特异性干扰TACC3基因表达对CD133+CD44+口腔鳞癌干细胞增殖及凋亡的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.25.010

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (25): 3995-4000.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.25.010

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特异性干扰TACC3基因表达对CD133⁺CD44⁺口腔鳞癌干细胞增殖及凋亡的影响

段瑞，李永生，夏翼超

云南省第一人民医院口腔颌面外科，云南省昆明市 650032

修回日期:2017-04-14 出版日期:2017-09-08 发布日期:2017-10-09
通讯作者: 李永生，主任医师，博士，云南省第一人民医院口腔颌面外科，云南省昆明市 650032
作者简介:段瑞，女，1976年生，云南省昆明市人，硕士，主治医师，主要从事口腔颌面部肿瘤诊治方向的研究。
基金资助:
昆明医科大学应用基础联合专项基金面上项目

Effects of specific interfering TACC3 gene expression on proliferation and apoptosis of CD133⁺CD44⁺ oral squamous cell carcinoma cells

Duan Rui, Li Yong-sheng, Xia Yi-chao

Department of Oral and Maxillofacial Surgery, First People’s Hospital of Yunnan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China

Revised:2017-04-14 Online:2017-09-08 Published:2017-10-09
Contact: Li Yong-sheng, M.D., Chief physician, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, First People’s Hospital of Yunnan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China
About author:Duan Rui, Master, Attending physician, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, First People’s Hospital of Yunnan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China
Supported by:
the Application-Basis Joint Special Fund of Kunming Medical University

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
TACC3：是TACC蛋白家族成员之一，是细胞分裂过程中的重要分子。TACC3可通过调控微管蛋白质的组成，进而影响细胞的有丝分裂及染色体的稳定性。多项研究表明，在人类的乳腺和卵巢组织肿瘤中TACC3表达上调，用紫杉醇治疗宫颈癌和乳腺癌后TACC3的表达明显下调。体外特异性干预TACC3的表达，可有效抑制肿瘤细胞的生长，降低化疗耐药。
肿瘤干细胞的分离培养方法：主要有2种，一种是利用流式细胞仪或免疫磁珠对细胞表面表达特定的抗原分子等阳性细胞进行富集，得到含量较高的肿瘤干细胞；另一种方法是使用无血清培养基培养，通过非干细胞凋亡而干细胞成球的特性筛选出肿瘤干细胞。

摘要
背景：研究表明，TACC3基因在多种肿瘤中均表达上调，因此体外特异性干预TACC3的表达，可能是治疗或干预肿瘤生长的重要靶点。
目的：探讨沉默TACC3基因表达对口腔鳞癌干细胞增殖和凋亡的影响。
方法：采用免疫磁珠分选技术从人口腔鳞癌细胞Cal-27中分选出CD133⁺CD44⁺口腔鳞癌干细胞。shRNA转染组设计及合成TACC3 shRNA序列，利用Lipofectamine^TM2000将TACC3 shRNA序列转染至CD133⁺ CD44⁺口腔鳞癌干细胞，设置空载体转染阴性对照组和未转染组。转染48 h后，采用MTT、细胞克隆形成实验、TUNEL凋亡实验检测沉默TACC3基因对体外CD133⁺CD44⁺口腔鳞癌干细胞增殖、凋亡的影响；Western blot检测沉默TACC3基因对CD133⁺CD44⁺口腔鳞癌干细胞Ki67、Bax、Bcl-2蛋白表达的影响。
结果与结论：①细胞增殖：shRNA转染组细胞增殖速度、增殖相关蛋白Ki67表达水平明显低于阴性对照组和未转染组(P < 0.05)；②细胞克隆形成能力：shRNA转染组细胞克隆形成能力显著低于阴性对照组和未转染组(P < 0.05)；③细胞凋亡：shRNA转染组细胞凋亡高于阴性对照组和未转染组，促凋亡蛋白Bax水平高于未转染组、对照组，抗凋亡蛋白Bcl-2表达低于阴性对照组和未转染组；④结果表明：干扰抑制TACC3基因表达，可抑制口腔鳞癌干细胞的增殖，促进其凋亡。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-0679-3091(李永生)

