超声联合微泡增效骨髓间充质干细胞归巢治疗缺血性脑卒中

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.25.012

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (25): 4007-4012.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.25.012

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超声联合微泡增效骨髓间充质干细胞归巢治疗缺血性脑卒中

钱健，范国峰，徐鹏，李启明，沙杜鹃，王军，张均

南京大学医学院附属鼓楼医院急诊科，江苏省南京市 210008

修回日期:2017-03-10 出版日期:2017-09-08 发布日期:2017-10-09
通讯作者: 范国峰，硕士，主治医师，南京大学医学院附属鼓楼医院急诊科，江苏省南京市 210008
作者简介:钱健，男，1983 年生，江苏省南京市人，汉族，2015年南京医科大学毕业，主治医师，主要从事缺血性脑卒中与神经细胞修复研究。
基金资助:
南京市医学科技发展项目基金(YKK16100)；江苏省卫生厅青年科研课题(Q201306)

Ultrasound-mediated microbubble promotes bone marrow mesenchymal stem cell homing in the treatment of ischemic stroke

Qian Jian, Fan Guo-feng, Xu Peng, Li Qi-ming, Sha Du-juan, Wang Jun, Zhang Jun

Department of Emergency, Nanjing Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China

Revised:2017-03-10 Online:2017-09-08 Published:2017-10-09
Contact: Fan Guo-feng, Master, Attending physician, Department of Emergency, Nanjing Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China
About author:Qian Jian, Attending physician, Department of Emergency, Nanjing Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China
Supported by:
the Medical Development Foundation of Nanjing City, No. YKK16100; the Youth Scientific Research Project of Jiangsu Provincial Health Department, No. Q201306

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
超声微泡：是一种超声对比剂，结构包括核心及外壳2个部分，核心由二氧化碳、氧气、空气或大分子惰性气体等构成，外壳可由磷脂类化合物、白蛋白、糖类、非离子表面活性剂或可生物降解的高分子多聚物等不同材料组成。在疾病诊断上，它用于提高超声图像质量；在治疗上，它作为一种载体，与超声波相互作用产生生物学效应，实现所携带药物及基因等向靶向组织的传递释放，或利用声学空化效应增效干细胞或药物靶向进入组织。
干细胞归巢：是指自体或外源性干细胞在多种因素如免疫炎症反应过程中的多种趋化因子、生长因子及黏附分子的作用下，定向趋向性迁移穿过血管内皮细胞至靶向组织并定植存活的过程。

摘要
背景：国内外动物实验结果表明，超声微泡能够促进移植干细胞归巢到缺血区，增强血管新生和小动脉生成，改善缺血心肌局部血流量，恢复心肌收缩功能。
目的：探讨超声联合微泡对静脉移植骨髓间充质干细胞归巢的影响及治疗缺血性脑卒中的有效性。
方法：插线法建立大脑中动脉栓塞大鼠模型，建模72h后，随机分为4组：PBS组(n=15)，骨髓间充质干细胞组(n=18)，超声+骨髓间充质干细胞组(n=18)，超声+微泡+骨髓间充质干细胞组(n=18)。PBS组经尾静脉注射2mL PBS；骨髓间充质干细胞组将骨髓间充质干细胞(约3×10⁶)用2mL PBS稀释后经尾静脉缓慢注射；超声+骨髓间充质干细胞组经颅骨超声(频率1MHz，功率2W/cm²)辐照120s，给予骨髓间充质干细胞；超声+微泡+骨髓间充质干细胞组在超声辐照前静注微泡对比剂0.1mL/kg，再给予骨髓间充质干细胞。
结果与结论：①移植后48h，超声+微泡+骨髓间充质干细胞组细胞的脑内归巢率高于骨髓间充质干细胞组和超声+骨髓间充质干细胞组，差异均有显著性意义(P<0.05)；②造模后28d，超声+微泡+骨髓间充质干细胞组的神经损害程度较其余组轻，差异均有显著性意义(P<0.05)；③移植后7d，超声+微泡+骨髓间充质干细胞组的脑组织含水率较其余组低，差异均有显著性意义(P<0.05)；④移植后7d，超声+微泡+骨髓间充质干细胞组脑梗死体积较其余组小，差异有显著性意义(P<0.05)；⑤结果表明，超声联合微泡可促进骨髓间充质干细胞的脑内靶向归巢，能够减少脑水肿和脑梗死体积，改善神经功能评分，增效骨髓间充质干细胞移植治疗缺血性脑卒中的效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-2635-6019(范国峰)

