乳鼠心肌细胞可成片生长的分离和培养方法

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.24.018

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (24): 3875-3880.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.24.018

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

乳鼠心肌细胞可成片生长的分离和培养方法

黄绍代^1，2，3，陈鹏⁴，吴超²，胡丹²，彭江³，田建伟^1，2

¹安徽医科大学，安徽省合肥市 230032；²解放军空军总医院，北京市 100142；³解放军总医院全军骨科研究所，北京市 100853；⁴中国医科大学第一附属医院，辽宁省沈阳市 110001

修回日期:2017-03-17 出版日期:2017-08-28 发布日期:2017-08-30
通讯作者: 田建伟，博士，教授，硕士生导师，副主任医师，安徽医科大学空军临床学院心血管内科，北京市 100142
作者简介:黄绍代，男，1991年生，江西省赣州市人，汉族，安徽医科大学在读硕士，主要从事心脏组织工程方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81070209)

Isolation and culture of neonatal rat cardiomyocytes growing in sheets

Huang Shao-dai^{1, 2, 3}, Chen Peng⁴, Wu Chao², Hu Dan², Peng Jiang³, Tian Jian-wei^{1, 2}

¹Anhui Medical University, Hefei 230032, Anhui Province, China;²Air Force General Hospital of PLA, Beijing 100142, China; ³Key Laboratory of PLA, Institute of Orthopedics, General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100853, China; ⁴the Affiliated First Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China

Revised:2017-03-17 Online:2017-08-28 Published:2017-08-30
Contact: Tian Jian-wei, M.D., Professor, Master’s supervisor, Associate chief physician, Anhui Medical University, Hefei 230032, Anhui Province, China; Air Force General Hospital of PLA, Beijing 100142, China
About author:Huang Shao-dai, Studying for master’s degree, Anhui Medical University, Hefei 230032, Anhui Province, China; Air Force General Hospital of PLA, Beijing 100142, China; Key Laboratory of PLA, Institute of Orthopedics, General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100853, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81070209

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
可成片生长的心肌细胞：文章在传统的心肌细胞培养方法基础上，培养出可连接成片状生长的心肌细胞，成片生长的心肌细胞可实现同步搏动，避免了单个心肌细胞搏动的不协调性，为心脏组织工程的研究提供更优质的种子细胞，更有利于心肌梗死后心脏的修复和再生。
二次差速贴壁分离法：为获得高纯度、活力好的心肌细胞，需将细胞悬液中的大量的成纤维细胞去除，因为成纤维细胞等分裂增殖能力较强的细胞会逐渐占据优势，并抑制心肌细胞的生长。随着差速贴壁的次数增加，时间的延长，细胞纯度也随之增加，其中，差速贴壁两次心肌细胞纯度提高最为显著且对细胞活性影响不大。

摘要
背景：传统方法培养的心肌细胞活力、纯度仍不高，细胞多呈簇状生长，细胞与细胞之间的联系较少，细胞多呈单个搏动。
目的：改进传统的乳鼠心肌细胞培养方法，获得纯度高、成片生长的心肌细胞。
方法：运用0.1%胰蛋白酶4 ℃过夜消化心肌组织后加入Ⅱ型胶原酶重复消化，二次差速贴壁分离法联合化学抑制剂纯化心肌细胞。倒置相差显微镜下动态观察心肌细胞形态变化，培养48 h后用抗心肌肌钙蛋白T抗体鉴定心肌细胞纯度，连续10 d隔日记录心肌细胞的搏动频率。
结果与结论：①心肌细胞在24 h内贴壁，72 h后成簇状分布，5-7 d细胞连接成片生长；②细胞存活率为96%，免疫荧光鉴定心肌细胞纯度97%以上，连续10 d内心肌细胞搏动频率差异无显著性意义(P > 0.05)；③综上，通过这种改进的培养方式获得成片生长的心肌细胞纯度、活力更高，是一种更为有效的乳鼠心肌细胞培养方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-3988-4355(黄绍代)

关键词: 组织构建, 组织工程, 乳鼠, 心肌细胞, 原代培养, 成片生长, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The cardiomyocytes obtained by traditional culture methods exhibit poor purity and viability, cells grow in clusters, the connection between cells is less, and most of cells beat separately.
OBJECTIVE: To obtain high-purity cardiomyocytes presenting with a sheet-like growth by modified culture method.
METHODS: Myocardial tissues were digested using 0.1% trypsin at 4 ℃ overnight, and then digested repeatedly through the addition of type II collagenase, and finally were isolated and purified by differential adhesion method combined with chemical inhibitors. The morphology of cardiomyocytes was observed under inverted phase contrast microscope. The purity of cardiomyocytes was identified by cardic troponin T antibody after cultured for 48 hours. The beating frequency of cardiomyocytes was recorded every two days for 10 consecutive days.
RESULTS AND CONCLUSION: The cardiomyocytes adhered within 24 hours of culture, distributed in clusters at 72 hours and grew in sheets at 5-7 days of culture. The survival rate of cardiomyocytes was 96% and the purity identified by immunofluorescence was over 97%. There was no significant difference in the beating frequency at different time. These results suggest that the high-purity and high-viability cardiomyocytes are obtained by the modified culture method, which is an effective method for culturing neonatal cardiomyocytes.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Mice, Myocytes, Cardiac, Cells, Cultured, Survival Rate, Hydrocortisone, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