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 人口腔鳞癌, TACC3, 增殖, 凋亡

Abstract:

BACKGROUND: Studies have indicated that the abnormal expression of TACC3 is closely related to the occurrence and development of many kinds of tumors, and the expression of TACC3 is up-regulated in these tumors. Therefore, in vitro specific inhibition of TACC3 expression may become an important target for the treatment or intervention of tumor growth.
OBJECTIVE: To investigate the mechanism by which TACC3 gene expression regulates cell proliferation and apoptosis in oral squamous cell carcinoma.
METHODS: CD133⁺CD44⁺ oral squamous cell carcinoma cells were sorted from human oral squamous cell carcinoma cell line Cal-27 by immunomagnetic beads. In experimental group, the shRNA sequence of TACC3 was designed and synthesized, which was then trasnfected into CD133⁺CD44⁺ oral cancer stem cells by Lipofectamine^TM 2000. Empty vector-trasnfected (negative control) and untransfected cells were used as callsed. Forty-eight hours after the transfection, effects of TACC3 gene silencing on proliferation and apoptosis in vitro in CD133⁺CD44⁺ oral squamous cell carcinoma were detected by MTT, clone formation test, and TUNEL assay. Western blot assay was used to detect the effect of TACC3 gene silencing on Ki67, Bax and Bcl-2 protein expression in CD133⁺CD44⁺ oral squamous cell carcinoma.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Cell proliferation. The proliferation rate and expression level of Ki67 were significantly lower in the experimental group than the negative control and untransfected groups (P < 0.05). (2) Clone formation. The clone formation ability in the experimental group was significantly lower than that in the negative control and untransfected groups (P < 0.05). (3) Cell apoptosis. TACC3 gene silencing caused an obvious decrease in Bcl-2 protein expression and a significant increase in Bax protein expression. These findings further confirmed that specific interference of TACC3 gene expression could inhibit the proliferation of CD133⁺CD44⁺ cells and promote the apoptosis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Neoplastic Stem Cells, Mouth Neoplasms, Cell Proliferation

中图分类号:

R394.2

段瑞，李永生，夏翼超. 特异性干扰TACC3基因表达对CD133⁺CD44⁺口腔鳞癌干细胞增殖及凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(25): 3995-4000.

Duan Rui, Li Yong-sheng, Xia Yi-chao. Effects of specific interfering TACC3 gene expression on proliferation and apoptosis of CD133⁺CD44⁺ oral squamous cell carcinoma cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(25): 3995-4000.

图/表（结果） 1

2.1 口腔鳞癌干细胞的分离与鉴定 利用免疫磁珠分选技术，从人口腔鳞癌细胞系Cal-27中分选获得CD133⁺CD44⁺和CD133^-CD44^-两种细胞。为进一步鉴定上述细胞的干细胞特性，采用Western blot实验检测了与干性相关基因(SOX2、NANOG、OCT4)的表达。结果显示，相比于CD133^-CD44^-的人口腔鳞癌细胞，CD133⁺CD44⁺口腔鳞癌细胞内SOX2、NANOG、OCT4均呈现高表达，见图1。以上结果提示CD133⁺CD44⁺双阳性细胞为口腔鳞癌干细胞。

采用Western blot检测TACC3在CD133⁺CD44⁺和CD133^-CD44^-口腔鳞癌细胞中的表达情况。结果显示，相比于CD133^-CD44^-口腔鳞癌细胞，CD133⁺CD44⁺口腔鳞癌干细胞中TACC3的表达明显上调(0.55±0.16，0.26±0.20，P < 0.05)，见图2。

2.2 shRNA抑制口腔鳞癌干细胞TACC3表达 Western blot实验结果显示，RNA干扰后，CD133⁺CD44⁺口腔鳞癌干细胞内TACC3蛋白表达显著降低(图3)。