关键词: 干细胞, 移植, 超声微泡, 骨髓间充质干细胞, 缺血性脑卒中, 归巢

Abstract:

BACKGROUND: In animal experiments, ultrasound-mediated microbubbles can promote the homing of transplanted stem cells to the ischemic area, enhance angiogenesis and small arterial formation, improve local blood flow in the ischemic myocardium and restore myocardial contractility.
OBJECTIVE: To investigate the effect of ultrasound-mediated microbubbles on intravenously transplanted bone marrow mesenchymal stem cell (BMSC) homing and the therapeutic efficiency on ischemic stroke.
METHODS: A middle cerebral artery occlusion (MCAO) model was induced by plug wire preparation. At 72 hours after MCAO, model rats were randomized into four groups: PBS group (n=15), BMSCs group (n=18), ultrasound+BMSCs group (n=18), ultrasound+microbubble+BMSCs group (n=18). Corresponding treatment was done in each group: 2 mL of PBS was injected via tail vein in the PBS group; about 3×10⁶ BMSCs diluted by 2 mL of PBS were injected via tail vein slowly in the BMSCs group; after skull ultrasound radiation (1 MHz, 2 W/cm²) for 120 seconds, BMSCs were injected via tail vein slowly in the ultrasound+BMSCs group; the same process as the ultrasound+BMSCs group was done following intravenous injection of 0.1 mL/kg microbubbles in the ultrasound+microbubble+BMSCs group.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Forty-eight hours after BMSCs transplantation, the BMSCs homing rate in the brain was significantly higher in the ultrasound+microbubble+BMSCs group than the other two groups (P < 0.05). (2) Twenty-eight days after MCAO, nerve damage was significantly milder in the ultrasound+microbubble+BMSCs group than the other two groups (P < 0.05). (3) Seven days after transplantation, the water content in the brain tissue was significantly lower in the ultrasound+microbubble+BMSCs group than the other two groups (P < 0.05). (4) Seven days after transplantation, the cerebral infarction volume was significantly reduced in the ultrasound+microbubble+BMSCs group compared with the other two groups (P < 0.05). To conclude, ultrasound-mediated microbubbles can enhance the homing effect of intravenously transplanted BMSCs, reduce cerebral edema and cerebral infarction volume, improve the neurological function, and increase the therapeutic effect of BMSCs transplantation on ischemic stroke.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Brain Ischemia, Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Microbubbles, Sonication, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

钱健，范国峰，徐鹏，李启明，沙杜鹃，王军，张均. 超声联合微泡增效骨髓间充质干细胞归巢治疗缺血性脑卒中[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(25): 4007-4012.

Qian Jian, Fan Guo-feng, Xu Peng, Li Qi-ming, Sha Du-juan, Wang Jun, Zhang Jun. Ultrasound-mediated microbubble promotes bone marrow mesenchymal stem cell homing in the treatment of ischemic stroke[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(25): 4007-4012.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 共实施造模SD大鼠76只。术中因完全切断颈总动脉失败2例，术后72 h以内因严重神经功能缺损死亡3只，继发颅内出血死亡2只，术后72 h共有69只大鼠存活，存活率为90.8%。存活72 h以上的大鼠进入分组实验，中途无脱落。

2.2 超声微泡干预增加骨髓间充质干细胞的归巢率 荧光显微镜观察各组大鼠脑缺血区域冰冻切片显示(图1)，缺血区脑组织内出现散在绿色荧光颗粒为GFP标记的骨髓间充质干细胞。超声+微泡+骨髓间充质干细胞组积分吸光度(224 363.87±19 723.97)明显高于骨髓间充质干细胞组(199 016.21±16 918.42)、超声+骨髓间充质干细胞组 (205 330.94±13 957.45)，差异有显著性意义(P < 0.05)，骨髓间充质干细胞组和超声+骨髓间充质干细胞组比较差异无显著性意义。提示超声+微泡+骨髓间充质干细胞组归巢细胞明显增多。

