引言

慢性肾脏疾病是临床上常见的疾病，该疾病发生率在全球范围内呈上升趋势，占总人口的10.0%，成为心脑血管、肿瘤及糖尿病后又一个威胁居民健康的疾病^[1]。目前，临床上对于慢性肾脏疾病以肾脏移植为主，该方法能有效缓解症状，改善患者生活质量^[2]。但由于肾脏移植供体较少，导致该方法治疗受到很大限制，并且肾脏移植对医疗设备要求较高，难以在基础医院推广^[3]。随着医疗技术的不断发展，血液透析在慢性肾脏疾病患者中得到应用，该方法能延长终末期肾病患者的寿命^[4]。血液透析治疗时不同的生物透析膜疗效不同，传统的透析膜多由有机聚合物材料合成，这些材料虽然能满足治疗需要，但材料孔径尺寸范围较大，并且微管不均匀，容易造成蛋白质在透析膜上淤塞，难以达到预期的治疗效果^[5-6]。

理想的透析膜材料必须保证透析膜具有优良的力学性能、渗透性能和热解性能，并且材料还必须考虑生物排异反应^[7]。随着医疗技术的不断发展，纳米材料在生物医用方面有广泛的优越性。国外学者采用硅纳米孔薄膜作为透析膜材料用于构建生物人工肾小管辅助装置，取得了理想的效果^[7]。二氧化钛纳米薄膜管具有良好的生物相容性，并且薄膜管孔径相对均匀，是生物医学比较理想的材料。相关学者采用二氧化钛纳米管阵列作为骨细胞、干细胞平台，并将其运用于血管移植工程中，根据血清蛋白吸附实验、血小板黏附实验等进行研究，结果显示二氧化钛纳米管具有良好的生物相容性^[8]。此外，二氧化钛纳米管还可改善成骨细胞的黏附、增殖等^[9]。而在血管移植方面，相关研究表明二氧化钛纳米管能提高内皮细胞移动性、增殖和功能表达作用，对血管平滑肌细胞的生长、增殖产生影响^[10]。但是，临床上对于二氧化钛纳米管透析膜的制备缺乏报道，并且将二氧化钛纳米管透析膜运用于血液透析中血液相容性尚存在较大争议^[11]。

实验探讨二氧化钛纳米管生物透析膜制备方法及血液相容性，为构建具备生理功能的生物人工肾单元提供参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计生物材料制备及体外分析实验。

1.2 时间及地点实验于2015年1月至2016年1月在新乡医学院完成。

1.3 材料 0.5 mm钛片，纯度为99.8%(宝鸡九鼎钛制品厂)；Ⅱ型医用聚氨酯材料(佛山市泰升塑胶科技有限公司)；乙二醇(天津福晨化学试剂厂)；LLC-PK1和ECV304细胞(上海复祥生物科技有限公司)；L-DMEM培养基(南美洲Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青)；低速离心机(中佳SC-3610)；倒置相差显微镜、超景深三维显微镜(日本Olympus公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 二氧化钛管阵列薄膜的制备

二氧化钛纳米管薄膜的制备：采用阳极氧化法制备高强度的二氧化钛纳米管薄膜，将购置的纯度为99.8%钛板修剪为大小为80 mm×11 mm的小片，打磨抛光后除去表面机械划痕，依次采用丙酮、蒸馏水、乙醇等超声下清洗10 min，在N₂吹干后备用。将获得的二氧化钛纳米管薄膜放入浓度为0.26%的NH₄F、体积分数为2%的蒸馏水及100 mL乙醇溶液中，将钛板作为阳极、铂作为阴极，在电压为56 V下氧化30 h^[12]。

通透二氧化钛纳米管薄膜的制备^[13]：利用HF气体对纳米管底部进行腐蚀，获得两端通透的二氧化钛纳米管阵列薄膜。取经阳极氧化后的二氧化钛纳米管薄膜在乙醇超声下冲洗80 s，烘干后，将二氧化钛纳米管薄膜底部采用浓度为40%HF挥发蒸汽进行腐蚀。在一个塑料容器内装入浓度为40%的HF，容器口放入一个金属网，HF和金属网的距离控制在2.0-3.0 cm，将制备的通透二氧化钛纳米管薄膜放置在金属网上腐蚀15 min，然后将获得的通透二氧化钛纳米管薄膜采用蒸馏水清洗10 min，采用乙醇脱水1次，六甲基二硅胺烷浸泡20 min，取出晾干后备用^[14]。

1.4.2 二氧化钛纳米管生物透析膜的制备

LLC-PK1和ECV304细胞的培养：取LLC-PK1和ECV304细胞，采用倒置显微镜观察细胞形态，待细胞融合90%时开始传代培养，除去培养液，采用PBS清洗一二次，加入2 mL胰酶消化液，37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中进行培养，每天换液1次，显微镜下观察细胞，待细胞大部分收缩变圆加入DMEM高糖培养液终止消化。制备细胞悬液，速度1 000 r/min离心5 min，待细胞沉淀后去除上层清夜，加入2.0-3.0 mL培养液，根据1∶4比例进行传代培养^[15]。

细胞的黏附：向制备好的通透二氧化钛纳米管薄膜放入24孔板中，向每孔中加入5×10⁴/cm² LLC-PK1细胞(或ECV304细胞)悬液，37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中进行培养，每天换液1次，获得二氧化钛纳米管生物透析膜^[16]。

1.4.3 二氧化钛纳米管生物透析膜生物相容性测定为了更加突出二氧化钛纳米管生物透析膜的血液相容性，研究中将Ⅱ型医用聚氨酯材料作为对照。

溶血实验：取二氧化钛纳米管生物透析膜和Ⅱ型医用聚氨酯材料，均分别放入生理盐水(阴性对照)和蒸馏水(阳性对照)中浸泡72 h，放入15 mL离心管中，向离心管中加0.2 mL新鲜兔血，水浴60 min，1 000 r/min离心5 min，获得上层清夜，545 nm波长分光光度计下测定其吸光度A值，根据公式测定溶血结果，最大值为1.00^[17-18]。