2.3 shRNA干扰抑制TACC3表达对CD133⁺CD44⁺口腔鳞癌干细胞增殖的影响 MTT检测结果发现，shRNA转染组TACC3基因沉默后CD133⁺CD44⁺口腔鳞癌干细胞的增殖速度明显低于未转染组和阴性对照组(图4A)。此外，采用Western blot检测增殖相关蛋白Ki67在细胞中的表达水平，发现shRNA转染组细胞中Ki67蛋白表达水平明显低于未转染组和阴性对照组(图4B)。

2.4 shRNA干扰抑制TACC3表达对CD133⁺CD44⁺口腔鳞癌干细胞克隆形成能力的影响 相比于未转染组和阴性对照组，shRNA转染组CD133⁺CD44⁺口腔鳞癌干细胞克隆形成能力显著下调(图5)。

2.5 shRNA干扰抑制TACC3表达对CD133⁺CD44⁺口腔鳞癌干细胞凋亡的影响 相比于未转染组和阴性对照组，shRNA转染组更易于凋亡(图6A)。Western blot实验结果显示，shRNA转染组口腔鳞癌干细胞促凋亡蛋白Bax表达水平显著高于未转染组和阴性对照组，而抗凋亡蛋白Bcl-2表达则相反(图6B)。

参考文献

[1] Metcalfe E,Aspin L,Speight R,et al.Postoperative (Chemo)Radiotherapy for Oral Cavity Squamous Cell Carcinomas: Outcomes and Patterns of Failure.Clin Oncol(R Coll Radiol).2017;29(1):51-59.

[2] Parajuli H,Teh MT,Abrahamsen S,et al.Integrin alpha11 is overexpressed by tumour stroma of head and neck squamous cell carcinoma and correlates positively with alpha smooth muscle actin expression.J Oral Pathol Med.2016. doi:10.1111/jop.12493.[Epub ahead of print]

[3] Reddy SS,SharmaS,Mysorekar V. Expression of Epstein Barr Virus among oral potentially malignant disorders and oral squamous cell carcinomas in the South Indian tobacco chewing population.J Oral Pathol Med.2016.doi: 10.1111/jop.12508. [Epub ahead of print]

[4] Shen L,Liu L,Ge L,et al.miR-448 downregulates MPPED2 to promote cancer proliferation and inhibit apoptosis in oral squamous cell carcinoma.Exp Ther Med.2016;12:2747-2752.

[5] Hamburger AW,Salmon SE.Primary bioassay of human tumor stem cells.Science. 1977;197(4302):461-463.

[6] Valent P,Bonnet D,De Maria R,et al.Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details.Nat Rev Cancer.2012;12(11):767-775.

[7] Li Q,Yao Y,Eades G,et al.Downregulation of miR-140 promotes cancer stem cell formation in basal-like early stage breast cancer.Oncogene.2014;33(20):2589-2600.

[8] 蔡传书,王培荣,黄雄,等.5种肿瘤干细胞标志物在非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义[J].中国老年学杂志,2016,36(23): 5905-5907.

[9] 孔令帅,温树信,高伟,等.喉癌Hep-2细胞CD44+CD133+生物学特性研究[J].中国现代医药杂志,2016,18(3):1-6.

[10] Brescia P,Ortensi B,Fornasari L,et al.CD133 is essential for glioblastoma stem cell maintenance.Stem Cells.2013;31(5): 857-869.

[11] 陈超,葛明华,王可敬,等.悬浮培养法富集头颈部鳞癌肿瘤干细胞及其功能研究[J].中华肿瘤杂志,2014,36(1):17-22.

[12] Raff JW.Centrosomes and cancer:lessons from a TACC.Trends Cell Biol.2002; 12(5):222-225.

[13] Piekorz RP,Hoffmeyer A,Duntsch CD,et al.The centrosomal protein TACC3 is essential for hematopoietic stem cell function and genetically interfaces with p53 regulated apoptosis. EMBO J.2002;21(4):653-664.