黄绍代，陈鹏，吴超，胡丹，彭江，田建伟. 乳鼠心肌细胞可成片生长的分离和培养方法[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(24): 3875-3880.

Huang Shao-dai, Chen Peng, Wu Chao, Hu Dan, Peng Jiang, Tian Jian-wei. Isolation and culture of neonatal rat cardiomyocytes growing in sheets[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(24): 3875-3880.

图/表（结果） 1

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引言

材料方法

1.1 设计 观察性实验。

1.2 时间及地点 于2016年4至10月在解放军总医院骨科研究所完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 出生24 h的新生乳鼠12只，雌雄不限，由解放军军事医学科学院实验动物中心提供。

1.3.2 实验试剂和设备 高糖DMEM(Cellgro公司，美国)；双抗(青霉素链霉素，Cellgro公司，美国)；胎牛血清(Cellgro公司，美国)；谷氨酰胺(Cellgro公司，美国)；胰蛋白酶(Sigma公司，美国)；Ⅱ型胶原酶(Sigma公司，美国)；溴脱氧尿嘧啶(BrdU，Sigma，美国)；氢化可的松注射液(金耀氨基酸有限公司，中国)；PBS、D-hanks液自行配制；恒温培养箱(Heal Force)；抗心肌肌钙蛋白T抗体(ab8295，Abcam公司，英国)；Dylight594标记羊抗鼠IgG抗体(二抗，Abcam公司，英国)；EVOS FL全自动荧光智能成像系统(Thermo Fisher公司，美国)；IX70倒置相差显微镜(OLYMPUS)；YT-CJ-2NB超净工作台(北京亚泰公司)；低速台式离心机(北京白洋公司)。

1.3.3 溶液的配制 配制含体积分数10%胎牛血清、1%双抗、1%谷氨酰胺的高糖DMEM，用0.25%的胰蛋白酶10 mL和PBS 15 mL配制0.1%的胰蛋白酶。

1.4 方法

1.4.1 心肌细胞的分离和消化 取出生24 h内的乳鼠12只，雌雄不限，浸泡于体积分数75%的乙醇中5 min，移入超净工作台，乙醚麻醉，固定乳鼠四肢，眼科剪沿胸骨左缘剪开胸廓，小心剪取12只乳鼠的心脏，转移至D-hanks溶液中清洗一至两遍，去除血细胞，用眼科剪去心脏的1/3-1/2，留取心尖部的心室组织，D-hanks液清洗两三遍，将洗净的心室组织转移至青霉素小瓶中，用眼科剪剪成1-3 mm³，加入0.1%的胰蛋白酶，置于摇床上4 ℃冰箱震荡过夜。第2天加入培养液终止消化，吸管吹打10 min，吸弃上清液，再加入Ⅱ型胶原酶置37 ℃水浴箱震荡8 min，吸取上清液于离心管中，加入与上清液等体积的培养液，重复此步骤四至五次，将收集的上清液以1 200 r/min离心5 min，弃上清液，用配制好的高糖DMEM培养液制成单细胞悬液，接种于75 mm²的培养皿中，放置于37 ℃体积分数5%CO₂的恒温培养箱中进行培养。

1.4.2 心肌细胞的培养和纯化 恒温培养箱中培养50 min后，用滴管将尚未贴壁的细胞吸出，再接种于75 mm²培养皿继续培养30 min，用滴管将细胞悬液吸出，调整细胞浓度为(4.0-5.0)×10⁸ L^-1，接种于六孔培养板中，加入100 mg/L的氢化可的松，补充新鲜的含胎牛血清和BrdU的DMEM至2mL左右，放入37 ℃ 体积分数5%CO₂恒温培养箱中培养，之后每隔48 h进行换液。

1.4.3 心肌细胞搏动频率及存活率 心肌细胞培养48 h后，倒置相差显微镜下观察心肌细胞形态及搏动频率。差速贴壁分离后取500 μL细胞悬液加入500 μL 0.4%锥虫蓝染液，染色两至三分钟，将少许悬液涂于载玻片上，加上盖平，光学显微镜下任意取几个视野分别统计染色细胞和未被染色细胞数(活细胞不被染色，死细胞染成蓝色)，细胞存活率(%)=(总细胞数-蓝色细胞数)/总细胞数。