2.3 超声微泡干预减轻大脑中动脉栓塞模型大鼠神经损害严重程度 在造模后14 d，各组mNSS分值开始出现差异。骨髓间充质干细胞组、超声+骨髓间充质干细胞组在造模后14，21，28 d的神经损害程度均轻于PBS组，但仅28 d差异有显著性意义(P < 0.01)；超声+微泡+骨髓间充质干细胞组造模后14，21，28 d的神经损害程度均轻于PBS组，差异均有显著性意义(P < 0.01)；超声+微泡+骨髓间充质干细胞组造模后28 d的神经损害程度较骨髓间充质干细胞组、超声+骨髓间充质干细胞组更轻，差异均有显著性意义(P < 0.05)；骨髓间充质干细胞组、超声+骨髓间充质干细胞组比较差异均无显著性意义，见表1。

2.4 超声微泡干预降低大脑中动脉栓塞模型大鼠脑组织含水率 各组大鼠脑组织含水率在造模后升高。在造模后 6 d即干细胞移植后3 d为著，并可见移植后7 d含水率降低。在移植后1，3 d，各组含水率差异无显著性意义(P > 0.05)；在移植后7 d，各组含水率均较PBS组低，与骨髓间充质干细胞组、超声+骨髓间充质干细胞组比较，超声+微泡+骨髓间充质干细胞组含水率显著降低，其差异有显著性意义(P < 0.05)；骨髓间充质干细胞组、超声+骨髓间充质干细胞组比较差异均无显著性意义，见表2。

2.5 超声微泡干预缩小大脑中动脉栓塞模型大鼠脑梗死体积 细胞移植后7 d(造模后10 d)梗死累及范围主要为额顶叶的背外侧皮质、尾壳核、下丘脑部分，严重时累及到海马区(图2)。测量后发现超声+微泡+骨髓间充质干细胞组脑梗死体积为(15.40±0.88)%，与骨髓间充质干细胞组(17.00±0.63)%，超声+骨髓间充质干细胞组(17.31± 0.95)%，PBS组(19.51±1.10)%比较，梗死体积明显缩小，差异有显著性意义(均P < 0.05)，见表3。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年6至10月在南京鼓楼医院科研部实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 经慢病毒GFP质粒转染的雄性SD大鼠2只，5周龄，体质量100-150 g；SPF级雄性SD大鼠69只，2.5个月龄，体质量240-270 g，由南京鼓楼医院实验动物中心提供。

1.3.2 主要试剂及仪器 胎牛血清(美国Hyclone公司)；0.25%胰酶(美国Gibco公司)；L-DMEM 培养液(美国Hyclone公司)；淋巴细胞分离液Ficoll-Paque(天津灏洋生物公司)；抗大鼠FITC-CD44(美国MyBioSource公司)；抗大鼠FITC-CD34(美国Beckman Coulter公司)；抗大鼠FITC-CD29、FITC-CD45(美国BioLegend公司)；流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)；TTC试剂盒(南京建成生物工程研究所)；光学显微镜(日本OLYMPUS公司)；倒置相差显微镜(重庆光学仪器厂)；荧光正立显微镜(日本Nikon公司)；超声波治疗仪(北京中西远大化玻仪器有限公司)；微泡对比剂(六氟化硫微泡)(瑞士Bracco Suisse SA)。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及鉴定

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离、培养：取GFP质粒转染的2只SD大鼠断颈处死，以体积分数75%乙醇浸泡全身消毒10 min，超净台上分离取出胫骨和股骨，剪去骨骺端，露出骨髓腔，PBS冲出骨髓，将骨髓悬液加入到相同体积、密度为1.073 kg/L的淋巴细胞分离液上层，400×g离心20 min，收集界面层，用含有体积分数10%胎牛血清的L-DMEM重悬，于设定温度37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱内培养。48 h后换液，弃未贴壁细胞，以后1周换液2次，待细胞达80%-90%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化后按1︰2传代，进行体外扩增。

大鼠骨髓间充质干细胞流式细胞学鉴定：取培养至第3代生长良好的骨髓间充质干细胞，经0.25%胰酶消化、离心收集细胞，调整细胞浓度为1×10¹⁰ L^-¹。经形态学观察及流式细胞仪检测表面分子标记CD34、CD45、CD29、CD44表达进行鉴定。

1.4.2 大鼠大脑中动脉栓塞模型制备 线栓法制作大鼠大脑中动脉阻塞模型，具体方法详见参考文献[10-11]。大脑中动脉栓塞后2 h，再灌注前采用Longa 5等级法对大鼠神经功能进行评分^[12]。得分为2分或3分为造模成功。缺血2 h再次麻醉造模成功的大鼠，抽出栓塞线段至颈外动脉处，遇到阻力即停止。扎紧丝线，剪断血管外多余的丝线，实现再灌注。术中及术毕2 h内用60 W的白炽灯垂直距离50 cm照射大鼠，使其肛温保持(37.0±0.5) ℃。