[14] Lauffart B,Vaughan MM,Eddy R,et al.Aberrations of TACC1 and TACC3 are associated with ovarian cancer.BMC Womens Health.2005;5:8.

[15] Nahm JH,Kim H,Lee H,et al.Transforming acidic coiled-coil-containing protein 3 (TACC3) overexpression in hepatocellular carcinomas is associated with "stemness" and epithelial-mesenchymal transition-related marker expression and a poor prognosis. Tumour Biol.2016;37:393-403.

[16] Zhou DS,Wang HB,Zhou ZG,et al.TACC3 promotes stemness and is a potential therapeutic target in hepatocellular carcinoma.Oncotarget.2015;6:24163-24177.

[17] 杨俊岭,高伟,王珏,等.喉癌TU177细胞系中CD133+CD44+肿瘤干细胞分选及特性分析[J].智慧健康,2016,2(1):5-8.

[18] 孔令帅,温树信,高伟,等.喉癌Hep-2细胞CD44+CD133+生物学特性研究[J].中国现代医药杂志,2016,18(3):1-6.

[19] 龚锐,李胜英,霍志霞,等.自制免疫磁珠在前列腺肿瘤组织干细胞提取中的应用[J].中国组织工程研究,2016,20(1):36-41.

[20] 秦亮,陈安民,郭风劲,等.免疫磁珠法分离并鉴定前列腺癌类干细胞[J].中华全科医学,2013,11(3):336-337,340.

[21] Fu W,Tao W,Zheng P,et al.Clathrin recruits phosphorylated TACC3 to spindle poles for bipolar spindle assembly and chromosome alignment.J Cell Sci.2010;123(Pt 21): 3645-3651.

[22] 曾亚,王新平,中月明,等.胃癌组织中Aurora-A及TACC3的表达及意义[J].实用预防医学,2016,23(10):1257-1259.

[23] 侯婧,刘胜春,李鹍鹏,等.TACC3 mRNA及蛋白在乳腺癌中的表达及其临床意义[J].中国肿瘤临床,2012,39(20):1535-1538.

[24] Mahdipour M,Leitoguinho AR,Zacarias Silva RA,et al.TACC3 Is Important for Correct Progression of Meiosis in Bovine Oocytes.PLoS One.2015;10:e0132591.

[25] Piekorz RP,Hoffmeyer A,Duntsch CD,et al.The centrosomal protein TACC3 is essential for hematopoietic stem cell function and genetically interfaces with p53-regulated apoptosis.EMBO J.2002;21:653-664.

[26] Schneider L,Essmann F,Kletke A,et al.TACC3 depletion sensitizes to paclitaxel-induced cell death and overrides p21WAF-mediated cell cycle arrest.Oncogene.2008;27: 116-125.

[27] Suhail TV,Singh P,Manna TK.Suppression of centrosome protein TACC3 induces G1 arrest and cell death through activation of p38-p53-p21 stress signaling pathway.Eur J Cell Biol.2015;94:90-100.

[28] Piekorz RP,Hoffmeyer A,Duntsch CD,et al.The centrosomal protein TACC3 is essential for hematopoietic stem cell function and genetically interfaces with p53-regulated apoptosis .EMBO J.2002;21(4):653-664.

[29] Gómez-Baldó L1,Schmidt S,Maxwell CA,et al.TACC3-TSC2 maintains nuclear envelope structure and controls cell division.Cell Cycle.2010;9(6):1143-1155.