1.4.4 心肌细胞的鉴定 心肌细胞在培养48 h后，取出六孔板，将培养液吸弃，用PBS洗3遍，40 g/L多聚甲醛固定20 min，吸走固定液，用PBS洗3遍，再用0.1%TritonX透化5 min，吸弃TritonX，PBS洗3遍，加入一抗4 ℃冰箱过夜，第2天吸走一抗，PBS洗3遍，加入二抗，室温孵育2 h，吸走染液，PBS洗3遍，加入染核试剂(DAPI)染色5 min，吸走染液，PBS洗3遍，EVOS FL 全自动荧光智能成像系统下观察拍照。

1.5 主要观察指标 培养24，48，72，96 h后用倒置相差显微镜观察心肌细胞形态以及心肌细胞博动频率的变化。

1.6 统计学分析 采用SPSS.17.0统计软件进行数据处理，计量资料以x(_)±s表示，2组以上均数间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

新生乳鼠的心肌细胞被认为是研究和治疗心脏相关疾病的稳定而有效的研究对象，具有简便、直观、重复性好等优点^[8]，一直成为实验中的研究热点。虽然体外培养的心肌细胞无法完全替代体内心肌细胞，但目前采用体外培养的心肌细胞已经是心血管疾病研究的基本要素之一^[9]。如在研究离体心脏的生理反应特性、信号转导、基因表达以及观察细胞的形态与结构等，通常需要在体外培养高活力、高纯度的心肌细胞进行直接研究^[10-12]。所以体外培养的心肌细胞可以为体内研究建立一个有效稳定的模型。

此外，体外培养的心肌细胞还可用于再生医学的研究。在心脏组织工程中，支架材料、生长因子和种子细胞是三大基本要素，而种子细胞又是心脏组织工程的基本要素^[13-14]。细胞主要来源于干细胞、自体细胞等，为了避免机体的免疫排斥反应，自体细胞显得尤为重要。急性心肌梗死目前是危害全球人类健康的主要疾病之一，至少占有报告死亡人数的20%，当供给心肌细胞血氧的冠脉发生堵塞时，会发生急性心肌梗死，如果长时间的缺血缺氧，最终导致心肌细胞的坏死^[15]。正常成年人的左心室有(30-40)亿个心肌细胞，一次心肌梗死最高可导致10亿个心室肌细胞的缺血坏死。此外，高血压、心脏瓣膜病所引起的心脏超负荷也在逐年缓慢的损伤心肌细胞^[16]。而心肌梗死后心力衰竭的根本原因在于有舒缩功能的心肌细胞大量丧失^[17]。尽管目前的再灌注疗法是治疗心肌梗死的最有效方法，但再灌注治疗无法从根本上增加心肌细胞的数量，实现心肌细胞的再生^[18]。心脏组织工程技术为心肌细胞的再生治疗提供了一个新的治疗平台，其基本理念为通过细胞复合于可降解的生物材料上植入心肌梗死区促进心肌细胞的再生，这就需要活力好、纯度高并能同步搏动的心肌细胞^[19]。本文在以往心肌细胞培养方法的基础上，优化了分离和培养新生小鼠心肌细胞的基本步骤，培养出活力好、纯度高、可成片生长的心肌细胞，为后续的心肌再生研究提供了一个新的、重复性好心肌细胞培养方案。

与传统培养方法相比，本实验中作者留取心脏近心尖端的1/2-2/3部分，将心肌组织剪碎成1-3 mm³，不同于过去的单用胰酶多次消化和胶原酶与胰蛋白酶联合运用消化心肌组织^[20-21]，实验中先加入0.1%的胰蛋白酶置于摇床上4 ℃冰箱过夜，第2天再加入Ⅱ型胶原酶恒温震荡消化^[22-23]。此种消化方式利用胰蛋白酶在4 ℃冰箱过夜可消化组织间质的蛋白质，使组织变得松散，又可避免对细胞的损害，之后利用胶原酶进一步消化^[24]。制成细胞悬液后，对心肌细胞的死活进行染色，仍有少部分的死细胞，这是组织剪碎、胰酶和胶原酶消化过程中不可避免的损伤^[25]。总体来说，这种消化方式可成功从组织中获得心肌细胞，并且保证心肌细胞的活力，不丧失心肌细胞的结构和功能，可用于后续的体外研究。