动态凝血时间实验：取2 mL ACD抗凝人血，均匀涂抹在培养皿中心，放入二氧化钛纳米管生物透析膜和Ⅰ型医用聚氨酯，加入0.2 mol/L CaCl₂混合均匀，在5，10，20，40，70 min分别加入100 mL蒸馏水，测定吸光度A值，绘制标准曲线，计算动态凝血时间^[19-20]。

血小板黏附实验：取10 mL家兔心脏抗凝血，1 000 r/min离心5 min，取富血小板血浆，测定血小板数。将1.0 mL富血小板血浆分别注入二氧化钛纳米管生物透析膜和Ⅱ型医用聚氨酯材料环上，在血栓形成仪上30 min旋转，测定血浆内血小板数P2，计算血小板黏附率^[21]。

1.5 主要观察指标

扫描电镜观察：取制备的通透二氧化钛纳米管薄膜，梯度乙醇逐级脱水、置换，干燥后喷金，利用扫描电镜观察薄膜形态。

LLC-PK1和ECV304细胞在薄膜表面的增殖：培养传代LLC-PK1和ECV304细胞，观察细胞在薄膜表面的增殖情况。

血液相容性：两种薄膜溶血实验、动态凝血时间实验及血小板黏附实验结果^[22]。

1.6 统计学分析采用SPSS 18.0软件处理，计量资料采用x(_)±s表示，行t 检验，P < 0.05提示差异有显著性意义。

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讨论

血液透析是目前临床上治疗急性、慢性肾功能衰竭最为有效的方法，该方法利用透析机代替人体肾脏完成血液净化目的^[23]。血液透析机从工作原理来说主要是利用半透膜，采用弥散、对流及过滤等方法将人体血液中的废弃物和过多的电解质交换经过透析膜实现交换，清除血液中的毒素，改善患者症状，减轻患者疼痛^[24]。因此，透析膜对于血液透析治疗效果的影响较大。常规透析膜多以高分子膜为主，该膜虽然能有效清除血液中的溶质，达到治疗的目的，但是对于小分子毒素滤过效果较差，临床死亡率较高^[25]。

随着医疗技术的不断发展，二氧化钛材料由于其优良的生物相容性被得到广泛运用。日本学者采用激光法制备二氧化钛颗粒并将其运用于肿瘤中获得理想效果，开启了二氧化钛纳米管生物透析膜的研究^[26]。实验以二氧化钛作为原始材料，利用阳极氧化法制备新型高强度二氧化钛纳米管薄膜，采用HF气体腐蚀获得两端通透的二氧化钛管阵列薄膜，结果显示：通透二氧化钛纳米管薄膜刚刚制备后存在少许纳米纤维碎片，超声处理后残留碎片被清洗，内径在100 nm左右，获得排布规整、管径均匀、表面平整的纳米管阵列。纳米管薄膜经阳极氧化后薄膜底部排列紧密，封口成六边形，并且封口有致密阻挡层；二氧化钛纳米管采用HF气体腐蚀后底部被腐蚀通透，获得两端通透的二氧化钛纳米管薄膜。同时，实验中购置LLC-PK1和ECV304细胞并进行分离培养，将其植入两端通透的二氧化钛纳米管薄膜中，结果显示：LLC-PK1和ECV304细胞移植到二氧化碳纳米管生物透析膜后细胞数目、形态均有所增加，并且均迅速铺展开，细胞多呈现黏附生长，在多个方向渗出细长的伪足，不易脱落。由此看出两端通透的二氧化钛纳米管薄膜在植入细胞后并未发生钙化现象，并且细胞在薄膜上不易脱落，具有抗凝作用，能为细胞在薄膜上生存和增殖提供良好的环境和空间^[27]。为了进一步验证制备的通透的二氧化钛纳米管薄膜生物相容性，实验中采用LLC-PK1和ECV304细胞进行溶血实验、动态凝血时间实验及血小板黏附实验等。结果显示：LLC-PK1细胞下通透二氧化钛纳米管薄膜的溶血率显著低于聚氨酯材料(P < 0.05)，ECV304细胞下通透二氧化钛纳米管薄膜的溶血率显著低于聚氨酯材料。由此看出：制备的新型透析膜具有较高的溶血率，在血液透析运用过程中并不会引起机体排斥反应，生物相容性较高。本研究中，2种材料在LLC-PK1和ECV304细胞下5 min及10 min动态凝血时间比较差异无显著性意义(P > 0.05)；通透二氧化钛纳米管薄膜移植LLC-PK1和ECV304细胞后20 min、40 min及70 min动态凝血时间长于聚氨酯材料(P < 0.05)。通透二氧化钛纳米管薄膜血小板黏附率分别14.93%和14.98，与聚氨酯材料15.77%相比差异无显著性意义(P > 0.05)。由此看出中空纤维材料具备良好的血液相容性特点，在血液透析中具有广泛的运用价值。同时，通透二氧化钛纳米管薄膜材料制备简单、便利，反应条件温和，能获得良好的传递特性，能较好的满足血液透析要求，使得该材料具有较大的发展潜力^[28-29]。

综上所述，利用阳极氧化法制备新型高强度二氧化钛纳米管薄膜，采用HF气体腐蚀获得两端通透的二氧化钛管阵列薄膜，向阵列薄膜上植入猪肾小管上皮细胞和血管内皮细胞，成功获得生物相容性优良的二氧化钛纳米管生物透析膜。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程