引言

鳞状细胞癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤^[1-3]，手术根治性切除是目前最有效的治疗手段之一，但是晚期、复发或已转移的患者预后很差，平均生存率很低^[4]，晚期患者5年生存率仅为20%-40%，治疗效果不显著，因此，对其发生和发展机制深入研究，寻找新的治疗手段是亟待解决的问题。

肿瘤干细胞是肿瘤细胞群体中一类具有无限增殖、自我更新、多系分化的细胞群体，其在肿瘤的发生、发展、侵袭、转移、耐药及复发方面均扮演重要角色^[5-6]。目前，研究显示多种肿瘤中存在肿瘤干细胞，如胃癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌、肺癌等^[7]。CD44和CD133是2个公认度较高的细胞表面标志物，蔡传书等^[8]研究表明，非小细胞肺癌组织中肿瘤干细胞标志物 CD133、CD44、TROP-2、ABCG2及p75NTR的表达水平异常，且均与非小细胞肺癌肿瘤细胞分化密切相关。孔令帅等^[9]研究表明CD44⁺CD133⁺细胞亚群具有明显的肿瘤干细胞特征。肿瘤干细胞的分离培养方法主要有2种，一种是利用流式细胞仪或免疫磁珠对细胞表面表达特定的抗原分子等阳性细胞进行富集，得到含量较高的肿瘤干细胞；另一种方法是使用无血清培养基培养，通过非干细胞凋亡而干细胞成球的特性筛选出肿瘤干细胞^[10-11]。此次实验使用免疫磁珠分选技术从人口腔鳞癌细胞系Cal-27中分选出CD133和CD44双阳性细胞即口腔鳞癌干细胞(CD133⁺CD44⁺)和双阴性细胞(CD133^-CD44^-)。

TACC3是TACC蛋白家族成员之一，是细胞分裂过程中的重要分子。TACC3可通过调控微管蛋白质的组成，进而影响细胞的有丝分裂及染色体的稳定性^[12]。多项研究表明，在人类的乳腺和卵巢组织肿瘤中TACC3表达上调，用紫杉醇治疗宫颈癌和乳腺癌后TACC3的表达明显下调^[13-15]。体外特异性干预TACC3的表达，可有效抑制肿瘤细胞的生长，降低化疗耐药^[15-16]。因此，实验探讨沉默TACC3基因表达调控口腔鳞癌干细胞增殖和凋亡的机制，为口腔癌的治疗提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外细胞分子生物学实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年3至7月在云南省第一人民医院完成。

1.3 材料 人口腔鳞癌细胞Cal-27购买于美国ATCC公司；胎牛血清、二甲基亚砜、MTT(美国Gibco公司)；DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶(美国Hyclone公司)；WNT通路抑制剂(美国Gibco公司)；青霉素、链霉素、蛋白裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、ECL蛋白发光液(上海碧云天公司)；TACC3单克隆抗体、Ki67单克隆抗体、Bax单克隆抗体、Bcl-2单克隆抗体(英国Abcam公司)；小鼠抗人CD133抗体、小鼠抗人CD44抗体(德国Miltenyi公司)；细胞培养箱(美国Thermo公司)；Annexin-V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(美国Biovision公司)；流式细胞仪(美国BD公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养 将液氮冻存的Cal-27细胞于37 ℃水浴中复苏，接种于DMEM完全培养液，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂、相对湿度95%的培养箱中培养，待细胞生长至80%左右融合时，加入胰酶进行消化，然后800 r/min离心5 min，收集细胞，加入DMEM完全培养液培养。

1.4.2 CD133⁺CD44⁺口腔鳞癌干细胞的分选 将处于对数生长期的Cal-27细胞用PBS冲洗，然后进行消化重悬，用包被小鼠抗人CD133抗体的磁珠进行孵育，过分选柱分选获得CD133⁺和CD133^-细胞。再用小鼠抗人CD44抗体孵育收获的CD133⁺和CD133^-细胞，之后用包被大鼠抗小鼠IgG1抗体的磁珠进行孵育，最后过分选柱分选获得CD133⁺CD44⁺和CD133^-CD44^-细胞。将磁珠分选后的细胞加入到无血清细胞培养基中(含10 μg/L重组人碱性成纤维细胞生长因子和20 μg/L重组人表皮细胞生长因子的DMEM培养基)，置于体积分数为5%CO₂、37 ℃恒温条件培养。