正常人的心脏组织是由心肌细胞与非心肌细胞构成，其中心肌细胞占25%，成纤维细胞和红细胞占75%^[26]。非心肌细胞比心肌细胞更易贴壁和增殖，随着培养时间的延长，会逐渐占据优势，最终对心肌细胞产生密度抑制，所以必须抑制非心肌细胞的生长^[27]。过去的实验中常采用差速贴壁分离法进行心肌细胞的提纯^[20]，为获得更高纯度、活力好的心肌细胞，需除去细胞悬液中大部分的成纤维细胞，而随着差速贴壁的次数增加，时间的延长，细胞纯度也随之增加，一次的差速贴壁分离法难以达到良好提纯效果，差速贴壁两次心肌细胞纯度提高最为显著且对细胞活性影响不大，本文实验中采取二次差速贴壁分离法，多次实验发现培养50 min和30 min的二次差速贴壁方法获得的心肌细胞纯度可达最高。但是单纯的二次差速贴壁分离法仍不能完全去除成纤维细胞，若需要长期维持心肌细胞的纯度，需要联合使用化学抑制剂。本实验中使用氢化可的松联合BrdU抑制成纤维细胞的增殖，有研究表明，低剂量的氢化可的松对成纤维细胞的增殖有抑制作用^[28]，还可以通过诱导环氧化酶2的表达对心肌细胞产生保护作用^[29-30]。另外BrdU可干扰成纤维细胞的有丝分裂，抑制成纤维细胞的生长增殖^[31]，对于需要长时间培养的心肌细胞，可加入0.1 mmol/L BrdU，这种联合提纯的方法可有效提纯心肌细胞。此外，作者还尝试使用无血清培养基进行心肌细胞的提纯，发现无血清培养基在抑制成纤维细胞增殖的同时，会使心肌细胞生长不佳且搏动能力下降，所以不推荐使用无血清培养基纯化心肌细胞。最后，小鼠年龄的选择、培养细胞的接种密度、操作过程的严格无菌要求、培养过程中定期换液也是成功培养出纯度高、成片生长心肌细胞的关键。

随后对心肌细胞的搏动频率进行记录，发现培养两至三天后心肌细胞开始同步搏动，频率多在45-60次/min，培养5-7 d后细胞相互连接成片生长，并呈同步性搏动。连续10 d观察心肌细胞的搏动频率，发现也并无差异，但这结果却与老鼠的正常心跳次数相差甚远。这是由于实验中只留取心脏近心尖端的1/2-2/3部分的心肌组织(心室肌)，这部分心肌组织是以心室细胞的自律性进行搏动，并不是心肌细胞的活力不好所致。由于心脏组织中包含有75%的非心肌细胞，其中以成纤维细胞为主。经过二次差速贴壁分离和化学抑制作用，仍有部分非心肌细胞的存在，实验中需要对心肌细胞进行鉴定。目前，抗心肌肌钙蛋白T抗体免疫荧光染色是常用的心肌细胞标记物^[32]，实验结果显示，此次培养所得的心肌细胞在免疫荧光显微镜下观察呈蓝色荧光，与之前研究结果一致^[7^，^33]，表明所培养的细胞为心肌细胞。

研究中还有很多不足之处，实验室的仪器设备条件有限使得观察指标不是很全面，导致实验结果有一定的局限性。实验中初次使用氢化可的松联合BrdU抑制成纤维细胞的增殖，对于二者药物的相互作用以及浓度和剂量的控制仍需进一步研究探索。

综上所述，体外培养的乳鼠心肌细胞模型是研究心肌细胞生化通路和特性是一个很好的方法^[34]，二维细胞培养由于细胞生长在体外改变的环境下，长期体外培养将逐渐丧失原有的功能活性，所以在多数情况下，获得的研究结果会与体内情况不符合。通过这种二维原代培养出的心肌细胞再生能力较弱，可能与心肌细胞体外培养微环境的变化有关^[35]。随着细胞生物学和生物材料研究的进步，不断引入新的材料和方法，为体外构建三维细胞培养组织结构创造了可能，三维细胞培养利用具有三维结构的材料载体，在体外最大限度的模拟细胞在体内的生长环境，为细胞提供生长、分化的三维微环境，构建与体内相似的组织结构^[36]，这种3D组织有着巨大的优势，增加了药物研发的效率、减少了对动物模型的使用。若能利用三维细胞培养技术模拟人体内心肌细胞的生长环境，建立细胞与细胞以及细胞与细胞外基质的联系，更大程度的保证心肌细胞具有与体内相似的生长环境，细胞能保留更多的结构与功能，最终构建出与体内相似的心肌组织^[37-38]。三维细胞培养技术将为心肌细胞培养提供了新的研究思路，为心肌再生的研究提供新的方法，这一领域在未来几年有着巨大的潜在研究价值，也是研究的下一步方向。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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