1.4.3 实验分组与干预 69只造模成功大鼠，随机分为对照组(PBS组，n=15)，骨髓间充质干细胞组(n=18)，超声+骨髓间充质干细胞组(n=18)，超声+微泡+骨髓间充质干细胞组(n=18)。于造模后72 h建立大鼠尾静脉通路，进行如下干预：PBS组直接经尾静脉注射2 mL PBS，骨髓间充质干细胞组将骨髓间充质干细胞(约3×10⁶)用2 mL PBS稀释后经尾静脉缓慢注射^[13]；超声+骨髓间充质干细胞组大鼠颅顶脱毛，超声耦合剂将超声探头与颅骨紧密结合，超声(1 MHz，2 W/cm²，作用时间120 s)作用后，将骨髓间充质干细胞(约3×10⁶)用2 mL PBS稀释后经尾静脉缓慢注射；超声+微泡+骨髓间充质干细胞组经尾静脉注入微泡对比剂0.1 mL/kg，同样超声干预后将骨髓间充质干细胞(约3×10⁶)用2 mL PBS稀释后经尾静脉缓慢注射。

1.4.4 荧光显微镜观察各组GFP标记骨髓间充质干细胞的归巢 骨髓间充质干细胞移植48 h后，处死除PBS组以外的其他3组大鼠(n=3)，取出全脑组织后冷冻，于冠状面漏斗柄层面制成厚度约7 μm的冰冻切片，荧光显微镜下观察右侧基底节脑卒中区域及其周围区域的GFP绿色荧光标记情况。每只大鼠取3张切片，每张切片200倍荧光显微镜下拍摄3张照片，采用Image Pro Plus 6.0数码图像分析系统软件处理后计算各组缺血区绿色荧光积分吸光度，统计分析各组骨髓间充质干细胞移植后的归巢情况。

1.4.5 评价大鼠神经损害严重程度 每组取6只大鼠，分别于造模后1，7，14，21，28 d进行改良神经功能缺损评分(modified Neurological Severity Scores，mNSS)^[6]，观察各组大鼠神经功能损害程度的动态变化。

1.4.6 干湿重法测定脑组织含水率 移植后1，3，7 d各组取3只大鼠，处死后迅速断头，完整取脑，去除嗅球、小脑和低位脑干，置于培养皿中，滤纸吸干表面水分，电子天平精确称量湿重，然后置于95 ℃烘箱内烘干24 h至恒重，电子天平精确称量干重。干湿重法计算脑组织含水率。脑组织含水率=(湿重-干重)/湿重×100% ^[14]。

1.4.7 TTC染色法计算脑梗死体积占全脑体积比 以2,3,5-氯化三苯基四氮唑蓝(triphenyl tetrazolium chloride，TTC)对各组脑组织染色^[15]，根据染色结果测定脑梗死体积。于移植后7 d各组取3只大鼠，处死后迅速断头，完整取脑，-70 ℃快速冷冻。自前向后将大鼠脑连续切成5片，第一刀在脑前极与视交叉连线中点处，第二刀在视交叉部位，第三刀在漏斗柄部位，第四刀在漏斗柄与后叶尾极之间。放入1%的TTC磷酸缓冲液中，37 ℃避光染色30 min，PBS冲洗后置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定保存。正常脑组织染为红色，梗死组织为白色。爱普生扫描仪1 200 dpi分辨率扫描标本。图像经过Image Pro Plus 6.0数码图像分析系统软件处理，计算梗死体积占全脑体积比。

1.5 主要观察指标 ①骨髓间充质干细胞的归巢率；②神经损害严重程度；③脑组织含水率；④梗死体积占全脑体积比。

1.6 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件包进行数据分析，计量资料数据以均值±标准误(Mean±SEM)表示。服从正态分布的计量资料2组比较采用成组t 检验；3组及以上比较采用单因素方差分析(One way ANOVA)；组间两两比较采用Student Newman Keuls(SNK)检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