1.4.3 Western blot实验检测干性相关基因(OCT4、SOX2及NANOG)和TACC3的表达 收集培养CD133⁺CD44⁺口腔鳞癌干细胞与CD133^-CD44^-口腔鳞癌细胞，PBS洗涤2次，用RIPA裂解液裂解细胞获得总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白含量。蛋白样品加入上样缓冲液煮沸5 min后，取50 μg进行15%SDS-PAGE电泳，PVDF膜转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗(小鼠抗人TACC3、OCT4、SOX2、NANOG)稀释液4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，每次10 min，加入二抗37 ℃孵育1 h，TBST洗涤3次，每次10 min，ECL化学发光显色，GAPDH作为内参，凝胶成像系统拍照成像。蛋白表达含量采取Biomad western分析仪自动分析。

1.4.4 shRNA的设计、合成及细胞转染 设计的TACC3基因的shRNA序列由美国Santa Cruz公司合成。TACC3的shRNA序列，其正义链为：5’-GAC TGG ACC TGG AAG TTG TTC TTC AAG TCT TAA AVC TGA AGT TCC TTA CTA TAT GTC CTT TAT ATG-3’；反义链为：5’-CTG ACT ATA AAG AGT TCC TTA CCT CTC TTC AAG GAA TTC TTC AAG CGT CCT TGA TAT CC -3’。

选择对数生长期的CD133⁺CD44⁺口腔鳞癌干细胞，PBS洗涤，加入胰蛋白酶消化，离心弃上清，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液制成单细胞悬液，并以每孔2×10⁵的细胞密度接种于6孔板中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度的培养箱中，当细胞融合达60%左右时，弃去旧培养液，按照说明书操作，shRNA转染组利用脂质体法(Lipofectamine^TM2000)将TACC3基因的shRNA瞬时转染至细胞中，于转染后48 h收集细胞，采用Western blot实验检测RNA干扰效应。设置转染空载体阴性对照组和未转染组。

1.4.5 MTT法检测细胞增殖能力 于转染48 h后收集生长状态良好的CD133⁺CD44⁺口腔鳞癌干细胞，以3×10³/孔的密度接种到96孔板培养板中，每孔200 μL，置于体积分数为5%CO₂、37 ℃的恒温培养箱培养1，2，3，4 d，每孔中加入5 g/L MTT溶液10 μL，37 ℃培养4 h，小心吸弃孔内培养基，加入二甲基亚砜150 μL，轻微振荡10 min使结晶物充分溶解，酶标仪上测定490 nm波长处各孔吸光度值。

1.4.6 平板克隆形成实验 于转染48 h将上述分离的CD133⁺CD44⁺口腔鳞癌干细胞接种于6孔培养板中，每孔 1 000个细胞，在37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培养2周，待出现细胞克隆时终止培养，弃去培养液，采用D-Hank’s液冲洗2次，苏木精染色15 min，流水洗去染液，在显微镜下观察计数> 50个细胞的细胞克隆。克隆形成率=形成克隆数/接种细胞数×100%。

1.4.7 TUNEL法检测细胞凋亡 于转染48 h后收集生长状态良好的CD133⁺CD44⁺口腔鳞癌干细胞，进行细胞爬片，吸弃培养液，自然晾干后用40 g/L多聚甲醛溶液固定，经新鲜配制体积分数为3%H₂O₂室温处理，0.1% TritonX-100(溶于0.1%枸橼酸钠溶液)打孔，按TUNEL试剂盒步骤说明操作，DAB显色，苏木精轻度复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，再以中性树胶封固，荧光显微镜下观察凋亡情况。

1.4.8 Western blot实验检测相关蛋白的表达 于转染 48 h后收集生长状态良好的CD133⁺CD44⁺口腔鳞癌干细胞，PBS洗涤2次，用RIPA裂解液裂解细胞获得总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白含量。采用15%SDS-PAGE进行电泳，PVDF膜转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗(Ki67抗体、Bax抗体、Bcl-2单克隆抗体)稀释液4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，每次10 min，加入二抗37 ℃孵育1 h，TBST洗涤3次，每次10 min，ECL化学发光显色，GAPDH作为内参，凝胶成像系统拍照成像。蛋白表达含量采取Biomad western分析仪自动分析。

1.5 主要观察指标 沉默TACC3基因表达对口腔鳞癌干细胞增殖和凋亡的影响。

1.6 统计学分析 研究数值均用Graph Pad 6.0软件，各组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

恶性肿瘤是口腔颌面部常见的致死性疾病，尽管随着各种治疗方法和手段的不断发展，口腔癌患者的生存质量得到了一定改善，但患者的5年生存率仍较低。传统的肿瘤手术治疗结合放化疗后出现肿瘤复发现象，被认为是肿瘤中极少数肿瘤干细胞类细胞耐受甚至逃逸射线或药物的杀伤作用，最终导致肿瘤的复发和转移，探索新的治疗方法和提高生存率及生存治疗仍然是目前的努力方向。

肿瘤干细胞学说给予鳞癌诊断和治疗以新的启示。目前有多种方法用于筛选肿瘤干细胞，例如单一细胞表面分子筛选，2种或多种细胞表面分子筛选等^[17-20]。此次实验利用CD133和CD44这2个细胞表面分子作为筛选分子来筛选CD133⁺CD44⁺口腔鳞癌干细胞，Western blot实验检测显示，与CD133^-CD44^-口腔鳞癌细胞比较，CD133⁺CD44⁺口腔鳞癌细胞内干性相关因子SOX2、NANOG、OCT4均呈现高表达，提示CD133⁺CD44⁺双阳性细胞为口腔鳞癌干细胞。

肿瘤干细胞的靶向治疗是对肿瘤特异性的分子靶点进行选择性地抑制或杀灭作用，而不损伤正常细胞。因此，以肿瘤干细胞为靶标，运用生物工程手段寻找靶点成为肿瘤干细胞靶向治疗的新趋势。靶向作用于肿瘤干细胞的微环境通过调节肿瘤干细胞微环境可调控肿瘤干细胞的更新和增殖分化能力，改变干细胞对放化疗的敏感度。TACC3是参与中心体结构与功能调控的一类蛋白，其可通过调控微管蛋白质的组成，进而影响细胞的有丝分裂及染色体稳定性^[21]。曾亚等^[22]研究显示TACC3蛋白参与胃癌细胞的发生与发展，可作为胃癌恶性程度及预后的评价指标。侯婧等^[23]研究显示，乳腺癌组织中的TACC3 mRNA和蛋白表达水平高于癌旁组织，且TACC3 表达与乳腺癌的分化程度、肿瘤直径、淋巴结转移、P53表达相关，而与患者年龄、是否绝经、雌激素受体、孕激素受体、Ki-67、人表皮生长因子受体HER-2等无明显相关，其在乳腺癌发生发展过程中可能具有一定的作用。研究表明，TACC3可共同作用于细胞周期调节蛋白、P53、MDM2等分子，进而调节细胞周期、影响细胞凋亡^[24-29]。在一个正常细胞中，如果TACC3的水平有所改变，纺锤体的功能可能也会受损，此时依赖P53的检查点会检测出未进行有丝分裂，从而在下一个细胞周期触发细胞凋亡通路。有研究表明，TACC3的过度表达可能与耐药机制、肿瘤进展、细胞增殖和转移有关^[29]。

实验设计及合成TACC3的shRNA序列，Lipofectamine^TM2000转染CD133⁺CD44⁺口腔鳞癌干细胞，研究TACC3基因沉默对口腔鳞癌干细胞增殖、凋亡的影响。实验结果显示，shRNA干扰抑制TACC3表达能够抑制口腔鳞癌干细胞的增殖。另外，细胞凋亡检测结果显示，shRNA干扰抑制TACC3表达可显著诱导口腔鳞癌干细胞的凋亡。shRNA干扰抑制TACC3表达还可显著抑制Ki67蛋白表达，提高Bax蛋白表达，降低Bcl-2蛋白表达，这些蛋白表达的变化进一步验证了shRNA干扰抑制TACC3表达对口腔鳞癌干细胞增殖和凋亡的影响。口腔鳞癌干细胞在口腔鳞癌组织中的数量较少，但大量研究发现其在肿瘤发生、发展、复发、转移及抗药性中起着关键作用^[15]。