采用颈内动脉线栓法制备大脑中动脉栓塞模型，模拟体内缺血。日本学者Koizumi等^[16]于1986年首次采用不开颅经颈内动脉栓入尼龙线致大脑中动脉栓塞获得成功，后经Longa的适当改进^[12]，该动物模型被公认为实验性局灶性脑缺血标准模型。该模型不会像诸如颈内动脉注射栓塞剂栓塞一类的方法，会造成永久脑栓塞，优点是可形成脑缺血损伤后再灌注，更符合人类脑梗死或溶栓药物治疗后血管再通的机制。

骨髓间充质干细胞是骨髓中具有自我更新和多向分化潜能的一系列基质干细胞的混合群体，在体内其主要作用是构成骨髓造血干细胞的微环境。实验研究表明，大脑中动脉缺血损伤后24 h尾静脉注射骨髓间充质干细胞，大鼠行为功能恢复明显增强^[7]；即使1个月后静脉注射骨髓间充质干细胞治疗，仍可观察到相似的治疗益处^[17]，并可持续1年以上^[18]；而且，骨髓间充质干细胞早期干预治疗的神经保护作用更强^[19]。因此，将自身骨髓间充质干细胞进行体外培养和扩增，然后移植到患者体内，是治疗缺血性脑卒中的潜在可行的理想手段。

然而，脑梗死患者骨髓干细胞数量减少、功能低下，同时存在血脑屏障，移植细胞迁移至梗死区能够存活并分化的数量仍很少，动物实验提示只有移植细胞数的1.6%-3.2%^[2-3]。因此，如何将更多骨髓间充质干细胞移植到需要的区域，即归巢至缺血梗死区，提高其移植治疗的效率是尚未解决的重要科学问题。目前研究解决方案集中在以下几方面：①选择合适的移植途径^[20-21]：脑实质内或梗死液化腔内立体定向注射、外周静脉注射、经颈内动脉注射、脑池或脑室内移植是已知的几种移植方法。其中经外周静脉和颈内动脉注射干细胞的研究相对较多，但其移植效率仍然很低；②将单次干细胞移植改成反复多次移植；③应用一些细胞因子和趋化因子提高骨髓间充质干细胞归巢能力：如用基因转染方法对骨髓间充质干细胞进行基因修饰表达血管内皮生长因子、CXCR4等。然而，后2种方法的实施存在成本高、创伤大、安全性低等缺点，并仍在动物实验探索阶段。近期国内外动物实验结果表明，超声微泡能够促进移植干细胞归巢到缺血区，增强血管新生和小动脉生成，改善缺血骨骼肌和心肌局部血流量，恢复心肌收缩功能和骨骼肌运动功能^[8^，^22-23]。此外，已有实验证实，超声波作用下血脑屏障通透性一过性增加^[24]，有利于化疗药物、治疗性抗体进入脑内发挥治疗作用。

实验结果表明，经静脉注射移植骨髓间充质干细胞能够改善脑梗死后28 d神经功能损害程度，而超声联合微泡作用后移植骨髓间充质干细胞，能够在干预后14 d进一步改善神经损害程度，且超声微泡干预可降低脑组织含水率和脑梗死体积。因此，超声联合微泡作用下移植骨髓间充质干细胞，能够更有效的减轻脑梗死后脑水肿和梗死体积，促进梗死后大鼠神经功能恢复，可能与其能够增加骨髓间充质干细胞脑内归巢数量有关。超声微泡促进移植干细胞脑内归巢增多的机制目前仍不明确，有研究表明：超声微泡能够使血管内皮细胞间隙增宽，血脑屏障通透性增高^[25]，并可能引起某些细胞因子或趋化因子表达增加，如神经营养因子、血管内皮生长因子^[4]、内源性促红细胞生成素^[26]、突触素、基质细胞衍生因子1、一氧化氮^[27-28]，这些因素均有利于骨髓间充质干细胞向脑内缺血梗死区归巢，促进局部血管生成以及形成新的神经突触细胞。

综上所述，骨髓间充质干细胞经静脉移植有助于大鼠缺血性脑组织的修复，减少梗死脑组织含水率，缩小脑梗死体积，改善神经功能；而超声微泡可增加移植干细胞在大鼠缺血再灌注损伤脑组织内的归巢率，提高干细胞治疗缺血性脑卒中的效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

超声联合微泡增效骨髓间充质干细胞归巢治疗缺血性脑卒中

Ultrasound-mediated microbubble promotes bone marrow mesenchymal stem cell homing in the treatment of ischemic stroke

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