相比于现报道实验依据，此次实验初步发现TACC3基因表达对CD133⁺CD44⁺口腔鳞癌干细胞增殖、凋亡的影响。一方面，为目前口腔癌的干预提供相应的理论依据与支持，探索可用于靶向治疗的药物靶标，以更好地实现个体化治疗；另一方面，将此研究结果扩展至机体其他部位、其他类型肿瘤中，探索TACC3表达对肿瘤细胞的影响是否具有普遍性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

特异性干扰TACC3基因表达对CD133⁺CD44⁺口腔鳞癌干细胞增殖及凋亡的影响

Effects of specific interfering TACC3 gene expression on proliferation and apoptosis of CD133⁺CD44⁺ oral squamous cell carcinoma cells

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[1]	王景, 熊山, 曹金, 冯林伟, 王信. 白细胞介素3在骨代谢中的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1260-1265.
[2]	肖豪, 刘静, 周君. 脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1266-1271.
[3]	田川, 朱向情, 杨再玲, 鄢东海, 李晔, 王严影, 杨育坤, 何洁, 吕冠柯, 蔡学敏, 舒丽萍, 何志旭, 潘兴华. 骨髓间充质干细胞调控猕猴卵巢的衰老[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 985-991.
[4]	胡伟, 谢兴奇, 屠冠军. 骨髓间充质干细胞来源外泌体改善脊髓损伤后血脊髓屏障的完整性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 992-998.
[5]	惠小珊, 白京, 周思远, 王阶, 张金生, 何庆勇, 孟培培. 中医药调控干细胞诱导分化的理论机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1125-1129.
[6]	安维政, 何萧, 任帅, 刘建宇. 肌源干细胞在周围神经再生中的潜力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1130-1136.
[7]	范一鸣, 刘方煜, 张洪宇, 李帅, 王岩松. 脊髓损伤后室管膜区内源性神经干细胞反应的系列问题[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1137-1142.
[8]	侯婧瑛, 郭天柱, 于萌蕾, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理通过激活MALAT1靶向抑制miR-195促进骨髓间充质干细胞的生存和血管形成[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1005-1011.
[9]	周颖, 张幻, 廖松, 胡凡琦, 易静, 刘玉斌, 靳继德. 去铁胺联合干扰素γ预处理对人牙髓干细胞的免疫调节作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1012-1019.
[10]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
[11]	王继芳, 鲍祯, 乔亚红. miR-206调控小细胞肺癌干细胞EVI1基因表达及细胞生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1027-1031.
[12]	刘峰, 彭宇环, 罗良平, 吴本清. 植物源性碱性成纤维细胞生长因子维持人胚胎干细胞的生长与分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1032-1037.
[13]	闻丹丹, 李强, 沈才齐, 纪哲, 金培生. 外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架提高脂肪间充质干细胞活性修复糖尿病创面[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1038-1044.
[14]	朱兵兵, 邓江华, 陈晶晶, 慕晓玲. 白细胞介素8受体可提高脐带间充质干细胞迁移和向损伤内皮的黏附[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1045-1050.
[15]	罗小玲, 张丽, 杨茂桦, 徐洁, 徐晓梅. 柚皮素干预人牙周膜干细胞的成骨分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1051-1056.

特异性干扰TACC3基因表达对CD133+CD44+口腔鳞癌干细胞增殖及凋亡的影响

Effects of specific interfering TACC3 gene expression on proliferation and apoptosis of CD133+CD44+ oral squamous cell carcinoma cells

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Effects of specific interfering TACC3 gene expression on proliferation and apoptosis of CD133⁺CD44⁺ oral squamous cell carcinoma cells